孫亞寧，盧清俠，邢云瑞，楊蘇珍，范 璐，喬松林，張改平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，死亡率可高達(dá)100%[1]。2018 年下半年，ASFV 傳入我國(guó)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了前所未有的威脅[2]，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前，ASFV 仍在廣泛傳播，傳染源與污染源并未徹底清除，且出現(xiàn)了ASFV 變異株和經(jīng)典強(qiáng)毒株共流行的局勢(shì)[4]。ASFV 變異株包括基因缺失株[5]、自然變異株、自然弱毒株[6]等，與2018 年傳入的ASFV 毒株相比，該類毒株的基因組序列、致病力等發(fā)生明顯變化，豬感染變異株后排毒滴度低、間隙性排毒，難以早期發(fā)現(xiàn)，讓防控形勢(shì)變得更復(fù)雜[5]。對(duì)于目前ASFV 并沒(méi)有疫苗及有效的治療手段，建立敏感、特異、簡(jiǎn)便且能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的ASFV 檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)感染豬的早期發(fā)現(xiàn)、實(shí)施“精準(zhǔn)剔除”是實(shí)現(xiàn)豬場(chǎng)內(nèi)部ASFV 凈化、控制疫情的有效手段[7]。

ASFV 的檢測(cè)技術(shù)主要包括檢測(cè)抗原的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等核酸檢測(cè)方法和檢測(cè)抗體的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）等免疫學(xué)檢測(cè)方法[8]。PCR已成功應(yīng)用于豬樣品（血液、器官等）[9]中ASFV 基因組的檢測(cè)，是可以代替病毒分離鑒定的一種靈敏、特異、快速的ASFV 檢測(cè)技術(shù)，在抗原檢測(cè)技術(shù)中，較免疫學(xué)方法和熒光免疫分析法等具有更高的敏感性和特異性。但是PCR 無(wú)法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且在ASFV 感染康復(fù)后及變異毒株感染的情況下，PCR 的漏檢率非常高[10]，無(wú)法滿足目前ASFV 復(fù)雜感染情況下的檢測(cè)需求?；贏SFV 感染后7～9 d 血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，包括康復(fù)后的動(dòng)物，抗體陽(yáng)性可持續(xù)終生等特點(diǎn)，在無(wú)可用疫苗的大背景下，抗體檢測(cè)陽(yáng)性則表明感染正在或者已經(jīng)發(fā)生，開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)ASFV 抗體快速檢測(cè)可以大大提高檢測(cè)效率及準(zhǔn)確性，在ASFV精準(zhǔn)剔除計(jì)劃中意義重大[11]。

膠體金免疫層析技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種體外診斷技術(shù)，相比ELISA 方法具有快速、準(zhǔn)確、方便，無(wú)需任何人員及設(shè)備，幾分鐘即可出結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，研制能夠靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)ASFV抗體的試紙對(duì)控制ASFV疫情起到積極作用。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)針對(duì)ASFV 抗體檢測(cè)試紙開(kāi)展了研究[12-15]，常用的檢測(cè)抗原有p30、p54、CD2V 及p72 等。但是ASFV 抗體檢測(cè)試紙?jiān)谑褂眠^(guò)程中存在敏感性低、準(zhǔn)確性差等問(wèn)題，成為ASFV 抗體檢測(cè)試紙推廣應(yīng)用的瓶頸。影響抗體檢測(cè)試紙敏感性及準(zhǔn)確性的主要因素是檢測(cè)抗原的質(zhì)量及免疫層析試紙的產(chǎn)品化工藝。已有的ASFV抗體檢測(cè)試紙的檢測(cè)抗原多為原核表達(dá)，與病毒本身的蛋白結(jié)構(gòu)相差較大，從而造成檢測(cè)敏感性及準(zhǔn)確性差；再者建立的試紙大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，并未對(duì)產(chǎn)品的工藝參數(shù)進(jìn)行細(xì)致優(yōu)化。因此，ASFV抗體檢測(cè)試紙并未在基層大面積推廣應(yīng)用。

ASFV 是直徑為200 nm 的大型包膜病毒，病毒基因可編碼200 多種蛋白質(zhì)，其中包括50 多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)[16-20]，常用的檢測(cè)抗原中，p30、p54為ASFV感染早期表達(dá)的蛋白質(zhì)[21-22]，但是其在病毒中含量較少，產(chǎn)生抗體滴度較低。p72蛋白是構(gòu)成ASFV二十面體結(jié)構(gòu)的主要蛋白質(zhì)，占病毒蛋白總量的32%[23]，在病毒衣殼上以同源三聚體形式存在[24]。p72 抗原性強(qiáng)，表位非常保守[25]，含有4 個(gè)主要抗原表位，可能參與受體的結(jié)合和中和性抗體的結(jié)合。為了解決目前ASFV 抗體檢測(cè)試紙存在的問(wèn)題，選擇真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)共轉(zhuǎn)染p72基因及其伴侶蛋白基因的方法，獲取正確折疊的p72重組蛋白為檢測(cè)抗原，并研究蛋白質(zhì)不同狀態(tài)對(duì)檢測(cè)試紙的影響，經(jīng)條件優(yōu)化，建立ASFV 抗體檢測(cè)試紙，以期從原材料上入手提高產(chǎn)品檢測(cè)敏感性，再通過(guò)優(yōu)化試紙制備過(guò)程中的條件，形成較優(yōu)的生產(chǎn)工藝，確保ASFV 抗體檢測(cè)試紙的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性能滿足商品化需求，為ASFV 抗體檢測(cè)在基層的廣泛應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 ASFV p72 蛋白三聚體及多聚體（HEK293F 細(xì)胞表達(dá)）、ASFV p72 單克隆抗體由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；43份ASFV抗體陰性血清（2018年以前收集）、22份ASFV抗體陽(yáng)性血清、豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）抗體陽(yáng)性血清、豬細(xì)小病毒（PPV）抗體陽(yáng)性血清由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集及保存；ASFV抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、偽狂犬病毒（PRV）抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、豬瘟病毒（CSFV）抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

重組金黃色葡萄球菌A 蛋白（r-SPA）購(gòu)自杭州紐龍生物科技有限公司；氯金酸、酪蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)IgG、無(wú)蛋白酶的牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research 公司；Tween 20購(gòu)自美國(guó)默克公司；PVP-10、PEG20 000、Tris 購(gòu)自美國(guó)Solarbio 公司；Triton X-100 購(gòu)自美國(guó)Merck 公司；海藻糖購(gòu)自日本W(wǎng)ako 公司；硝酸纖維素膜（HF13502S25，30 cm×2 cm）、玻璃纖維墊、吸水紙購(gòu)自英國(guó)Millipore公司；ASFV ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自韓國(guó)金諾公司；氫氧化鈉、疊氮鈉等其他試劑為國(guó)內(nèi)市售分析純級(jí)。

1.1.2 主要儀器 93-3 定時(shí)恒溫雙向磁力攪拌器購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HGS802 壓殼機(jī)購(gòu)自杭州峰航科技有限公司；900 型薄膜連續(xù)封口機(jī)購(gòu)自廣州華豐包裝設(shè)備有限公司；SIGMA4-16K 離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；加熱磁力攪拌器購(gòu)自德國(guó)IKA公司；U-3000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司；BioDot-XYZ3060 三維噴點(diǎn)系統(tǒng)、BioDot-CM 4000斬切機(jī)購(gòu)自美國(guó)Bio-Dot公司；智能免疫層析定量分析儀由北京中農(nóng)快檢科技有限公司提供。

1.2 方法

ASFV 抗體檢測(cè)試紙選擇間接法原理建立。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。試紙由支撐底板、硝酸纖維素膜（NC膜）、結(jié)合墊、樣品墊和吸收墊五部分組成。NC 膜上質(zhì)控線（C 線）位置固定p72 單克隆抗體，檢測(cè)線（T 線）位置固定SPA；結(jié)合墊上固定膠體金標(biāo)記的p72 蛋白。當(dāng)樣品為陰性時(shí)，金標(biāo)p72 蛋白隨著液體流動(dòng)到T 線位置時(shí)不與SPA 反應(yīng)，流經(jīng)C 線時(shí)與固定的p72 單克隆抗體反應(yīng)，顯示1 條紅色條帶；當(dāng)樣品為陽(yáng)性時(shí)，樣品中ASFV p72 抗體與金標(biāo)p72 結(jié)合形成復(fù)合物，流經(jīng)T線時(shí)與SPA反應(yīng)被攔截，多余的金標(biāo)蛋白被C 線攔截，試紙顯示2 條紅色條帶。該試紙目測(cè)即可判定結(jié)果，也可借助智能免疫層析定量分析儀掃描T 線灰度值峰面積，根據(jù)讀值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，T 線顯色強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與抗體滴度呈正比。

圖1 ASFV抗體檢測(cè)試紙結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the ASFV antibody test strip

1.2.1 膠體金制備及鑒定 以檸檬酸三鈉法制備膠體金。在500 mL 燒杯中加入100 mL 超純水，在加熱磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱，煮沸后先加入1 mL 10 g/L 的氯金酸，然后再加入1.6 mL 10 g/L 檸檬酸三鈉，觀察顏色變?yōu)榫萍t色后再繼續(xù)加熱5 min，取下燒杯，自然冷卻后用超純水定容至100 mL，4 ℃保存。肉眼觀測(cè)膠體金狀態(tài)，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，對(duì)膠體金質(zhì)量及粒徑進(jìn)行鑒定。

1.2.2 不同狀態(tài)p72重組蛋白的對(duì)比試驗(yàn) 在蛋白質(zhì)純化的過(guò)程中，經(jīng)分子篩分離獲得p72 三聚體蛋白和p72 多聚體蛋白，膠體金分別標(biāo)記2 種蛋白質(zhì)，并進(jìn)行試紙條件優(yōu)化建立檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)比標(biāo)記過(guò)程穩(wěn)定性及試紙檢測(cè)性能，對(duì)比蛋白質(zhì)的不同狀態(tài)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)品的影響，選擇較優(yōu)蛋白質(zhì)狀態(tài)組裝試紙。

1.2.3 膠體金標(biāo)記p72蛋白條件優(yōu)化 分別對(duì)膠體金標(biāo)記p72蛋白的pH值、標(biāo)記量進(jìn)行優(yōu)化。

膠體金標(biāo)記pH 值優(yōu)化：用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金pH 值，取7 個(gè)離心管，每管中加入1 mL 膠體金，再分別加入2、4、6、8、10、12、14 μL K2CO3，按照張改平等[26]所述方法測(cè)定各pH 值下最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量。按照測(cè)定的最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量將蛋白質(zhì)加入不同pH 值的膠體金中，充分混勻，室溫靜置反應(yīng)70 min，加入100 μL 100 g/L BSA 溶液封閉，反應(yīng)10 min，12 000 r/min 離心25 min，棄上清，沉淀用金標(biāo)蛋白保存液重懸。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定非優(yōu)化環(huán)節(jié)的參數(shù)，組裝試驗(yàn)用試紙（方法下同）[27]，將不同pH 值條件下標(biāo)記的金標(biāo)蛋白，以1 μL/條的量點(diǎn)在金標(biāo)墊上，檢測(cè)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陰性及陽(yáng)性血清。智能免疫層析定量分析儀掃描，計(jì)算陽(yáng)性血清T線（P）與陰性血清T 線（N）的比值（P/N 值）。根據(jù)金標(biāo)蛋白標(biāo)記過(guò)程中的穩(wěn)定性及試紙檢測(cè)結(jié)果，確定最佳標(biāo)記pH 值。最佳pH 值條件下，在蛋白質(zhì)飽和度附近設(shè)定不同的蛋白質(zhì)加入量，標(biāo)記膠體金獲得金標(biāo)蛋白。將不同標(biāo)記濃度標(biāo)記的金標(biāo)蛋白點(diǎn)于金標(biāo)墊上檢測(cè)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陰性及陽(yáng)性血清，以檢測(cè)結(jié)果確定蛋白質(zhì)標(biāo)記量。

1.2.4 NC 膜噴膜濃度優(yōu)化 檢測(cè)線（T 線）最佳噴涂條件確定：用PBS 配制SPA 質(zhì)量濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL 的溶液，以1 μL/cm 的量噴于NC膜上，42 ℃干燥2 h，然后組裝試驗(yàn)用試紙，檢測(cè)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陰性及陽(yáng)性血清，智能免疫層析定量分析儀掃描，選擇P/N 值最大，且N 值最小的噴膜濃度為最佳噴膜質(zhì)量濃度。

質(zhì)控線（C 線）最佳噴涂條件確定：取抗p72 蛋白單克隆抗體，用PBS 稀釋為2、1、0.5 mg/mL 質(zhì)量濃度的溶液，以1 μL/cm 的量噴于NC 膜上C 線，同時(shí)噴涂T 線（最佳參數(shù)），42 ℃干燥2 h，然后組裝試驗(yàn)用試紙，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清效價(jià)，選擇C 線清晰，且在檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性血清時(shí)C線仍能顯色的質(zhì)量濃度為質(zhì)控線噴涂條件。

1.2.5 樣品墊配方優(yōu)化 參照孫亞寧等[27]的樣品墊配方，設(shè)置基礎(chǔ)配方：0.1 mol/L PBS 含10 g/L 酪蛋白鈉，5 g/L Triton X-100，NaN30.3 g/L。在此配方上固定其他參數(shù)調(diào)整單因素，分別調(diào)整緩沖液（如Na2B4O7·10H2O、Tris-HCl、MES 等）、大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)（PVP-10、PVP-40、BSA、PEG 等）、表面活性劑S1-S25，最終以試紙流動(dòng)狀態(tài)、P/N 值及N 值為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定較優(yōu)樣品墊配方。

1.2.6 ASFV 抗體檢測(cè)試紙生產(chǎn) 結(jié)合墊制備：在攪拌狀態(tài)下將1 400 μL 0.2 mol/L K2CO3加入100 mL膠體金中調(diào)節(jié)pH 值，然后攪拌狀態(tài)下逐滴加入16 mL p72 三聚體（用ddH2O 稀釋的0.1 mg/mL 溶液），室溫反應(yīng)30 min，攪拌狀態(tài)下加入10 mL BSA溶液（質(zhì)量濃度100 g/L），室溫反應(yīng)10 min，12 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用20 mL 金標(biāo)蛋白保存液重懸。然后用BioDot-XYZ3060 三維噴點(diǎn)系統(tǒng)按7 μL/cm 的量噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維棉（0.9 cm×30 cm）上，42 ℃干燥1 h，密封保存。

NC 膜制備：用BioDot-XYZ3060 三維噴點(diǎn)系統(tǒng)按1 μL/cm的量噴涂C線及T線，42 ℃干燥2 h，密封保存。

樣品墊制備：將尺寸為1.8 cm×30 cm 玻璃纖維棉浸泡于樣品墊溶液中，靜置5 min，然后均勻平鋪于干燥板上，42 ℃干燥4 h，密封保存。

試紙組裝：按照?qǐng)D1，將NC 膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊依次粘貼于支撐底板上，各組分間重合2 mm，切割機(jī)切割成規(guī)格為3.0 mm×70 mm 的試紙，將試紙裝入卡殼中，加入干燥劑密封保存。

1.2.7 ASFV 抗體檢測(cè)試紙顯色時(shí)間優(yōu)化 用試紙檢測(cè)ASFV 陽(yáng)性血清（生理鹽水1∶100稀釋），設(shè)3個(gè)平行，分別在顯色5、10、15、20、25、30 min 時(shí)，用智能免疫層析定量分析儀掃描，確定最佳顯色時(shí)間。

1.2.8 ASFV 抗體檢測(cè)試紙敏感性鑒定及樣品稀釋倍數(shù)選擇 用生理鹽水將ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清樣品倍比稀釋，然后用試紙檢測(cè)，每個(gè)稀釋倍數(shù)平行檢測(cè)3 次，顯色10 min 后用智能免疫層析定量分析儀掃描試紙，以T 線P/N ≥2.1 對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)確定為試紙檢測(cè)效價(jià)，同時(shí)用ASFV ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性血清效價(jià)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)試紙敏感性。

同時(shí)用試紙檢測(cè)弱陽(yáng)性血清效價(jià)，根據(jù)弱陽(yáng)性血清及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清機(jī)讀結(jié)果確定樣品稀釋倍數(shù)。

1.2.9 ASFV 抗體檢測(cè)試紙檢測(cè)方法及結(jié)果判定

試紙檢測(cè)方法：將試紙取出平放于桌面上；將豬血清樣品用生理鹽水進(jìn)行1∶100 稀釋；取稀釋好的樣品100 μL加入試紙加樣孔中，靜置反應(yīng)10 min后目測(cè)或機(jī)器掃描讀取結(jié)果。

目測(cè)結(jié)果判定：僅在質(zhì)控線（C）處顯現(xiàn)1條紅色條帶，而檢測(cè)線（T）處不顯現(xiàn)紅色條帶時(shí)，結(jié)果判為陰性；在質(zhì)控線（C）和檢測(cè)線（T）處同時(shí)顯現(xiàn)2 條紅色條帶時(shí)，結(jié)果判為陽(yáng)性，而且檢測(cè)線顏色深度與抗體效價(jià)高低在一定范圍內(nèi)呈正比。

機(jī)讀結(jié)果判定：當(dāng)機(jī)讀結(jié)果為11.18 時(shí)判為陰性，當(dāng)機(jī)讀結(jié)果大于23.48（P/N＞2.1）時(shí)判為陽(yáng)性，當(dāng)結(jié)果在11.18～23.48時(shí)，建議4～7 d后復(fù)測(cè)。

1.2.10 ASFV 抗體檢測(cè)試紙?zhí)禺愋澡b定 用ASFV抗體檢測(cè)試紙分別檢測(cè)ASFV、PRRSV、PPV、PCV2、PRV、CSFV陽(yáng)性血清及ASFV陰性血清，顯色10 min后，目測(cè)鑒定試紙?zhí)禺愋浴?/p>

1.2.11 ASFV 抗體檢測(cè)試紙均一性鑒定 取ASFV抗體檢測(cè)試紙10 條，檢測(cè)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，顯色10 min 后，用智能免疫層析定量分析儀掃描試紙，計(jì)算變異系數(shù)（CV），評(píng)價(jià)試紙均一性。

1.2.12 ASFV 抗體檢測(cè)試紙準(zhǔn)確性鑒定 取ASFV抗體檢測(cè)試紙分別檢測(cè)43 份ASFV 抗體陰性血清及22 份ASFV 抗體陽(yáng)性滅活血清，讀取結(jié)果，計(jì)算假陽(yáng)性率及假陰性率，評(píng)價(jià)試紙準(zhǔn)確性。

1.2.13 ASFV 抗體檢測(cè)試紙穩(wěn)定性鑒定 選擇45 ℃加速試驗(yàn)評(píng)價(jià)ASFV 抗體檢測(cè)試紙穩(wěn)定性，45 ℃下保存37.5 d 相當(dāng)于25 ℃下保存1 a，30 ℃下保存6 個(gè)月[9]。將包裝好的試紙放入45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，每隔5 d 取樣檢測(cè)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清效價(jià)，評(píng)價(jià)試紙穩(wěn)定性。

1.2.14 臨床樣品檢測(cè) 取ASFV 抗體檢測(cè)試紙與ASFV ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)71份田間血清，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算2 種檢測(cè)方法的符合率，評(píng)價(jià)建立試紙的臨床使用價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASFV抗體檢測(cè)試紙構(gòu)建

2.1.1 膠體金質(zhì)量鑒定 膠體金肉眼觀測(cè)表明，膠體金呈酒紅色，顏色透亮、無(wú)沉淀及漂浮物。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示，膠體金的紫外吸收峰峰寬在500～550 nm，峰寬較窄，說(shuō)明膠體金顆粒比較均勻；最大吸收為527 nm 處，經(jīng)計(jì)算得出膠體金粒徑為29 nm。綜上所述，制備的膠體金顆粒均勻，質(zhì)量較好，且顆粒大小適合用于免疫層析方法建立。

圖2 膠體金紫外掃描鑒定Fig.2 Identification chart of colloidal gold by ultraviolet scanning

2.1.2 膠體金標(biāo)記p72 蛋白狀態(tài)選擇及條件確定

同時(shí)優(yōu)化p72 三聚體和多聚體的膠體金標(biāo)記條件，從標(biāo)記過(guò)程中的穩(wěn)定性分析，p72多聚體在標(biāo)記過(guò)程中穩(wěn)定性稍差，金標(biāo)蛋白顏色稍紫，p72三聚體的穩(wěn)定性較好。2種蛋白質(zhì)檢測(cè)性能見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示，三聚體蛋白檢測(cè)陰性樣品時(shí)背景更低，P/N 值更高，結(jié)合標(biāo)記過(guò)程中的穩(wěn)定性，選擇p72三聚體為檢測(cè)蛋白。

圖3 膠體金標(biāo)記p72蛋白量?jī)?yōu)化Fig.3 The optimization of gold labeled p72 protein amount

標(biāo)記條件優(yōu)化：標(biāo)記pH值結(jié)果顯示，當(dāng)1 mL膠體金中K2CO3加入量小于10 μL 時(shí)，膠體金標(biāo)記的過(guò)程不穩(wěn)定，且檢測(cè)陰性血清時(shí)有假陽(yáng)性信號(hào)存在。當(dāng)1 mL 膠體金中K2CO3加入量為12 μL 和14 μL 時(shí)，標(biāo)記穩(wěn)定性及陽(yáng)性值顯色無(wú)明顯區(qū)別，為了保證體積放大后生產(chǎn)過(guò)程中標(biāo)記的穩(wěn)定性，選擇1 mL 膠體金中加入14 μL K2CO3的量調(diào)節(jié)標(biāo)記pH值。最佳標(biāo)記量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示，當(dāng)1 mL膠體金中標(biāo)記量增加至16 μg 時(shí)可以明顯提高顯色強(qiáng)度，且陰性血清背景不增加，當(dāng)加入量增加至20 μg 時(shí)，標(biāo)記過(guò)程中出現(xiàn)金標(biāo)蛋白掛壁的現(xiàn)象，且顯色強(qiáng)度及背景均增加，P/N 值降低，因此，最佳標(biāo)記量確定為1 mL 膠體金中加入16 μg p72 三聚體蛋白較合適。

2.1.3 NC膜噴膜質(zhì)量濃度確定 NC膜噴膜質(zhì)量濃度分析結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4顯示，當(dāng)T線噴膜的質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL 時(shí)P/N 值最高，且N 值最低，隨著SPA 質(zhì)量濃度增加，N 值逐漸增加，為了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，應(yīng)嚴(yán)格控制N 值，因此，選擇0.75 mg/mL 為T 線噴膜質(zhì)量濃度。當(dāng)C 線上p72 單克隆抗體噴膜的質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，顯色清晰，且在檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性樣品時(shí)仍能正常顯色。因此，選擇2 mg/mL 為C 線噴膜條件。

圖4 檢測(cè)線上SPA噴膜質(zhì)量濃度優(yōu)化Fig.4 The optimization of mass concentration of SPA coated on test line

2.1.4 樣品墊配方確定 經(jīng)過(guò)不同因素的調(diào)整，最終確定該試紙樣品墊配方為Tris-HCl（pH 值7.4）中加入PVP-10、酪蛋白鈉、S17及NaN3，金標(biāo)蛋白跑板狀態(tài)正常，N值最低，P/N值較大。

2.1.5 ASFV 抗體檢測(cè)試紙顯色時(shí)間確定 ASFV抗體檢測(cè)試紙顯色時(shí)間結(jié)果見(jiàn)圖5，當(dāng)顯色10 min后，T線顏色基本穩(wěn)定，據(jù)此確定顯色10 min后可讀取結(jié)果。根據(jù)觀測(cè)檢測(cè)過(guò)程中膠體金的釋放情況，10 min 左右金標(biāo)蛋白基本釋放完全，20 min 時(shí)膠體金紅色全部被吸收墊吸收，所有反應(yīng)基本完成?？梢?jiàn)，20 min 是最佳觀測(cè)時(shí)間。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，NC 膜上水分會(huì)蒸發(fā)，可能導(dǎo)致樣品墊上金標(biāo)蛋白復(fù)合物回流等多種不良反應(yīng)，容易造成結(jié)果的假陽(yáng)性。因此，試紙檢測(cè)必須在30 min 內(nèi)判讀結(jié)束。綜上所述，試紙可以在10～30 min 內(nèi)讀取結(jié)果，且在此時(shí)間內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定。比較寬的結(jié)果讀取時(shí)間范圍可以更好地保證大批量樣品檢測(cè)時(shí)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖5 ASFV抗體檢測(cè)試紙顯色時(shí)間確定Fig.5 The optimization of coloring time of ASFV antibody test strip

2.2 ASFV抗體檢測(cè)試紙鑒定

2.2.1 ASFV 抗體檢測(cè)試紙敏感性鑒定及樣品稀釋倍數(shù)選擇 ASFV 抗體檢測(cè)試紙檢測(cè)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清結(jié)果見(jiàn)表1，根據(jù)P/N≥2.1 計(jì)算，該標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的試紙效價(jià)為1∶51 200。使用ASFV ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清效價(jià)為1∶6 400（根據(jù)說(shuō)明書(shū)，S/P＞0.4為陽(yáng)性），因此，該試紙的敏感性優(yōu)于ASFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。

表1 ASFV陽(yáng)性血清試紙效價(jià)Tab.1 The titer of ASFV positive serum detected by test strip

表1 中弱陽(yáng)性血清試紙效價(jià)檢測(cè)結(jié)果顯示，根據(jù)P/N≥2.1 判定為陽(yáng)性血清的標(biāo)準(zhǔn)，血清稀釋倍數(shù)高于100 倍時(shí)無(wú)法判定為陽(yáng)性；結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的試紙效價(jià)結(jié)果，血清稀釋倍數(shù)低于100 倍時(shí)鉤狀效應(yīng)明顯。因此，本研究選擇樣品稀釋倍數(shù)為100倍，既能保證弱陽(yáng)性血清檢出，又可以降低強(qiáng)陽(yáng)性血清的鉤狀效應(yīng)。

2.2.2 ASFV 抗體檢測(cè)試紙?zhí)禺愋澡b定 ASFV 抗體檢測(cè)試紙?zhí)禺愋澡b定結(jié)果見(jiàn)圖6，結(jié)果顯示，試紙不與PRRSV、PPV、PCV2、PRV、CSFV 陽(yáng)性血清及ASFV 陰性血清反應(yīng)。因此，研制的ASFV 抗體檢測(cè)試紙具有很好的特異性。

圖6 ASFV抗體檢測(cè)試紙?zhí)禺愋澡b定Fig.6 Specific evaluation of ASFV antibody test strip

2.2.3 ASFV 抗體檢測(cè)試紙均一性鑒定 均一性鑒定結(jié)果如表2所示，ASFV抗體檢測(cè)試紙的變異系數(shù)為7.9%。通常試紙檢測(cè)的變異系數(shù)小于10%，表明其具有很好的均一性。本研究制備的ASFV 抗體檢測(cè)試紙均一性良好。

表2 ASFV抗體檢測(cè)試紙均一性鑒定Tab.2 Homogeneity evaluation of ASFV antibody test strip

2.2.4 ASFV 抗體檢測(cè)試紙準(zhǔn)確性鑒定 用試紙檢測(cè)43份ASFV抗體陰性血清及22份ASFV抗體陽(yáng)性滅活血清，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7 可知，43 份陰性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性，未見(jiàn)假陽(yáng)性；22 份陽(yáng)性血清均為陽(yáng)性，未見(jiàn)假陰性。說(shuō)明制備的ASFV 抗體檢測(cè)試紙具有很好的準(zhǔn)確性。

圖7 ASFV抗體檢測(cè)試紙準(zhǔn)確性鑒定Fig.7 Accuracy evaluation of ASFV antibody test strip

2.2.5 ASFV 抗體檢測(cè)試紙穩(wěn)定性鑒定 將包裝好的ASFV 抗體檢測(cè)試紙于45 ℃保存，進(jìn)行加速穩(wěn)定試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。試紙?jiān)?5 ℃保存45 d，試紙的敏感性不變，也未出現(xiàn)假陽(yáng)性?？梢?jiàn)，本研究制備的ASFV 抗體檢測(cè)試紙具有很好的穩(wěn)定性，可以室溫保存1 a以上。

2.2.6 ASFV 抗體檢測(cè)試紙臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 用ASFV 抗體檢測(cè)試紙與商業(yè)化ASFV ELISA 試劑盒同時(shí)檢測(cè)71份田間樣品，評(píng)價(jià)該試紙是否可應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可以看出，ELISA試劑盒檢測(cè)出陽(yáng)性樣品14 份，試紙均檢測(cè)出為陽(yáng)性，陽(yáng)性復(fù)合率為100%；ELISA 試劑盒檢測(cè)出陰性樣品52 份，試紙檢測(cè)陰性為51 份，陰性符合率為98.1%；ELISA 試劑盒檢測(cè)出5 份可疑樣品，試紙檢測(cè)均為陽(yáng)性。2種檢測(cè)方法的總符合率為91.6%。

表4 ASFV抗體檢測(cè)試紙臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Tab.4 The detection results of clinical samples by the ASFV antibody test strip

3 結(jié)論與討論

目前，基于p72 蛋白的ASFV 抗體檢測(cè)方法多是采用的截短或單獨(dú)表達(dá)的p72蛋白[28-29]，蛋白質(zhì)狀態(tài)以不均一的聚集物存在。利用pB602L 與p72 蛋白共表達(dá)時(shí)，可以獲得折疊正確、均勻分布的三聚體狀態(tài)[30]，而本研究選擇與伴侶分子pB602L共表達(dá)的p72 重組蛋白，再利用分子篩將p72 的三聚體及多聚體分離，然后分別作為檢測(cè)蛋白構(gòu)建試紙，對(duì)比不同形態(tài)的p72蛋白對(duì)免疫層析試紙檢測(cè)性能的影響，經(jīng)對(duì)比以三聚體形式存在的p72 蛋白具有更好的敏感性、穩(wěn)定性及特異性。本研究結(jié)果提示，在蛋白質(zhì)純化的過(guò)程中重組蛋白的不同狀態(tài)對(duì)產(chǎn)品性能的影響也非常明顯，在純化及保存的過(guò)程中應(yīng)該充分考慮蛋白質(zhì)狀態(tài)并對(duì)其進(jìn)行控制，從而保證產(chǎn)品檢測(cè)性能的穩(wěn)定。

SPA是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，能與多種哺乳動(dòng)物的IgG 及少量的IgM 和IgA特異性結(jié)合，對(duì)豬、狗、兔、人、猴、鼠及牛等種屬IgG親和力較強(qiáng)；對(duì)大白鼠、綿羊等種屬的IgG 親和力稍差；基本不與馬、山羊等哺乳動(dòng)物IgG 反應(yīng)，常被用于廣譜二抗使用，且具有多種優(yōu)勢(shì)：首先SPA 可以通過(guò)表達(dá)純化獲得，制備及純化簡(jiǎn)單、分子高度均一、性質(zhì)穩(wěn)定且不受Fc 受體影響；其次SPA 與IgG的親和力比傳統(tǒng)二抗強(qiáng)，可以大大提高檢測(cè)敏感性；而且SPA 可以和多種屬的IgG 反應(yīng)，制備的檢測(cè)產(chǎn)品不僅可以檢測(cè)豬血清，對(duì)野豬、鼠、狗等種屬同樣適用。因此，本研究選擇SPA 為攔截線，可以提高檢測(cè)敏感性及適用范圍。WAN 等[28]利用重組的p30 蛋白及截短的p54 蛋白建立了雙重ASFV 抗體檢測(cè)試紙，檢測(cè)敏感性為1∶256，與商業(yè)化ELISA 試劑盒相當(dāng)。ZHU 等[29]以酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的p72 蛋白，建立了ASFV 抗體檢測(cè)試紙，檢測(cè)敏感性為1∶10 000。本研究制備的ASFV 抗體檢測(cè)試紙，檢測(cè)敏感性為1∶51 200，有效提高了試紙的檢測(cè)敏感性。

間接法免疫層析試紙檢測(cè)血清中抗體時(shí)會(huì)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，就是當(dāng)抗體濃度過(guò)高時(shí)試紙顯色反而會(huì)降低，其原因?yàn)闃悠分写嬖诖罅康目贵w，一部分抗體在流經(jīng)結(jié)合墊時(shí)與金標(biāo)蛋白反應(yīng)形成金標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，但是流經(jīng)攔截線時(shí)，樣品中大量的游離抗體封閉了SPA 的攔截位點(diǎn)，從而降低了二抗攔截金標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的能力，造成顯色強(qiáng)度降低，甚至?xí)霈F(xiàn)假陰性結(jié)果，為了避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，通?？梢酝ㄟ^(guò)增加稀釋倍數(shù)的方法解決。但是對(duì)于弱陽(yáng)性血清增加了稀釋倍數(shù)就會(huì)造成檢測(cè)敏感性降低，因此，樣品稀釋倍數(shù)的選擇對(duì)免疫層析試紙產(chǎn)品檢測(cè)準(zhǔn)確性非常重要。本研究根據(jù)強(qiáng)陽(yáng)性血清及弱陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果綜合分析，確定樣品稀釋倍數(shù)為100 倍，既能保證弱陽(yáng)性血清檢出，也能降低強(qiáng)陽(yáng)性血清的鉤狀效應(yīng)，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

間接法免疫層析試紙的C線為抗檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗體，通過(guò)攔截金標(biāo)蛋白顯色，因此當(dāng)檢測(cè)樣品為陽(yáng)性時(shí)，金標(biāo)蛋白-抗體復(fù)合物會(huì)被T 線攔截，從而導(dǎo)致C 線顯色信號(hào)降低，甚至?xí)霈F(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性血清時(shí)C線不顯色的情況，因此，在試紙制備過(guò)程中可以適當(dāng)增加金標(biāo)蛋白的量及C 線噴膜濃度，改善C 線的顯色?；蛘卟捎锚?dú)立的C 線顯色系統(tǒng)，比如生物素親和素等建立與試紙本身不反應(yīng)的一組獨(dú)立的組分進(jìn)行標(biāo)記和C線的噴涂，從而保證C線顯色。

關(guān)于臨床樣品檢測(cè)符合率的問(wèn)題，本研究選擇的ELISA 試劑盒設(shè)置了0.3＜S/N＜0.4為可疑區(qū)間，本次檢測(cè)的臨床樣品中有5 份的可疑樣品，試紙檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，從而造成了本研究符合率偏低的結(jié)果。試紙檢測(cè)敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該試紙的檢測(cè)敏感性要高于ELISA 試劑盒，因此將試劑盒判為可疑的樣品檢測(cè)為陽(yáng)性是試紙敏感性較高的體現(xiàn)，可以更早地診斷出ASFV 感染的存在，從而更好地實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)剔除”，控制ASFV疫情。

本研究選擇p72 重組蛋白三聚體為檢測(cè)蛋白，以SPA 為攔截線，經(jīng)膠體金標(biāo)記條件、NC 膜噴膜條件、樣品墊緩沖體系及成分、顯色時(shí)間等因素優(yōu)化，確定ASFV 抗體檢測(cè)試紙產(chǎn)品化的具體參數(shù)，建立了ASFV 抗體檢測(cè)試紙，并對(duì)試紙的特異性、均一性、準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性進(jìn)行了鑒定，為ASFV 抗體檢測(cè)試紙的推廣應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

本研究確定了ASFV 抗體檢測(cè)試紙的產(chǎn)品化參數(shù)；以p72 重組蛋白三聚體為檢測(cè)抗原；1 mL 膠體金中加入14 μL 0.2 mol/L K2CO3、16 μg p72 蛋白三聚體為膠體金標(biāo)記條件；以0.75 mg/mL SPA 噴涂T線，2 mg/mL p72 單克隆抗體噴涂C 線；以Tris-HCl（pH 值7.4）含PVP-10、酪蛋白鈉、S17 及NaN3為樣品墊處理液；檢測(cè)10～30 min 判定結(jié)果。對(duì)建立的ASFV 抗體檢測(cè)試紙的檢測(cè)性能進(jìn)行鑒定，試紙的檢測(cè)敏感性為1∶51 200，優(yōu)于商業(yè)化ASFV ELISA檢測(cè)試劑盒；試紙不與PRRSV、PPV、PCV2、PRV、CSFV 陽(yáng)性血清及ASFV 陰性血清反應(yīng)，具有良好的特異性；變異系數(shù)為7.9%，具有良好的均一性；在臨床樣本檢測(cè)中未見(jiàn)假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果，具有良好的準(zhǔn)確性；經(jīng)加速穩(wěn)定試驗(yàn)驗(yàn)證，可以室溫保存1 a以上；與進(jìn)口商品化試劑盒的總符合率為91.6%。本研究制備的試紙檢測(cè)性能良好，可以滿足商業(yè)化需求，為基層ASFV 抗體的快速檢測(cè)提供了技術(shù)手段。