李 玲，季 青，周 晶

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腫瘤科/腫瘤研究室（上海 201203）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer）是目前最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第3位（10.0%），病死率居第2 位（9.4%），并且發(fā)病率和病死率在中國(guó)呈上升趨勢(shì)［1］。轉(zhuǎn)移是造成結(jié)直腸癌難治性的重要原因。肝臟是結(jié)直腸癌患者最常見的轉(zhuǎn)移部位。15%～25%的結(jié)直腸癌患者在初診時(shí)即診斷為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，8%～13%的原位結(jié)直腸癌患者在手術(shù)治療后出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移［2］。伴有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者5年生存率為3.3%，顯著低于原位結(jié)直腸癌患者的90.3%［1］。因此，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌治療效果和預(yù)后評(píng)價(jià)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。Jumonji 結(jié)構(gòu)域包含蛋白3（JMJD3）作為組蛋白甲基化修飾的關(guān)鍵酶，通過特異性去除第27 位賴氨酸三甲基化的組蛋白H3（H3K27me3）甲基化修飾，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［3］。骨橋蛋白（OPN）是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞激活的關(guān)鍵標(biāo)記物，與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)［4］。外泌體作為腫瘤細(xì)胞的信使，其攜帶的各種細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)在細(xì)胞與微環(huán)境之間的通信中起關(guān)鍵作用，為腫瘤細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)提供合適的環(huán)境。外泌體通過激活巨噬細(xì)胞促進(jìn)抑制性免疫微環(huán)境的形成，這是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一［5］。

近年來，通過中藥干預(yù)腫瘤源性外泌體，進(jìn)而改善腫瘤治療效果的實(shí)驗(yàn)研究不斷出現(xiàn)，這也從微觀的角度證明了中藥對(duì)腫瘤源性外泌體的影響是確切的［6-7］。脾虛濕熱是結(jié)直腸癌的核心中醫(yī)病機(jī)，脾虛是導(dǎo)致結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［8］。黃芪作為健脾益氣中藥，臨床中運(yùn)用廣泛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究［9-11］發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，ASⅣ）作為黃芪主要藥理活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤的作用，在肝癌、腸癌、胃癌等腫瘤的治療中運(yùn)用廣泛。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［12-13］，ASⅣ能夠通過影響外泌體介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞激活抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制尚不明確。本研究以組蛋白甲基化為切入點(diǎn)，探究ASⅣ調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞激活的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株MC38，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 動(dòng)物 6 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠15 只，雄性，體質(zhì)量15～20 g，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（滬）2020-0009。所有小鼠全程飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h/12 h 明暗周期，自由攝取食水。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2022-0004。本實(shí)驗(yàn)由上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：PZSHUTCM2212270002），所有實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 藥物與試劑 ASⅣ（純度＞98%），上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)：B20564）；Dulbecco 改良的 Eagle（DMEM）培養(yǎng)基、0.25%的胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液，美國(guó)Corning公司（批號(hào)分別為10-013-CV、25-053-CI、30-002-CI）；胎牛血清，美國(guó)Gibico 公司（批號(hào)：10099-141）；乙二胺（Cy3）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG，H+L）、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、免疫染色封閉液、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為A0516、A0423、P0102、A0208、P0010）；凝膠快速制備試劑盒，上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)：PG212）；預(yù)染彩虹蛋白標(biāo)記，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)：26616）；化學(xué)發(fā)光液，德國(guó)Merck Millipore 公司（批號(hào)：WBKLS0500）；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司（批號(hào)分別為RC112、R312、Q331）；抗體JMJD3、H3K27me3、OPN 及成熟小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（F4/80）、甘露糖受體（CD206）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），美國(guó)CST 公司（批號(hào)分別為457S、9733T、88742S、30325T、24595S、92310SF）。

1.1.4 主要儀器 雙人垂直流超凈工作臺(tái)，新加坡ESCO 公司（型號(hào)：SVE-6A1）；臺(tái)式低速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司（型號(hào)：5702R）；PCR 儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：7500）；激光掃描共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica公司（型號(hào)：Leica SP-8）；微型超速離心機(jī)，日本Hitachi株式會(huì)社（型號(hào)：CS120FNX）；納米顆粒跟蹤分析儀，英國(guó)Malvern 公司（型號(hào)：NS300）；恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：51033575）；化學(xué)發(fā)光成像儀，上海勤翔科技有限公司（型號(hào)：Chemiscope 6000）；酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek 公司（型號(hào)：Synergy H1）；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad 公司（型號(hào)分別為Power Pac HV、Trans-blot SD）；組織研磨儀，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司（型號(hào)：Tissuelyser-96）。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù) MC38 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶90%時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化后傳代，傳代比例1∶3，傳至第3 代后用于正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照組、ASⅣ組。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)?；谡n題組前期研究［12］基礎(chǔ)，ASⅣ組以25 μmol/L ASⅣ加入DMEM培養(yǎng)基配置成條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清至50 mL 離心管，-80 ℃保存。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃、50 %～70 %飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 外泌體提取 采用差速離心法提取外泌體。從-80 ℃冰箱中取出收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，4 ℃解凍后離心。4 ℃、800 r/min 離心10 min，取上清，去除細(xì)胞及碎片；4 ℃、4 000 r/min 離心 10 min，取上清；0.22 μm 濾器過濾后，4 ℃、240 000 r/min離心 30 min，取上清；將離心后上清轉(zhuǎn)移至超離管內(nèi)，4 ℃、240 000 r/min 超速離心70 min，棄上清，加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸沉淀；4 ℃、240 000 r/min超速離心 70 min，棄上清，沉淀即為外泌體。加入適量 PBS 重懸外泌體，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用前采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的外泌體命名為MC38-EVs，ASⅣ組細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的外泌體命名為ASⅣ/MC38-EVs。

1.2.3 外泌體鑒定 取10 μL 外泌體懸液，稀釋10 倍后采用納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)外泌體粒徑大小及濃度。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 分組與造模 C57BL/6J 小鼠15 只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、MC38-EVs 組、ASⅣ/MC38-EVs 組，每組5 只。參考Lin 等［14］造模方法，構(gòu)建小鼠結(jié)直腸癌原位肝轉(zhuǎn)移模型，以皮下移植瘤作為瘤源，將腫瘤組織放置在無菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液中，剔除出血及壞死組織，分割成若干直徑約 1 mm 大小的組織塊備用。1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。取下腹正中切口，長(zhǎng)約 1 cm，逐層切開皮膚、腹膜，進(jìn)入腹腔，鉗出盲腸，于盲腸末端用眼科剪輕輕劃破漿膜面，用醫(yī)用膠將瘤體粘到盲腸末端，將盲腸回納入腹腔，逐層關(guān)腹。小鼠結(jié)直腸癌原位肝轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建方法見圖1。

圖1 小鼠結(jié)直腸癌原位肝轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建

1.3.2 干預(yù)方法 模型組，每只小鼠尾靜脈注射PBS，100 μL/次，隔日1 次，造模前1 周開始，連續(xù)3 周。MC38-EVs 組，每只小鼠尾靜脈注射0.1 g/L 的MC38-EVs，100 μL/次，隔日1 次，造模前1 周開始，連續(xù)3 周。ASⅣ/MC38-EVs 組，每只小鼠尾靜脈注射0.1 g/L 的ASⅣ/MC38-EVs，100 μL/次，隔日1 次，造模前1 周開始，連續(xù)3周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目 小鼠結(jié)直腸癌原位肝轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建4周后，剝?nèi)⌒∈蟾闻K組織，觀察肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目并記錄。

1.4.2 肝轉(zhuǎn)移灶病理學(xué)變化 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察肝轉(zhuǎn)移灶病理學(xué)變化。取小鼠肝轉(zhuǎn)移灶并置于4%多聚甲醛中固定15 min，100%、95%、85%、75%乙醇中依次梯度脫水3 min。二甲苯透明后常規(guī)浸蠟包埋；固定于切片機(jī)，切成5～8 μm 厚度的薄片。蘇木精水溶液染色5 min，流水沖洗后，酸水及氨水各分色30 s，流水浸泡返藍(lán)5 min，70 %及90 %乙醇脫水10 min，伊紅染色5 min，流水沖洗后，無水乙醇脫水2 min，二甲苯透明5 min。透明后的切片快速風(fēng)干，加拿大樹膠封片，鏡檢。

1.4.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN 蛋白表達(dá) 各組小鼠分別切取20 mg 的轉(zhuǎn)移瘤組織置于1.5 mL EP 管中，每管加入300 μL蛋白裂解液，置于組織研磨儀中研磨勻漿。冰上裂解10 min 后，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，得到肝轉(zhuǎn)移瘤組織蛋白。BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。聚丙烯酰胺蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，相應(yīng)一抗JMJD3、H3K27me3、OPN、GAPDH 均以1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，Tris緩沖液洗滌后，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗雜交，比例1∶5 000。等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗滌后，ECL發(fā)光液浸泡1 min 后顯影。ImageJ 軟件檢測(cè)每組JMJD3、H3K27me3、OPN、GAPDH灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，每組相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值計(jì)算。

1.4.4 免疫熒光法檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移灶中F4/80、CD206、JMJD3、H3K27me3、OPN 蛋白表達(dá) 取小鼠肝轉(zhuǎn)移灶，常規(guī)脫水包埋后，冰凍切片10 μm，切片置于0.1 mol/L枸櫞酸液中進(jìn)行抗原修復(fù)；山羊血清室溫封閉1 h，PBS清洗后，加入相應(yīng)一抗稀釋液（比例1∶500），4 ℃孵育過夜；PBS 清洗后，熒光二抗室溫避光孵育1 h；PBS 清洗后，4',6-二脒基-2 苯基吲哚避光孵育15 min；PBS 清洗后滴加抗熒光淬滅劑封片。全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描儀掃片，ImageJ 軟件分析平均熒光強(qiáng)度，檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移灶中相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.4.5 RT-qPCR法檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、OPNmRNA表達(dá) 各組小鼠分別切取10 mg 的轉(zhuǎn)移瘤組織，加入350 μL 裂解液，冰上勻漿至無明顯組織團(tuán)塊。按照RNA 提取試劑盒說明書提取組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按RT-qPCR 試劑盒說明書進(jìn)行mRNA 熒光定量。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt法分析各組相關(guān)mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 GraphPad Prism 9.0、SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。計(jì)量資料以表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組間差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間差異比較采用LSD檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)，其多組間差異比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，兩組間差異比較采用Games-Howell 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的影響 通過分離小鼠肝臟，觀察肝臟轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)行肝轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)和肝臟稱重，并對(duì)肝臟進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示，與模型組比較，MC38-EVs組肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和肝臟質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）；與MC38-EVs 組比較，ASⅣ/MC38-EVs 組肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和肝臟質(zhì)量明顯減少（P＜0.05）。見圖2、圖3、表2。

表2 各組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和質(zhì)量比較（n=5，±s）

表2 各組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和質(zhì)量比較（n=5，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與MC38-EVs組比較，#P＜0.05。

組別模型組MC38-EVs 組ASⅣ/MC38-EVs組肝臟質(zhì)量/mg 944.74±74.34 1 443.80±277.84*793.08±125.30#肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目/個(gè)3.80±0.83 12.40±2.70*4.60±0.89#

圖2 各組小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶解剖圖

圖3 各組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

2.2 對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞F4/80、CD206 蛋白的影響與模型組比較，MC38-EVs組肝轉(zhuǎn)移灶中F4/80+、CD206+巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P＜0.05）。與MC38-EVs 組比較，ASⅣ/MC38-EVs 組肝轉(zhuǎn)移灶中F4/80+、CD206+巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組肝轉(zhuǎn)移灶中CD206、F4/80蛋白表達(dá)水平比較（免疫熒光染色，×200）

2.3 對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞OPN 蛋白的影響 與模型組比較，MC38-EVs 組肝轉(zhuǎn)移灶中OPN 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與MC38-EVs 組比較，ASⅣ/MC38-EVs 組肝轉(zhuǎn)移灶中OPN 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組肝轉(zhuǎn)移灶中OPN蛋白表達(dá)水平比較（免疫熒光染色，×150）

2.4 對(duì)JMJD3/H3K27me3/OPN通路的影響 Western blot、免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，MC38-EVs 組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、OPN 蛋白表達(dá)水平升高，H3K27me3 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與MC38-EVs組比較，ASⅣ/MC38-EVs 組肝轉(zhuǎn)移灶JMJD3、OPN 蛋白表達(dá)水平降低，H3K27me3 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見表3、圖6、圖7。

表3 各組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表達(dá)水平比較（n=5，±s）

表3 各組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表達(dá)水平比較（n=5，±s）

注：GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，JMJD3 為Jumonji 結(jié)構(gòu)域包含蛋白3，H3K27me3 為第27 位的賴氨酸三甲基化的組蛋白H3，OPN 為骨橋蛋白。與模型組比較，*P＜0.05；與MC38-EVs組比較，#P＜0.05。

組別模型組MC38-EVs組ASⅣ/MC38-EVs組JMJD3/GAPDH 1.00±0.00 1.42±0.07*0.74±0.14#H3K27me3/GAPDH 1.00±0.00 0.49±0.05*1.32±0.16#OPN/GAPDH 1.00±0.00 1.56±0.10*1.23±0.10#

圖6 各組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN 蛋白電泳條帶圖

圖7 各組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、H3K27me3蛋白表達(dá)水平比較（免疫熒光染色，×150）

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，MC38-EVs組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、OPNmRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與MC38-EVs組比較，ASⅣ/MC38-EVs組肝轉(zhuǎn)移灶JMJD3、OPNmRNA表達(dá)水平降低，（P＜0.05）。見表4。

表4 各組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、OPN mRNA 表達(dá)水平比較（n=5，±s）

表4 各組肝轉(zhuǎn)移灶中JMJD3、OPN mRNA 表達(dá)水平比較（n=5，±s）

注：JMJD3 為組蛋白去甲基化酶基因，OPN 為人骨橋蛋白基因。與模型組比較，*P＜0.05；與MC38-EVs組比較，#P＜0.05。

OPN 2.02±0.37 14.41±1.07*1.21±0.11#組別模型組MC38-EVs組ASⅣ/MC38-EVs組JMJD3 1.21±0.04 4.54±0.83*1.19±0.55#

3 討論

手術(shù)切除肝轉(zhuǎn)移灶是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的主要治療方式，也是最有效的治療手段。但臨床證據(jù)表明，僅不到25%的患者達(dá)到手術(shù)切除指征，并且手術(shù)后遺癥、藥物不良反應(yīng)等問題嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［14］。在防治結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中，中西醫(yī)結(jié)合治療模式展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。研究［15-19］顯示，中醫(yī)藥在“整體觀念”和“治未病”的理論指導(dǎo)下，可有效改善手術(shù)、放射治療、化學(xué)療法、靶向治療和免疫治療引起的不良反應(yīng)，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。中醫(yī)認(rèn)為正氣虧虛是結(jié)直腸癌發(fā)生的根本原因，也是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。黃芪作為經(jīng)典扶正藥材，有補(bǔ)中益氣、健脾利水之功，廣泛應(yīng)用于腫瘤治療。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究［20］證實(shí)，黃芪主要通過提升患者的免疫功能從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

ASⅣ是黃芪的主要單體活性物質(zhì)，也是評(píng)價(jià)黃芪發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。ASⅣ具有抗炎、抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和調(diào)節(jié)代謝等多方面的藥理作用［20-22］。研究［23-26］發(fā)現(xiàn)，ASⅣ在抗癌方面具有較大潛力，且抑癌效果廣譜，對(duì)胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等多種癌癥具有抑制作用。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［27］表明，ASⅣ直接灌胃給藥能劑量依賴性抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。與順鉑聯(lián)用可顯著增強(qiáng)結(jié)直腸癌的化學(xué)療法敏感性［28］。本研究證實(shí)，ASⅣ能夠通過調(diào)控腫瘤外泌體抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。

H3K27me3是一種基因沉默性表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，影響基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)。JMJD3 是一種組蛋白去甲基化酶，屬于Jumonji C 結(jié)構(gòu)域包含基因家族，通常在結(jié)直腸癌、胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等癌癥中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)［29］。JMJD3 通過以序列特異性的方式對(duì)H3K27me3進(jìn)行去甲基化，影響染色質(zhì)松緊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而解除轉(zhuǎn)錄抑制，使其成為轉(zhuǎn)錄激活蛋白［3］。研究［30］發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中，JMJD3 通過解除H3K27me3對(duì)E-鈣黏蛋白、緊密連接蛋白-1和緊密連接蛋白-7 等基因的轉(zhuǎn)錄抑制，促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展。同時(shí)，JMJD3 與巨噬細(xì)胞激活關(guān)系密切，其具體機(jī)制在于活化的JMJD3 通過促進(jìn)H3K27me3 去甲基化促進(jìn)精氨酸酶1、白介素-10、抵抗素樣α等相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 表型改變［31］。本研究證實(shí)，JMJD3 能夠通過H3K27me3 影響OPN 活性調(diào)控巨噬細(xì)胞表型，ASⅣ能夠調(diào)控JMJD3介導(dǎo)的H3K27me3/OPN通路。

OPN 是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，在結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移灶巨噬細(xì)胞中顯著高表達(dá)［4］，然而有關(guān)巨噬細(xì)胞中OPN 表達(dá)水平具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究顯示，腫瘤來源外泌體可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞JMJD3、OPN 蛋白表達(dá)，抑制H3K27me3 蛋白表達(dá)，提示JMJD3 在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成中充分發(fā)揮其去甲基化酶的作用，降低H3K27me3 甲基化水平，促進(jìn)OPN 轉(zhuǎn)錄，使巨噬細(xì)胞向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，即影響JMJD3/H3K27me3/OPN通路可能是腫瘤外泌體影響結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。ASⅣ作用后，肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目減少，巨噬細(xì)胞JMJD3、OPN 蛋白表達(dá)顯著降低，H3K27me3 蛋白表達(dá)升高，提示ASⅣ抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制與JMJD3/H3K27me3/OPN通路有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ASⅣ能夠抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，減少腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞激活。并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了ASⅣ抗結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ASⅣ可能通過影響外泌體介導(dǎo)的JMJD3/H3K27me3/OPN 信號(hào)通路減少腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞激活，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為闡明ASⅣ抗結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也可為深入研究中藥抗腫瘤的藥理作用提供參考。