秦 艷，李亞娟，王清蘭

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院（上海 201203）；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院（上海 201203）

肝纖維化是肝臟對(duì)多種慢性損傷的一種修復(fù)愈合反應(yīng)，以肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過(guò)度增生與異常沉積為特征，是多種慢性肝病的重要病理特點(diǎn)，也是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)過(guò)程。肝硬化是肝纖維化的末期，進(jìn)而可能發(fā)展為肝癌。據(jù)估計(jì)，肝纖維化影響全球人口的1%至2%，并導(dǎo)致全世界每年超過(guò)100 萬(wàn)人死亡［1-3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)除針對(duì)某些病因的治療外，目前尚缺乏理想的生物或化學(xué)臨床治療藥物。中醫(yī)藥在肝纖維化的治療上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

黃芪湯始載于《太平惠民和劑局方》，黃芪與甘草劑量比例為6∶1，故又名黃芪六一湯。方中黃芪甘溫，大補(bǔ)肺脾之氣，固表止汗，托毒生肌，補(bǔ)氣以生血，補(bǔ)氣以生津液，為君藥。炙甘草補(bǔ)脾益氣和中，助黃芪益氣補(bǔ)虛之力，為臣佐藥。兩藥配伍，甘以守中，補(bǔ)中益氣之力增，氣血津液化生有源，則氣弱血虛所致諸癥自愈，是經(jīng)典補(bǔ)氣藥方之一［4］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪湯對(duì)四氯化碳（CCl4）、膽管結(jié)扎（BDL）及二甲基亞硝胺（DMN）［5］等不同因素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肝纖維化模型均具有良好的預(yù)防及治療作用［6-7］，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從整體角度研究藥物的作用機(jī)制，適合于分析中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步發(fā)現(xiàn)黃芪湯抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路分析，獲得黃芪湯成分調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路，并構(gòu)建“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖。肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化的主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，本研究進(jìn)一步采用人肝星狀細(xì)胞系人肝星狀細(xì)胞LX-2（簡(jiǎn)稱(chēng)“LX-2細(xì)胞”），基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)一步采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黃芪湯抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 LX-2 細(xì)胞株，由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所徐列明教授贈(zèng)送。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪湯（黃芪、甘草）由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心（國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室）制成粗粉末，水煎，濃縮煎出液制成流浸膏后真空干燥，-20 ℃冷藏保存。生藥總質(zhì)量為8.0 kg，煎煮濃縮后為1.115 kg，真空干燥后質(zhì)量為1.52 kg，每克含生藥5.263 g。

含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基（DMEM），美國(guó)HyClone 公司（批號(hào)：AE29040273）；互補(bǔ)脫氧核糖核酸合成試劑盒（iScriptTM cDNA Synthesis Kit）、熒光染料定量 PCR 試劑（iTaqTM Universal SYBR?Green Supermix），美國(guó)Bio-Rad 公司（批號(hào)分別為1708891、1725122）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、兔單克隆抗體、蛋白激酶B（Akt）1/2/3 兔單克隆抗體，碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為AF0006、AF1186、AF1789）；抗Akt 磷酸化T308（phospho T308）抗體，美國(guó)Abcam 公司（批號(hào)：ab38449）；抗磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抗體、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體、I型膠原蛋白（Col-I）抗體，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司（批號(hào)分別為4255S、19245S、72026S）。

1.1.3 儀器 脫色搖床，其林貝爾儀器制造有限公司（型號(hào)：TS8）；制冰機(jī)，日本Sanyo 株式會(huì)社（型號(hào)：SIMF140AY65）；恒溫微孔板快速振蕩器，其林貝爾儀器制造有限公司（型號(hào)：QB-9006）；恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司（型號(hào)：S23-2）；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司（型號(hào)：AL204）；PCR 擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra 公司（型號(hào)：Thermocycler）；低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf 公司（型號(hào)：5425）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR，美國(guó)ABI 公司（型號(hào)：7500Fast）；酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司（型號(hào)：Spectramax 190）；超凈臺(tái)，美國(guó)Labconco 公司（型號(hào)：3612524）；蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)/核酸蛋白測(cè)定儀，美國(guó)Bio-Rad 公司（型號(hào)：turbo1704150）；化學(xué)發(fā)光顯影儀，上海天能科技有限公司（型號(hào)：Tanon5200）。

1.2 黃芪湯抗肝纖維化網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子分析結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究思路 本研究首先通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、化源網(wǎng)（Chemsrc）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.chemsrc.com/）以及檢索文獻(xiàn)獲得所有的黃芪湯的活性成分。通過(guò)TCMSP、化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)（Swisstarget prediction）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch）、藥物銀行（DrugBank）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca）獲得化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，即藥物靶點(diǎn)；再通過(guò)全基因（Gencards）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）、在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.omim.org）等獲取肝纖維化的主要靶點(diǎn)，即疾病靶點(diǎn)。取上述交集獲得黃芪湯抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)；利用富集分析（Metascape）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape.org/gp/index.html）進(jìn)行KEGG 通路富集分析，獲得黃芪湯抗肝纖維化關(guān)鍵信號(hào)通路；最后采用LX-2 細(xì)胞驗(yàn)證黃芪湯對(duì)上述關(guān)鍵信號(hào)通路的影響，闡述黃芪湯抗肝纖維化的部分作用機(jī)制。本研究思路見(jiàn)圖1。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討黃芪湯抗肝纖維化作用機(jī)制研究思路圖

1.3 黃芪湯抗肝纖維化網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子分析

1.3.1 黃芪湯化學(xué)成分及有效靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)

TCMSP、Chemsrc 確定黃芪、甘草的化學(xué)成分，根據(jù)口服利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18 兩個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)（ADME）屬性值進(jìn)行活性成分初步篩選以獲得活性化合物及其作用靶點(diǎn)，再根據(jù)Swisstarget prediction、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)和已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息統(tǒng)一在通用蛋白質(zhì)（Uniprot）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.3.2 肝纖維化相關(guān)疾病靶點(diǎn)篩選 以“hepatic fibrosis”“l(fā)iver fibrosis”為關(guān)鍵詞，采用Gencards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.omim.org）挖掘影響肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出評(píng)分（Score）值相對(duì)較高的靶點(diǎn)，其分值越高表示與疾病的聯(lián)系越密切。根據(jù)一般方法經(jīng)驗(yàn)篩選Score 大于兩倍中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為肝纖維化的潛在靶點(diǎn)，在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中所得肝纖維化靶點(diǎn)Score 最大值為129.16，最小值為0.12，兩倍中位數(shù)為8.4，故設(shè)定Score＞8.4 的靶點(diǎn)為肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。最后合并4 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的靶點(diǎn)作為肝纖維化的疾病靶點(diǎn)。

1.3.3 黃芪湯抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)的篩選 利用韋恩圖（http：//www.bioinformatics.com.cn）獲得藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集，即為黃芪湯抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。

1.3.4 生物學(xué)功能與通路的富集分析 Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape.org/gp/index.html）是一個(gè)具有較為全面的注釋功能和定時(shí)更新基因注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)。將黃芪湯抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)輸入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，選擇“人”（Homo sapiens，Human），設(shè)置P＜0.01，最小計(jì)數(shù)為3和富集因子＞1.5（富集因子是觀察到的計(jì)數(shù)與偶然預(yù)期的計(jì)數(shù)之間的比率）來(lái)進(jìn)行KEGG富集分析，保存數(shù)據(jù)結(jié)果并采用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，得到黃芪湯抗肝纖維化靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。

1.3.5 黃芪湯抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape 3.8.1 軟件，根據(jù)篩選出來(lái)的黃芪湯抑制肝纖維化潛在靶點(diǎn)和KEGG 分析結(jié)果，構(gòu)建肝纖維化靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 黃芪湯對(duì)LX-2細(xì)胞活化及關(guān)鍵信號(hào)通路的影響

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) LX-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至亞單層后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組與干預(yù) LX-2 細(xì)胞，設(shè)置正常對(duì)照組（control）、黃芪湯低劑量組（25 mg/L）、黃芪湯高劑量組（50 mg/L），給藥后培養(yǎng)24 h，按檢測(cè)指標(biāo)要求收集細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 Western blot 法檢測(cè)α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)情況 每個(gè)培養(yǎng)皿用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗兩遍后，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液150 μL ，按照二喹啉甲酸（BCA）法檢測(cè)總蛋白含量。取20 μg 總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移，室溫封閉（5%脫脂奶粉，1 h）后，分別與特異性一抗孵育，洗滌，再孵育相應(yīng)二抗（搖床室溫1 h），洗滌后增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）化學(xué)發(fā)光，膠片曝光，圖像分析儀通過(guò)光密度測(cè)定法定量測(cè)量。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-q PCR）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況 采用RT-qPCR 法檢測(cè)LX-2 細(xì)胞纖維化相關(guān)mRNA 的表達(dá)，分別為α 平滑肌肌動(dòng)蛋白基因（α-SMA），Ⅰ型膠原蛋白基因（Col-Ⅰ），磷脂酰肌醇-3-激酶基因（PI3K）。用TRIzol試劑提取總RNA，測(cè)定其濃度。逆轉(zhuǎn)錄為10 μL 體系，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)操作，輕柔混勻后按照條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：25 ℃、5 min；46 ℃、20 min；95 ℃、1 min；4 ℃保存，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｒ镉缮ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰竞铣?。本?shí)驗(yàn)中所用引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為10 μL 體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；PCR 反應(yīng)，95 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)，50 ℃、60 s，40個(gè)循環(huán)。以18s作為內(nèi)參，所有反應(yīng)體系均為2個(gè)復(fù)孔。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.02軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用one-way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Tukey's multiple comparisons test 進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪湯中化學(xué)成分的篩選 黃芪湯由黃芪、甘草組成，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到黃芪成分87 個(gè)，甘草成分280個(gè)，共367個(gè)成分。設(shè)定篩選參數(shù)為OB≥30%、DL≥0.18，獲取黃芪成分20個(gè)、甘草成分92個(gè)，共112個(gè)有效成分。根據(jù)文獻(xiàn)以及靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)，最終篩選出21 個(gè)黃芪有效成分、92 個(gè)甘草有效成分，共同成分3 個(gè)。見(jiàn)表2。

表2 黃芪湯主要化學(xué)成分

2.2 黃芪湯抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)的篩選 首先通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)黃芪湯中化合物的靶點(diǎn)，Swisstarget prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)再篩選做補(bǔ)充，最后為了標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，統(tǒng)一在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）中將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。黃芪成分中篩選出253 個(gè)靶點(diǎn)，甘草成分中篩選出226 個(gè)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值，共得到282個(gè)靶點(diǎn)。

通過(guò)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)一般經(jīng)驗(yàn)篩選獲得肝纖維化靶點(diǎn)1 643 個(gè)。結(jié)合OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值，最終得到1 689 個(gè)與肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。

將上述化合物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)通過(guò)微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）取交集，繪制出韋恩（VENN）圖［8］，共篩選出153 個(gè)黃芪湯成分抗肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪湯和肝纖維化靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 黃芪湯成分-疾病靶點(diǎn)交集信號(hào)通路分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)黃芪湯抑制肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，借助Origin Lab 2018 對(duì)結(jié)果可視化。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)與癌癥途徑、乙型肝炎、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）-糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖白介素-17（IL-17）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3KAkt）信號(hào)通路、5'-單磷酸腺苷依賴(lài)的蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路、分泌型糖蛋白Wnt 信號(hào)通路等密切相關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖3 黃芪湯成分-疾病靶點(diǎn)京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）分析圖

2.4 黃芪湯抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape 3.8.1 構(gòu)建黃芪湯抗肝纖維化靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，得到黃芪和甘草成分與肝纖維化交集靶點(diǎn)以及核心通路網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖4。

圖4 黃芪湯抗肝纖維化核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 黃芪湯對(duì)LX-2 細(xì)胞活化的影響 體外研究黃芪湯對(duì)LX-2 細(xì)胞活化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，黃芪湯高、低劑量組均可顯著下調(diào)LX-2 細(xì)胞α-SMA、Col-Ⅰ蛋白和mRNA表達(dá)（P＜0.05），提示黃芪湯可體外抑制HSC的活化及膠原生成。見(jiàn)圖5。

圖5 黃芪湯對(duì)LX-2細(xì)胞活化的影響

2.6 黃芪湯對(duì)LX-2 細(xì)胞PI3K-Akt 信號(hào)通路的影響體外研究黃芪湯對(duì)LX-2 細(xì)胞PI3K-Akt 信號(hào)通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，黃芪湯高、低劑量組可顯著下調(diào)LX-2 細(xì)胞PI3K 蛋白及mRNA 表達(dá)，黃芪湯高、低劑量組可顯著抑制Akt 蛋白磷酸化（P＜0.05），提示黃芪湯可體外抑制PI3K/Akt信號(hào)通路。見(jiàn)圖6。

圖6 黃芪湯對(duì)LX-2細(xì)胞中PI3K/Akt通路的影響

3 討論

肝纖維化是一種病理性病變，其特征是胞外基質(zhì)（ECM）在竇周間隙中逐漸積累，是多種慢性肝病的共同病理環(huán)節(jié)［9］。如果未得到適當(dāng)及時(shí)的干預(yù)，肝纖維化可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，而肝硬化是全世界最常見(jiàn)的致死性疾病之一［10］。HSC 的活化在肝纖維化的進(jìn)展中起著核心作用，減慢肝損傷中活化HSC 的增殖是解決和治療肝纖維化的重要策略［11］。

黃芪湯由黃芪、甘草組成，現(xiàn)代藥理研究［12］發(fā)現(xiàn)其主要有效成分為黃芪皂苷、黃芪多糖等，具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)機(jī)體代謝、抗菌等作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［13-16］發(fā)現(xiàn)其可以改善二甲基亞硝胺（DMN）模型大鼠肝纖維化，改善肝組織病理，降低肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量，提高肝組織SOD 活性，進(jìn)而提高抗氧化應(yīng)激效應(yīng)。黃芪和甘草等均可以通過(guò)抑制HSC 活化、減少膠原形成［13，17］等起到抗肝纖維化的作用。黃芪湯抗肝纖維化的作用明確，但其作用機(jī)制仍不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體角度出發(fā)，通過(guò)藥物、靶點(diǎn)、疾病之間的關(guān)系分析揭示藥物的作用機(jī)制，非常適合研究中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的作用，為中藥復(fù)方的研究提供了新的思路，因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討黃芪湯抗肝纖維化的作用機(jī)制。

本研究首先基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)出黃芪湯抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)及機(jī)制，并進(jìn)一步通過(guò)KEGG 信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)黃芪湯與IL-17 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路等密切相關(guān)；而這些與癌癥途徑、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、利什曼病、鉑類(lèi)耐藥、麻疹、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、甲狀腺癌、朊病毒病、細(xì)胞色素P450 對(duì)外源物質(zhì)的代謝作用等密切相關(guān)［18-23］。其中PI3K/Akt 信號(hào)通路與肝纖維化的發(fā)展密切相關(guān)。PI3K 是與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的第二信使，由p85 調(diào)節(jié)亞基和p110 催化亞基構(gòu)成的異二聚體，具有磷脂酰肌醇激酶和絲/蘇氨酸激酶雙重活性［24］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一的Akt 是PI3K 下游的重要靶基酶。肝纖維化中TGF-β、血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子及瘦素等可通過(guò)自分泌或旁分泌的方式對(duì)PI3K/Akt 通路產(chǎn)生影響。PI3K 誘導(dǎo)的Akt 活化可促進(jìn)HSC 增殖活化［25］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析提示，黃芪湯對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用，因此本研究進(jìn)一步采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黃芪湯對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響。

LX-2細(xì)胞是一種體外自活化的肝星狀細(xì)胞。本研究以黃芪湯干預(yù)LX-2 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪湯可抑制HSC 活化標(biāo)志物α-SMA 水平，降低Col-Ⅰ的表達(dá)，提示黃芪湯可抑制LX-2 細(xì)胞活化。進(jìn)一步觀察黃芪湯對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪湯可抑制LX-2細(xì)胞PI3K 表達(dá)，下調(diào)Akt 磷酸化水平。以上結(jié)果表明抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路、抑制HSC 活化可能是黃芪湯抗肝纖維的部分作用機(jī)制。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)黃芪湯抗肝纖維化具有多成分、多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路特點(diǎn)。其中PI3K/Akt 信號(hào)通路可通過(guò)活化HSC，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黃芪湯可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制HSC 的活化，從而起到抗肝纖維化的作用，這為發(fā)掘黃芪湯潛在作用機(jī)制提供了新的研究方向。