楊文俊，許楠，董家瑞，黃天豐，李潤(rùn)林

1 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江都人民醫(yī)院麻醉科，江蘇揚(yáng)州 225200；2 江蘇省蘇北人民醫(yī)院麻醉科

目前腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，同時(shí)缺乏有效的治療藥物［1-2］。研究表明，神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡等可引起神經(jīng)細(xì)胞損傷進(jìn)而促進(jìn)腦缺血再灌注損傷的發(fā)生［3-4］。利多卡因是常用的一種酰胺類麻醉藥物，具有抗炎作用，并可能通過抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生減輕急性肺損傷［5］。但利多卡因與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的相關(guān)研究相對(duì)較少。miR-125b-5p 在急性心肌梗死中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡從而改善急性心肌梗死后心臟功能［6］。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡等過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，激活該信號(hào)通路可抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖［7］。但miR-125b-5p/PI3K/Akt 信號(hào)軸在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制尚未有研究報(bào)告。2019 年11 月—2020 年10 月，本研究采用氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞（PC12 細(xì)胞）損傷，探討利多卡因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 PC12細(xì)胞購自上海弘順生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國(guó)Gibco 公司；RNeasy Mini Kit 試劑購自北京全式金生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑購自美國(guó)Thermo Fisher 公司；Lipofectamine2000、3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）試劑與凋亡檢測(cè)試劑購自北京索萊寶科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；miR-125b-5p 模擬物（miR-125b-5p mimics）、miR-125b-5p 抑制劑（anti-miR-125b-5p），模擬物及抑制劑陰性對(duì)照（miR-NC，anti-miR-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗鼠剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）、Bcl2 關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）一抗、二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）一抗購自美國(guó)Santa Cruz公司。低溫離心機(jī)購自德國(guó)Eppendorf公司；超低溫冰箱購自中國(guó)海爾電器優(yōu)先公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；恒溫水浴鍋購自上海赫田科學(xué)儀器有限公司，超凈工作臺(tái)購自上海赫田科學(xué)儀器有限公司；移液槍購自德國(guó)Eppendorf公司；PCR 儀購自德國(guó)Eppendorf 公司；渦旋振蕩器否自海門市其林貝爾公司；7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自美國(guó)ABI公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞從超低溫冰箱中取出，置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍后，1 000 r/min離心5 min（半徑17.5 cm），棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入適量含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，反復(fù)吸打至細(xì)胞充分溶解，于滅菌的培養(yǎng)瓶中裝入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，隨后在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 天更換1 次新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄上清液，PBS洗滌后用胰蛋白酶進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞開始漂浮、細(xì)胞形態(tài)在倒置顯微鏡下觀察呈圓形時(shí)，加入適量完全培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min 離心3 min（半徑17.5 cm），棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液接種至培養(yǎng)瓶，在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù)、轉(zhuǎn)染方法 將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組、miR-NC+模型組、miR-125b-5p+模型組、anti-miRNC+高濃度組、anti-miR-125b-5p+高濃度組。對(duì)照組為正常培養(yǎng)的PC12 細(xì)胞。模型組細(xì)胞接種于無糖平衡鹽溶液中，于37 ℃下5% CO2、1% O2、94% N2培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧處理6 h，棄培養(yǎng)基并更換為含有4.5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基，于37 ℃下5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧24 h［8］，制備OGD/R 細(xì)胞模型。低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞接種于6孔板（1×105/孔）分別加入2.5、5、10 μmol/L利多卡因共孵育24 h［9］，進(jìn)行OGD/R 處理。miR-NC+模型組、miR-125b-5p+模型組細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將miR-NC、miR-125b-5p mimics 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后，進(jìn)行OGD/R處理。anti-miR-NC+高濃度組、antimiR-125b-5p+高濃度組分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、antimiR-125b-5p，轉(zhuǎn)染成功后加入濃度為10 μmol/L 利多卡因的培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行OGD/R處理。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT 法。收集各組細(xì)胞，接種于96 孔板，2×103/孔；每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，棄細(xì)胞上清液，用DMSO 溶液溶解形成的MTT 晶體，用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)490 nm處吸光度值（A值）。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化處理，1 000 g離心5 min（半徑6 cm），去上清液后，將細(xì)胞（1×106）重新懸浮在結(jié)合緩沖液中。用Annexin V-FITC （5 μL）和PI（5 μL）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡率。

1.6 miR-125b-5p 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取各組細(xì)胞，用RNeasy Mini Kit 試劑分離總RNA，用外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度后，將總RNA 合成cDNA，隨后采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、MgSO42.5 μL、正反向引物各0.5 μL、dNTPs 2.5 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40 個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸10 min。在延伸階段收集熒光信號(hào)，計(jì)算樣品的Ct 值并通過2-ΔΔCt法計(jì)算miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.7 凋亡相關(guān)蛋白（Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白）、PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白（p-PI3K、p-Akt蛋白）表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。取各組細(xì)胞，用RIPA裂解緩沖液收集細(xì)胞提取物，并通過BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)樣品裝載40 μg 蛋白質(zhì)到10% SDS-PAGE 上進(jìn)行分離，然后將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。將膜封閉在5%脫脂牛奶中，加入Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、p-PI3K（1∶800）、p-Akt（1∶800）一抗與內(nèi)參β-actin抗體（1∶2 000）稀釋液，4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液（1∶3 000）37 ℃孵育2 h。用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶，用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)［丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）］檢測(cè) 采用微板法、WST-1 法及鉬酸銨法進(jìn)行檢測(cè)。收集各組細(xì)胞，棄上清，收集細(xì)胞，用反復(fù)凍融法進(jìn)行裂解，將上清液轉(zhuǎn)移至試管中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試管加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白試管中加入蒸餾水，以上試管中均加入反應(yīng)液，孵育1 h，500 g 離心5 min（半徑6 cm），取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)532、450、405 nm 處的吸光度值（A 值）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利多卡因?qū)GD/R 誘導(dǎo)后PC12 細(xì)胞活力的影響 對(duì)照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力（A值）分別為1.12 ± 0.10、0.53 ± 0.05、0.67 ± 0.06、0.86 ± 0.07、1.03 ± 0.08。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力低（P＜0.05）；與模型組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力高（P均＜0.05）；不同濃度組細(xì)胞活力（A 值）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。相對(duì)于模型組，高濃度組細(xì)胞活力恢復(fù)接近50%，所以選擇高濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 利多卡因?qū)GD/R 誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激的影響 見表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

表1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低濃度組比較，&P＜0.05；與中濃度組比較，△P＜0.05。

組別細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)CAT（U/mg）11.63 ± 0.93 4.37 ± 0.37*6.03 ± 0.51#8.86 ± 0.72#&10.38 ± 0.91#&△Cleaved-caspase-3 0.38 ± 0.03 0.86 ± 0.07*0.73 ± 0.06#0.58 ± 0.04#&0.41 ± 0.04#&△凋亡率（%）9.02 ± 0.73 28.76 ± 2.28*23.74 ± 1.86#15.18 ± 1.18#&11.53 ± 0.82#&△SOD（U/mg）17.19 ± 1.51 5.37 ± 0.41*7.61 ± 0.55#11.91 ± 1.01#&15.48 ± 1.27#&△Bax 0.45 ± 0.03 0.93 ± 0.07*0.80 ± 0.08#0.62 ± 0.05#&0.51 ± 0.04#&△MDA（μmol/g）17.13 ± 1.23 34.27 ± 2.93*29.13 ± 1.87#23.04 ± 1.52#&19.53 ± 1.63#&△對(duì)照組模型組低濃度組中濃度組高濃度組

2.3 利多卡因?qū)GD/R 誘導(dǎo)后PC12 細(xì)胞miR-125b-5p表達(dá)的影響 對(duì)照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組miR-125b-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.08、0.38 ± 0.03、0.49 ± 0.03、0.63 ± 0.06、0.86 ± 0.08。與對(duì)照組比較，模型組miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)量低（P＜0.05）；與模型組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)量高（P均＜0.05）；低濃度組、中濃度組、高濃度組miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)量依次升高（P均＜0.05）。

2.4 miR-125b-5p 高表達(dá)對(duì)OGD/R 誘導(dǎo)后PC12 細(xì)胞的影響 miR-NC+模型組、miR-125b-5p+模型組miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.09、2.31 ±0.18，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功。

與miR-NC+模型組比較，miR-125b-5p+模型組細(xì)胞活力（A值）高，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)低，MDA 水平低，SOD、CAT 水平高（P均＜0.05），見表2。

表2 miR-NC+模型組與miR-125b-5p+模型組細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

表2 miR-NC+模型組與miR-125b-5p+模型組細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

組別miR-NC+模型組miR-125b-5p+模型組P細(xì)胞活力（A值）0.54 ± 0.04 1.07 ± 0.09＜0.05細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)凋亡率（%）28.72 ± 2.31 10.05 ± 0.91＜0.05 Cleaved-caspase-3 0.87 ± 0.08 0.37 ± 0.03＜0.05 Bax 0.94 ± 0.08 0.42 ± 0.03＜0.05氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA（μmol/g）34.35 ± 3.10 15.83 ± 0.98＜0.05 SOD（U/mg）5.41 ± 0.42 17.04 ± 1.25＜0.05 CAT（U/mg）4.41 ± 0.36 14.59 ± 1.17＜0.05

2.5 miR-125b-5p低表達(dá)對(duì)利多卡因作用的影響anti-miR-NC+高濃度組、anti-miR-125b-5p+高濃度組miR-125b-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.08、0.45 ±0.03，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與antimiR-NC+高濃度組比較，anti-miR-125b-5p+高濃度組細(xì)胞活力（A 值）低，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量高，MDA 水平高，SOD、CAT水平低（P均＜0.05）。見表3。

表3 anti-miR-NC+高濃度組與anti-miR-125b-5p+高濃度組細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

表3 anti-miR-NC+高濃度組與anti-miR-125b-5p+高濃度組細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（± s）

組別miR-NC+模型組miR-125b-5p+模型組P細(xì)胞活力（A值）1.031 ± 0.09 0.513 ± 0.05＜0.05細(xì)胞凋亡率（%）11.48 ± 0.93 25.13 ± 1.89＜0.05 Cleaved-caspase-3 0.42 ± 0.04 0.84 ± 0.08＜0.05 Bax 0.49 ± 0.04 0.91 ± 0.08＜0.05 MDA（μmol/g）19.61 ± 1.52 36.07 ± 2.27＜0.05 SOD（U/mg）15.51 ± 1.08 6.10 ± 0.51＜0.05 CAT（U/mg）10.32 ± 0.85 4.93 ± 0.41＜0.05

2.6 miR-125b-5p 低表達(dá)對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見表4。

表4 各組PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s）

表4 各組PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與antimiR-NC+高濃度組比較，&P＜0.05。

p-Akt 0.63 ± 0.06 0.29 ± 0.02*0.69 ± 0.06#0.67 ± 0.06 0.31 ± 0.03&組別對(duì)照組模型組高濃度組anti-miR-NC+高濃度組anti-miR-125b-5p+高濃度組p-PI3K 0.81 ± 0.07 0.39 ± 0.04*0.83 ± 0.07#0.82 ± 0.07 0.40 ± 0.04&

3 討論

利多卡因是一種酰胺類局部麻醉劑，可注射也可作表面麻醉用于緩解臨床治療中的局部疼痛、神經(jīng)性疼痛和痛覺過敏［10］。然而，除了多種麻醉作用外，利多卡因還被證實(shí)在多種疾病中具有治療作用。有研究表明，利多卡因可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，從而抑制胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥的生長(zhǎng)［11-12］；可抑制糖尿病大鼠體內(nèi)炎癥因子的分泌以及血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，改善血管壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而參與糖尿病心血管疾病的治療［13］；抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，改善缺氧誘導(dǎo)的心機(jī)損傷［14］。此外，利多卡因可通過抑制氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元死亡和凋亡，從而改善缺血/再灌注小鼠的腦損傷［15］。以上結(jié)果證實(shí)，利多卡因可緩解缺血再灌注損傷。本研究采用OGD/R 刺激神經(jīng)元細(xì)胞，體外模仿腦缺血再灌注損傷環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞活力受到抑制，凋亡增加，與之前研究［16］結(jié)果一致。進(jìn)一步分析表明，利多卡因可逆轉(zhuǎn)OGD/R 介導(dǎo)的細(xì)胞活力抑制及凋亡；Caspase-3 激活后產(chǎn)生Cleaved caspase-3，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵活性形式，此外，Bax 是一個(gè)促癌蛋白。本研究還發(fā)現(xiàn)，利多卡因抑制模型組中Cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)，進(jìn)一步表明利多卡因可逆轉(zhuǎn)OGD/R介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，利多卡因降低OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞中MDA 水平，升高SOD、CAT 水平，與之前研究［17］結(jié)果相似。提示利多卡因可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。

有研究表明，miRNA 在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)異常，并可通過靶向調(diào)控靶mRNA 表達(dá)從而參與腦缺血再灌注損傷過程，還可能作為減輕腦缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)［18-19］。心肌缺血再灌注損傷后miR-125b-5p表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制缺氧/再灌注誘導(dǎo)的小鼠心房肌細(xì)胞凋亡，從而減輕細(xì)胞損傷［20］。急性肺損傷患者低表達(dá)miR-125b-5p，體外上調(diào)其在細(xì)胞中的表達(dá)可通過細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)緩解細(xì)胞損傷［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞中miR-125b-5p表達(dá)下調(diào)，而利多卡因可升高miR-125b-5p表達(dá)，提示利多卡因可能通過上調(diào)miR-125b-5p表達(dá)而抑制腦缺血再灌注損傷。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，細(xì)胞中miR-125b-5p過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)OGD/R介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)，增殖抑制以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，而抑制其表達(dá)可逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)GD/R誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。提示利多卡因可通過上調(diào)miR-125b-5p表達(dá)發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的抗氧化作用，促進(jìn)細(xì)胞存活。

PI3K 被激活后形成p-PI3K，進(jìn)而激活下游基因Akt磷酸化形成p-Akt，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡，從而參與多種疾病的發(fā)展［22］。本研究結(jié)果顯示，OGD/R 誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)降低，而利多卡因可升高p-PI3K、p-Akt 表達(dá)，抑制miR-125b-5p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)利多卡因的以上作用。提示利多卡因可通過miR-125b-5p/PI3K/Akt 信號(hào)軸減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，利多卡因可促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激，該作用可能與miR-125b-5p/PI3K/Akt信號(hào)軸有關(guān)。