謝燦明，江姍姍，王 瑤，向 靜，劉曉月，唐 紅，李展富，汪紅娟，陳楚淘，田浩梅

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院（湖南 長(zhǎng)沙 410208）；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)中心（安徽 合肥 230061）；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院（四川 成都 610075）；4.湖南省婦幼保健院中醫(yī)科（湖南 長(zhǎng)沙 410008）

腦卒中（cerebral apoplexy）是全球第二大死亡原因［1］，其中缺血性腦卒中占70%以上，具有極大的危害性［2］。血管復(fù)通是治療缺血性腦卒中的重要手段，但在此過(guò)程中可能會(huì)加重神經(jīng)組織損傷和肢體功能障礙，此過(guò)程被稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI），腦缺血后神經(jīng)元損傷的程度是決定預(yù)后的主要因素，尋找有效降低神經(jīng)元損傷的方法十分重要。環(huán)狀RNAs（circRNAs）是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的非編碼 RNA，其功能多樣，充當(dāng)微小RNAs（miRNAs）的“海綿”是其中之一，circRNAs 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并以海綿樣方式吸附miRNAs，阻止miRNAs 與其靶信使RNAs（mRNAs）結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，即競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制［3］。 研究［4-6］表明，circRNAs 的表達(dá)與神經(jīng)元發(fā)育以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病緊密聯(lián)系，通過(guò)高通量測(cè)序在大、小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型的腦組織中發(fā)現(xiàn)了變化的circRNAs 表達(dá)譜，并對(duì)其中差異表達(dá)的circRNAs 宿主基因和mRNAs進(jìn)行基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其涉及腦形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)元到神經(jīng)元突觸等多種生物學(xué)過(guò)程［7-9］，提示circRNAs 有望成為CIRI 治療新靶點(diǎn)。課題組前期研究［10-11］證實(shí)，針刺“大椎”“水溝”“百會(huì)”穴可通過(guò)調(diào)整多種蛋白功能與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抗神經(jīng)元損傷，從而保護(hù)缺血損傷的腦組織。既往研究發(fā)現(xiàn)針刺可能通過(guò)調(diào)節(jié)circRNAs 的表達(dá)對(duì)其他疾病產(chǎn)生影響［12-13］，因此本研究以circRNAs 為切入點(diǎn)，探討針刺對(duì)CIRI 大鼠腦組織的保護(hù)作用與差異表達(dá)核心基因、轉(zhuǎn)錄網(wǎng)中mRNAs 功能之間的聯(lián)系，進(jìn)而為針刺調(diào)控circRNAs抗CIRI后神經(jīng)損傷提供相關(guān)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠54 只，體質(zhì)量220～250 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（湘）2020-0004。動(dòng)物使用合格證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)條件為SPF 級(jí)動(dòng)物房。室溫（25±1）℃，環(huán)境濕度40%～60%，每日12 h 光照時(shí)間，不限制進(jìn)食、飲水。本實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)審查（倫理批準(zhǔn)號(hào)：LL2021081203）。

1.1.2 主要藥物與試劑 戊巴比妥鈉，德國(guó)Merck Kgaa 公司（批號(hào)：2203172）；2% 2,3,5-三苯基氯化四唑（TTC）溶液，北京雷根生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：DK0005）；多聚甲醛，北京白鯊易生物科技有限公司（批號(hào)：BL539A）；二甲苯，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：10023418）；甲苯胺藍(lán)染液，武漢塞維爾生物科技有限公司（批號(hào)：G1032）；超純總RNA 提取試劑盒，康為世紀(jì)生物科技股份有限公司（批號(hào)：CW0581S）；第三代全長(zhǎng)cDNA 一鏈合成試劑盒（去基因組）［HiScript Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）］、通用型高特異性染料法定量PCR 檢測(cè)試劑盒（AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix），南京諾唯贊生物科技股份有限公司（批號(hào)：R312-01、Q511-02）。

1.1.3 主要儀器 MCAO 栓線，北京西濃科技發(fā)展有限公司［規(guī)格：（0.32±0.02）mm］；恒溫水浴鍋，上海南陽(yáng)儀器有限公司（型號(hào)：HHS-2）；掃描儀，美國(guó)Agilent 公司（型號(hào)：G2505C）；熒光定量 PCR 儀，美國(guó)Applied biosystems 公司（型號(hào)：ABI 7500）；包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司（型號(hào)：JB-P5）；病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司（型號(hào)：RM2016）；無(wú)菌毫針，蘇州針灸用品有限公司（規(guī)格：0.25 mm×13 mm）；circRNA芯片及芯片標(biāo)記試劑盒，美國(guó)Arraystar 公司（型號(hào)：Human circRNA Array V2）。

1.2 分組與造模 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取18只大鼠定為假手術(shù)組，其余大鼠進(jìn)行造模，造模成功后的大鼠隨機(jī)分為模型組和針刺組，每組18 只。造模方法：造模前24 h 大鼠禁食，正常飲水，2%的戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔麻醉，參照從頸總動(dòng)脈插入線栓的Longa 線栓法［14］并加以改良制備大鼠右側(cè)MCAO/R模型。造模結(jié)束后將大鼠輕放于恒溫墊保溫，待大鼠麻醉完全蘇醒后，參照Longa 評(píng)分法［14］進(jìn)行評(píng)定，1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組大鼠僅用玻璃分針?lè)蛛x頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈。

1.3 干預(yù)方法 假手術(shù)組與模型組大鼠用鞋帶捆綁四肢，俯臥位固定于鼠板30 min，每12 h干預(yù)1次，共7次。針刺組在假手術(shù)組與模型組基礎(chǔ)上增加針刺操作，參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［15］和大鼠實(shí)驗(yàn)圖譜［16］針刺“大椎”“水溝”“百會(huì)”穴，均勻捻轉(zhuǎn)刺激1 min，頻率為90 次/min，15 min后行針1次，共留針30 min。

干預(yù)期結(jié)束，大鼠完成改良Garcia 評(píng)分后，予2%的戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔麻醉。全腦組織：迅速取大鼠全腦，置于-20 ℃冰箱中冷凍10 min，每組抽取5 只用作TTC 染色；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液簡(jiǎn)單沖洗全腦組織，放入裝有4%多聚甲醛的容器中固定24 h 以上，每組抽取5 只用作尼氏染色。海馬組織：將取出的全腦組織置于冰盒分離缺血側(cè)海馬組織，每組隨機(jī)抽取3 只用于基因芯片檢測(cè)，5 只用于實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.4.1 神經(jīng)功能損傷情況 采用改良Garcia 評(píng)分法［17］在首次針刺前和末次針刺后評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)功能與感覺功能，各項(xiàng)總計(jì)18 分，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重則得分越低。

1.4.2 TTC 染色法檢測(cè)大鼠腦梗死面積 將冷凍的全腦組織置于冰上，去除后側(cè)的小腦和低位腦干、前側(cè)的嗅球，將腦組織按冠狀位平均切成5 個(gè)腦片，每片厚薄均勻，約2 mm，放入玻璃燒杯，再倒入2% TTC 溶液，放入37 ℃水浴箱中，共染10 min，中途翻一次面，染色過(guò)程中全程避光；在染色結(jié)束后，倒入4%多聚甲醛固定，1 d 后用相機(jī)拍照。將圖片導(dǎo)入ImageJ 軟件進(jìn)行腦梗死面積的測(cè)量，導(dǎo)出數(shù)據(jù)后利用Swanson公式［18］計(jì)算腦梗死面積百分比。

1.4.3 基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)基因中的核心circRNAs 及GO 功能富集分析 測(cè)定RNA 樣品的濃度和純度后，利用核糖核酸酶R 去除各樣品線性RNA 并富集circRNAs，將其擴(kuò)增并轉(zhuǎn)錄為熒光cRNA后進(jìn)行純化，標(biāo)記的cRNA 被雜交到Arraystar 大鼠circRNA 陣列，將裝有雜交液的玻片裝配到circRNA 表達(dá)芯片玻片，經(jīng)過(guò)孵育、清洗與固定后，使用安捷倫提取軟件G2505C 進(jìn)行掃描，利用R 軟件limma 包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以差異倍數(shù)（FC）＞1.25，P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)整理出模型組/假手術(shù)組、針刺組/模型組共同差異表達(dá)的circRNAs（co-DE circRNAs），再根據(jù)P值、FC、GO 條目富集數(shù)量篩選出高表達(dá)的核心co-DE circRNAs，根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.geneontology.org）對(duì)核心co-DE circRNAs 的來(lái)源基因進(jìn)行GO 功能富集分析，應(yīng)用“微生信”網(wǎng)站將結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.4.4 尼氏染色法觀察缺血側(cè)海馬組織神經(jīng)元受損情況 石蠟切片脫蠟至水，入甲苯胺藍(lán)染液5 min，水沖洗，1%的冰醋酸稍分化，自來(lái)水洗終止反應(yīng)，監(jiān)測(cè)分化程度；自來(lái)水洗后，將切片放置于烤箱烤干，二甲苯透明5 min，中性樹膠透明封片。在顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織切片的染色結(jié)果，主要觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)，使用CaseViewer 軟件查看圖像，50 μm標(biāo)尺下觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量。每張切片隨機(jī)采集3個(gè)視野，利用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)缺血側(cè)海馬CA1區(qū)尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，比較各組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元損傷程度。

1.4.5 RT-qPCR法驗(yàn)證核心 circRNAs表達(dá)量 每組隨機(jī)取5 只大鼠凍存患側(cè)海馬組織。取30～50 mg 在液氮中研磨，參照說(shuō)明書用超純RNA 提取試劑盒提取RNA、合成cDNA，采用第三代全長(zhǎng)cDNA一鏈合成試劑盒（去基因組）進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄，以β-肌動(dòng)蛋白基因（β-actin）為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增以檢測(cè)各組缺血側(cè)海馬組織中核心circRNAs 的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；40個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s）。每個(gè)樣本檢測(cè)3 個(gè)復(fù)孔，按照2-ΔΔCt公式計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，核心基因引物由上海康成公司提供。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.6 核心 circRNAs 的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及mRNA 的GO 功能富集分析 選取經(jīng)RT-qPCR 驗(yàn)證后與芯片結(jié)果一致的circRNAs 進(jìn)行ceRNA 網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，利用基于TargetScan 和 miRanda 的自制靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，以SeqMirnaCoverage＞0.3、CeMirnaCoverage＞0.3、P＜0.05 為條件［19］，篩選出對(duì)應(yīng)的miRNAs 和mRNAs，構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用 Cytoscape 3.8.2 軟件對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化展示，將預(yù)測(cè)的mRNAs 進(jìn)行GO 分析，應(yīng)用“微生信”網(wǎng)站（https：//www.bioinformatics.com.cn）將結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；不符合正態(tài)性分布則使用非參數(shù)檢驗(yàn)，以中位數(shù)與四分位間距［M（Q）］表示。組內(nèi)干預(yù)前后比較時(shí)，符合正態(tài)分布的資料用配對(duì)t檢驗(yàn)，不符合則采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。各組間比較時(shí)，滿足正態(tài)性分布的資料使用單因素方差分析，方差齊者用 LSD 法，方差不齊者用Games Howell法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠改良Garcia 神經(jīng)功能評(píng)分的影響 針刺干預(yù)前，與假手術(shù)組比較，各造模組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（P＜0.05），且各造模組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。末次針刺干預(yù)后，與假手術(shù)組比較，各造模組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；組內(nèi)干預(yù)前后比較，模型組和假手術(shù)組神經(jīng)功能評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），針刺組神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠改良Garcia神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2 對(duì)大鼠腦梗死面積比的影響 TTC 染色后，模型組與針刺組均出現(xiàn)白色梗死灶。與假手術(shù)組比較，模型組腦梗死面積比顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組腦梗死面積比顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠腦梗死面積比較

2.3 基因芯片檢測(cè)

2.3.1 對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬組織circRNAs 差異表達(dá)譜的影響 假手術(shù)組、模型組、針刺組各取3 只大鼠海馬組織進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，將差異circRNAs用聚類圖展示，結(jié)果詳見圖3。

圖3 circRNAs差異表達(dá)譜

2.3.2 對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬組織circRNAs 差異表達(dá)數(shù)量的影響 模型組相較假手術(shù)組共有603 個(gè)差異表達(dá)circRNAs，其中288 個(gè)上調(diào)，315 個(gè)下調(diào)；針刺組相較模型組共有51個(gè)差異表達(dá)circRNAs，其中33個(gè)上調(diào)，18個(gè)下調(diào)。模型組下調(diào)/針刺組上調(diào)、模型組上調(diào)/針刺組下調(diào)的co-DE circRNAs為 23個(gè)。見表2。

表2 co-DE circRNAs芯片數(shù)據(jù)

2.3.3 核心co-DE circRNAs的篩選 以FC＞1.25、P＜0.05為條件，根據(jù)co-DE circRNAs 來(lái)源基因富集的GO 條目個(gè)數(shù)，見圖4。篩選出排名前2 的核心基因?yàn)榻M蛋白去乙?；?（HDAC2）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶2（NTRK2），其中芯片結(jié)果顯示HDAC2為針刺干預(yù)后上調(diào)基因，NTRK2為針刺干預(yù)后下調(diào)基因，二者對(duì)應(yīng)的circRNA 分別為rno_circ_009775和rno_circ_006893，根據(jù)來(lái)源基因，分別將其命名為circHDAC2和circNTRK2。

圖4 co-DE circRNAs 來(lái)源基因富集的 GO 條目計(jì)數(shù)

2.3.4 大鼠缺血側(cè)海馬組織circHDAC2、circNTRK2來(lái)源基因的GO 功能富集分析 GO 富集分析由生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）組成，可初步探討基因產(chǎn)物在生物體中的潛在功能。選取每個(gè)模塊富集分?jǐn)?shù)前10 的條目進(jìn)行繪圖，可見circHDAC2、circNTRK2來(lái)源基因在BP 富集于神經(jīng)元的產(chǎn)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元分化等；在CC 富集于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、高爾基體等；在MF 富集于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、激酶結(jié)合等。見圖5。

圖5 circHDAC2、circNTRK2來(lái)源基因的GO分析

2.4 大鼠缺血側(cè)海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色 假手術(shù)組CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，細(xì)胞核多呈圓形，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)深染，尼氏體數(shù)量多；與假手術(shù)組比較，模型組CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)多呈空泡狀，核仁不明顯，尼氏體數(shù)量減少；與模型組比較，針刺組細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，核仁較清晰，胞漿明顯，尼氏體數(shù)量增加，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元損傷減輕。與假手術(shù)組比較，模型組缺血側(cè)海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組神經(jīng)元尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05）。見圖6 A、圖6 B。

圖6 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色情況比較

2.5 對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬組織circHDAC2、circNTRK2表達(dá)量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織circHDAC2、circNTRK2表達(dá)量均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組circHDAC2、circNTRK2表達(dá)量均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中circHDAC2表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致，circNTRK2表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果相反，根據(jù)顯著性結(jié)果及表達(dá)趨勢(shì)，選擇circHDAC2進(jìn)行下一步研究分析。見圖7。

圖7 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織circHDAC2、circNTRK2表達(dá)量比較

2.6circHDAC2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及mRNAs的GO分析2.6.1circHDAC2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于TargetScan 和miRanda 的自制 miRNA 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，以SeqMirnaCoverage＞0.3、CeMirnaCoverage＞0.3、P＜0.05 為條件篩選circHDAC2對(duì)應(yīng)的miRNAs 和mRNAs，構(gòu)建ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示有12 個(gè)miRNAs，31 個(gè)mRNAs。見圖8。

圖8 circHDAC2相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化結(jié)果

2.6.2circHDAC2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的mRNAs 的GO 分析

將預(yù)測(cè)出的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的mRNAs 進(jìn)行GO 分析，可見其在BP 富集于神經(jīng)元的產(chǎn)生、神經(jīng)元分化的調(diào)控、軸突引導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)等，在CC 富集于神經(jīng)元細(xì)胞體、突觸、細(xì)胞質(zhì)等，在MF 富集于微管結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、絲裂原活化蛋白激酶結(jié)合等。見圖9。

圖9 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中mRNAs的GO分析結(jié)果

3 討論

CIRI歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。一般認(rèn)為本病多因氣血虧虛，心、肝、腎三臟失調(diào)，復(fù)因勞逸失度、內(nèi)傷積損、情志不遂、飲酒飽食或外邪侵襲等觸發(fā)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂。其病位在腦，與心、肝、脾、腎相關(guān)?！澳X髓損傷，神機(jī)失用”是中風(fēng)發(fā)病之病機(jī)關(guān)鍵，“督脈痹阻”是其發(fā)病之經(jīng)絡(luò)學(xué)基礎(chǔ)［20］，因此腦部疾病的診治常以督脈循經(jīng)選穴為主?，F(xiàn)代研究［21-22］也證實(shí)，針刺督脈穴位對(duì)于中風(fēng)的療效優(yōu)于普通針灸選穴。本研究選取的大椎、水溝、百會(huì)均為督脈要穴。大椎為督脈入腦之樞紐要穴，刺之可通督醒腦，活血行氣；水溝為督脈和手足陽(yáng)明經(jīng)的交會(huì)穴，可醒神開竅、熄風(fēng)止痙；百會(huì)位于頭頂正中，為百脈聚會(huì)處，可生精補(bǔ)髓，調(diào)理五臟六腑之功能。三穴相配，共奏補(bǔ)益腦髓、通督醒神之功。課題組前期研究［23-24］已證實(shí)針刺對(duì)CIRI 療效確切，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)控多種類miRNAs 的表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，造模后，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均顯著降低，TTC 染色出現(xiàn)白色梗死灶，且腦梗死面積比升高，提示造模成功。針刺后，針刺組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高，腦梗死面積比下降，說(shuō)明針刺可改善CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷，減少腦梗死面積，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦的保護(hù)作用。

circRNAs是通過(guò)特殊的剪切方式將RNA的3'和 5'端通過(guò)共價(jià)鍵相連而形成的一種非編碼RNA，具有高度豐富性、高穩(wěn)定性和保守性［25］。circRNAs 在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)元組織中高度富集，涉及神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增殖、分化以及腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷［26］。目前，盡管針刺調(diào)控circRNAs 的表達(dá)抗 CIRI 鮮有研究報(bào)道，但針刺調(diào)控其他非編碼RNA的表達(dá)從而發(fā)揮治療作用已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。例如張亞敏等［27］采用電針“百會(huì)”“足三里”穴治療大鼠CIRI，結(jié)果顯示電針可以降低腦組織及血清miR-29的表達(dá)，提高miR-320表達(dá)水平，減輕 CIRI后腦損傷。課題組前期研究［28］亦證實(shí)，CIRI 大鼠海馬組織miRNAs表達(dá)譜在針刺后可發(fā)生改變，并且針刺可下調(diào)miR-106b-5p、上調(diào)miR-34c-5p，提示針刺改善CIRI 大鼠神經(jīng)功能、減少腦梗死面積可能與針刺調(diào)控miRNAs 的差異表達(dá)以及激發(fā)其功能有關(guān)。本研究通過(guò)基因芯片技術(shù)識(shí)別出針刺后的CIRI大鼠海馬組織中差異表達(dá)的circRNAs，并篩選出高表達(dá)的核心co-DE circRNAs 為circHDAC2 和circNTRK2。其中芯片結(jié)果顯示，HDAC2為針刺干預(yù)后上調(diào)基因，NTRK2為針刺干預(yù)后下調(diào)基因。二者GO 功能富集分析涉及神經(jīng)元的產(chǎn)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元分化，可見核心基因GO 分析結(jié)果與神經(jīng)元密切相關(guān)。海馬對(duì)機(jī)體氧含量的變化最敏感，CIRI后海馬最先受到損傷，而海馬CA1區(qū)神經(jīng)元最為敏感［29］，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)海馬CA1 區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組缺血側(cè)海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低，而在針刺后顯著升高，證實(shí)針刺可減輕缺血側(cè)海馬組織神經(jīng)元損傷。核心基因circHDAC2、circNTRK2的GO 功能富集分析結(jié)果與針刺所顯示的效應(yīng)一致。

進(jìn)一步對(duì)核心基因circHDAC2、circNTRK2進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織circHDAC2、circNTRK2表達(dá)量均顯著下調(diào)；針刺后二者表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中circHDAC2表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致，circNTRK2表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果相反，提示circHDAC2可能是針刺抗CIRI 的高表達(dá)關(guān)鍵靶點(diǎn)。且文獻(xiàn)［30］研究也顯示，組蛋白去乙?；福℉DAC）是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白乙?；囊环N重要酶，可減輕腦缺血后神經(jīng)元損傷，對(duì)中風(fēng)具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究中circHDAC2定量分析、GO 功能富集分析、尼氏染色的結(jié)果恰也提示circHDAC2可能是針刺抗CIRI 后神經(jīng)損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

circRNAs 最主要的生物學(xué)功能是“海綿作用”。研究［31］顯示，circTLK1可充當(dāng)miR-335-3p的“海綿”進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因TIPARP的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)高表達(dá)關(guān)鍵靶點(diǎn)circHDAC2構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有12 個(gè)miRNAs、31 個(gè)mRNAs。對(duì)這些mRNAs 進(jìn)行GO 分析，發(fā)現(xiàn)其富集于神經(jīng)元的產(chǎn)生、神經(jīng)元分化的調(diào)控、軸突引導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等BP，神經(jīng)元細(xì)胞體、突觸、細(xì)胞質(zhì)等CC，微管結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、絲裂原活化蛋白激酶結(jié)合等MF。以上富集分析結(jié)果與神經(jīng)損傷聯(lián)系緊密，故推測(cè)circHDAC2抗CIRI 后神經(jīng)損傷可能與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的mRNAs 相關(guān)，但具體是何種mRNA 還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，針刺“大椎”“水溝”“百會(huì)”能顯著改善CIRI 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與腦梗死面積比，減輕缺血側(cè)海馬組織神經(jīng)元損傷，其機(jī)制可能與針刺調(diào)控缺血側(cè)海馬組織circHDAC2表達(dá)以及激發(fā)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中mRNAs神經(jīng)元的產(chǎn)生、神經(jīng)元分化、神經(jīng)元細(xì)胞體功能等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)未涉及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNAs、mRNAs以及神經(jīng)元損傷相關(guān)蛋白的驗(yàn)證，以上機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。