蔣君 王德婧

基金項目：貴州省科技廳聯(lián)合基金（20177104）、貴州省中醫(yī)藥管理局項目（2018072）、貴州省科技廳科技成果應用與產(chǎn)業(yè)化項目（20194447）、貴州省衛(wèi)生健康委科學技術基金項目（2022146）和遵義醫(yī)科大學博士基金（201704）

摘要：細胞外囊泡（EV）是磷脂雙層膜結構的納米級囊泡，富含源自親代細胞的生物分子如核酸、代謝產(chǎn)物、蛋白質和脂質類物質等，主要負責細胞間通訊及信號傳遞和物質運輸交流，對靶細胞功能產(chǎn)生影響。近年來不孕癥發(fā)病率逐年升高，排卵障礙在不孕因素中占比較高。非編碼RNA參與卵泡發(fā)育的一系列生理和病理過程，在女性不孕癥中發(fā)揮重要作用。本綜述系統(tǒng)介紹了EV種類和生物學功能，重點探討EV和非編碼RNA對顆粒細胞功能、卵母細胞成熟、排卵和黃體形成及甾體類激素合成的影響，闡述其對卵泡發(fā)育的調(diào)控研究，為不孕癥的診治提供新思路和切入點。

關鍵詞：細胞外囊泡；非編碼RNA；生物分子；卵泡發(fā)育

中圖分類號： R711.6? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0821-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15293

Advances in the Regulation of Follicular Development by Extracellular Vesicles and Non-Coding RNAs

JIANG Jun，WANG Dejing

Department of Reproductive Medicine，Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000，China

Corresponding author：WANG Dejing? Tel：13984242677，E-mail：2430085462@qq.com

ABSTRACT：Extracellular vesicles （EV），nanoscale vesicles encapsulated by phospholipid bilayers，are rich in biological molecules such as nucleic acids，metabolites，proteins，and lipids derived from parental cells.They are mainly involved in intercellular communication，signal transmission，and material transport and affect the functions of target cells.Ovulation disorders account for a higher proportion in the factors causing infertility which demonstrates increasing incidence year by year.Non-coding RNAs participate in a series of physiological and pathological processes of follicular development，playing a key role in female infertility.This review systematically introduces the types and biological roles of EV and elaborates on the regulation of follicular development from the effects of EV and non-coding RNAs on granulosa cell function，oocyte maturation，ovulation，luteal formation，and steroid hormone synthesis，providing a new idea and a breakthrough point for the diagnosis and treatment of infertility.

Key words：extracellular vesicles；non-coding RNA；biological molecules；follicular development

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：821-826

目前全球育齡夫婦不孕不育發(fā)病率高達8％～12％，成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病之外的第三大疾病［1-2］。隨著我國人口老齡化和出生人口斷崖式下降，不孕癥的危害不容忽視。排卵障礙是引起女性不孕的主要原因之一，排卵障礙性不孕患者占女性不孕癥患者的25%～30%，主要是女性卵泡發(fā)育不良或卵泡排卵異常導致。越來越多證據(jù)表明卵泡發(fā)育的生理和病理過程受細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）及非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）調(diào)控。

EV是從細胞膜上靜息脫落或細胞受刺激而釋放出來的磷脂雙層膜結構的小囊泡，包載源自親代細胞的生物分子如蛋白質、脂質、核酸及代謝產(chǎn)物等，以自分泌、旁分泌或受體結合等方式運輸至靶細胞，可調(diào)節(jié)靶細胞的表型和生物學功能，有助于細胞間的交流［3-4］。EV還參與細胞存活與凋亡、細胞遷移、血管新生、腫瘤侵襲等生理病理過程。因此，介導生物分子的EV也可作為各種疾病診斷、預后及治療靶點的重要載體。

EV概述

EV種類? EV可在活細胞上產(chǎn)生和釋放，進化后仍保存完好的囊泡，且廣泛分布于各種生物流體中，如血液、唾液、腦脊液、尿液及卵泡液等［5］。依據(jù)粒徑和定義的不同將EV分為4個亞群：外泌體（exosomes，EX）［6］、微囊泡（microvesicles，MV）［7］、凋亡小體［8］和癌小體［9］（表1）。目前研究最多的亞群是EX和MV，但囊泡大?。ㄖ睆剑┐嬖谥丿B，沒有明確特殊標記可以區(qū)分出來，因此分離得到的囊泡被研究者統(tǒng)稱為EV［10］。

EV生物學功能? EV具有獨特能力，可穩(wěn)定攜帶大量生物活性分子，并將這些分子經(jīng)過血液或體液途徑遠程運輸至特定靶細胞，重新編輯翻譯成對應靶蛋白，產(chǎn)生生物功能。因此，EV被稱為天然運輸載體。EV中具有生物活性的蛋白質通常被分為兩類：（1）參與囊泡產(chǎn)生過程的保守蛋白質；（2）在信號轉導和免疫應答等不同生理病理條件下發(fā)揮特異性作用且與細胞來源有關的蛋白質［11］。EV中包含的多種脂質，如甾醇脂質、脂肪?；|、甘油酯、甘油磷脂和鞘脂等，可增強EV在環(huán)境中的穩(wěn)定性，促進與受體細胞的結合或在親代細胞攝取大分子物質方面發(fā)揮作用［12］。

核酸種類頗多，功能廣泛，包含DNA和RNA（編碼RNA和ncRNA），但對于RNA中ncRNA過去認知甚少，隨著全基因組和高通量測序技術高速發(fā)展和廣泛應用，研究人員發(fā)現(xiàn)在人類基因組中約90％的DNA序列可轉錄產(chǎn)生ncRNA ［13］。近年來研究顯示ncRNA在許多生物發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，目前已成為研究熱點的小分子物質。ncRNA包含兩種類型：基礎結構型ncRNA和調(diào)控型ncRNA，目前研究與卵泡發(fā)育調(diào)控有關的ncRNA主要有微小RNA（microRNA，miRNA）［14］、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）［15-16］和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）［17］3大類（表2）。ncRNA中關于miRNA研究頗多，已有多篇文獻報道了miRNA在女性生殖系統(tǒng)疾病中作為檢測和治療的關鍵靶標，但lncRNA、circRNA是否具有同樣生物標志物能力，相關研究較少。本文就EV和ncRNA對卵泡發(fā)育調(diào)控研究進行綜述。

EV對卵泡發(fā)育調(diào)控作用

EV作為天然載體，在機體健康和疾病狀態(tài)下均能被觀察到，通過維持細胞內(nèi)平衡和在免疫防御過程中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)當機體缺氧、炎癥反應、氧化應激等病理因素刺激下EV的產(chǎn)生數(shù)量明顯增加［18-19］，提示卵泡發(fā)育過程發(fā)生病理反應時EV含量會出現(xiàn)相應變化，同時ncRNA也會出現(xiàn)異常表達，這些都有可能成為疾病診斷的生物標志物及治療上新靶點。

近年研究發(fā)現(xiàn)，EV由細胞分泌進入細胞外基質，攜帶的生物分子可調(diào)節(jié)生殖細胞的發(fā)育，通過差異表達的ncRNA參與卵泡發(fā)育的各個階段。多項研究表明，EV-miRNA通過與目標信使RNA結合，轉錄后調(diào)節(jié)基因的表達，產(chǎn)生對mRNA降解或抑制翻譯的生物功能，參與卵泡相關信號通路，如miR-184可促進靶細胞的增殖，其異常表達也可影響卵泡發(fā)育過程中卵巢顆粒細胞（granulosa cell，GC）的增殖。劉輝等［20］發(fā)現(xiàn)在多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者卵巢GC的EX中miR-184呈高表達，參與卵泡發(fā)育病理過程，促使PCOS形成。EV-miRNA參與卵母細胞的成熟過程，研究發(fā)現(xiàn)牛卵泡液中EX-miRNA在卵母細胞完全生長直徑為4～8 mm時，其上調(diào)的miRNA通過泛素介導、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號、絲裂原活化蛋白激酶信號和TGF-β信號等通路精確調(diào)控著卵泡激素，促進卵母細胞分裂、生長成熟［21-22］。Sang等［23］鑒定出人卵泡液中MV和上清液中均存在miRNA，發(fā)現(xiàn)高表達的miRNA可靶向于生殖、內(nèi)分泌和代謝過程中的相關基因，其中miR-132、miR-320、miR520c-3p、miR-24和miR-222參與調(diào)節(jié)雌二醇濃度，miR-24、miR-193B和miR-483-5p參與調(diào)節(jié)孕酮濃度。

目前已知EV-lncRNA和EV-circRNA參與調(diào)控卵泡發(fā)育的過程，但EV-lncRNA和EV-circRNA對卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)的研究仍處于起步階段。lncRNA在組織細胞表達和發(fā)育階段方面具有較強特異性，通過染色質修飾、RNA結合蛋白和競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡的相互作用，促使細胞增殖、分化及凋亡［24］。劉琳等［25］通過高通量測序檢測發(fā)現(xiàn)卵泡液中的EV-lncRNA存在1866個差異表達lncRNA基因，進一步研究發(fā)現(xiàn)差異表達lncRNA在卵母細胞減數(shù)分裂以及胰島素信號通路、胰島素抵抗中起著重要作用，可能影響著卵泡發(fā)育過程。反向剪接的circRNA特殊環(huán)狀結構可穩(wěn)定存在于EV中，對miRNA發(fā)揮海綿作用，間接調(diào)控靶基因，發(fā)揮生物學功能。Huang等［26］報道了PCOS組和對照組患者之間卵泡液中EX的circRNA表達譜分析，發(fā)現(xiàn)16個circRNA差異表達顯著，通過生物信息分析，顯示親本基因富含PCOS相關通路，包括卵巢類固醇生成、醛固酮合成和分泌以及酪氨酸激酶-信號轉導與轉錄激活子（JAK-STAT）信號通路等，進一步體外實驗驗證circLDLR缺失降低miR-1294功能并抑制CYP19A1表達，降低雌二醇的分泌，從而影響卵泡發(fā)育和排卵。

EV可通過調(diào)控細胞生長因子表達來誘導卵泡閉鎖，如EV調(diào)節(jié)表皮生長因子在卵泡GC增殖和卵泡細胞成熟過程中發(fā)揮顯著促進作用［27］。卵泡異常閉鎖是影響卵泡發(fā)育關鍵因素之一。在每個性周期過程中會產(chǎn)生大量的卵泡，僅有少許卵泡發(fā)育成熟，大多數(shù)出現(xiàn)卵泡閉鎖，但卵泡異常閉鎖會導致PCOS和卵巢早衰等疾病產(chǎn)生。轉化生長因子-α在卵泡發(fā)育及成熟過程中逐漸出現(xiàn)表達下降，可參與卵母細胞生長、卵泡細胞增殖和黃體細胞凋亡［28］。轉化生長因子-β可調(diào)節(jié)誘導垂體分泌促卵泡生成素，協(xié)同促卵泡生成素促進卵泡發(fā)育［29］。

ncRNA對卵泡發(fā)育調(diào)控作用

GC功能、卵母細胞成熟、排卵和黃體形成或甾體類激素合成等過程中任意環(huán)節(jié)的異常都會導致卵泡發(fā)育異?；蚺怕颜系K的出現(xiàn)。不同組織或細胞來源的ncRNA在卵泡發(fā)育過程發(fā)揮著重要作用。Mu等［30］納入67篇系統(tǒng)綜述和9篇文獻薈萃分析顯示PCOS患者的血漿、血清、卵泡液、GC等組織中觀察到大量變化的ncRNA，失調(diào)的ncRNA是PCOS致病的一個重要因素，有可能成為診斷生物標志物和治療靶點。

miRNA在卵泡發(fā)育中作用? GC是組成卵泡的最大細胞亞群。目前多項研究表示，miRNA在轉錄后水平上負性調(diào)節(jié)靶基因表達，可解除其對下游靶基因的抑制，使靶基因表達水平上調(diào)，完成轉錄后水平的調(diào)控，參與細胞內(nèi)信號通路轉導和調(diào)控GC增殖與凋亡。Zhang等［31］研究發(fā)現(xiàn)卵巢組織或體外細胞上miR-181a可靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1下調(diào)，誘導叉頭框轉錄因子O亞家族1的去乙?；副磉_，增強叉頭框轉錄因子O亞家族1表達，促進GC的凋亡。miRNA失調(diào)涉及多種疾病，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤、炎性疾病、糖尿病或PCOS等疾病中均可觀察到miRNA表達水平異常［32］。Sinha等［33］研究發(fā)現(xiàn)在體外成熟過程中抑制miR-130b的表達，可減少第一極體的排出，降低卵母細胞達到第二次減數(shù)分裂中期的比例和線粒體活性，證明miR-130b參與牛卵母細胞成熟過程。miRNA也影響卵泡排卵，通過與GC中的促卵泡生成素途徑相互作用直接來調(diào)節(jié)卵泡生成［34］。2009年首次證明了miRNA可以調(diào)節(jié)人類生殖代謝和激素過程，控制卵巢孕激素、雄激素和雌激素增強或抑制釋放［35］?；駽YP19A1編碼細胞色素P450芳香化酶是雌激素合成的限速酶，miR-199水平高表達可抑制芳香化酶CYP19A1的合成與代謝，導致雄激素過高，抑制卵泡的選擇性生長，從而引發(fā)PCOS［36］。miR-27a-3p可能通過靶向環(huán)磷酸腺苷應答元件結合蛋白1（Creb1），抑制其下游靶基因CYP19A1的信號通路，影響卵泡發(fā)育［37］。

lncRNA在卵泡發(fā)育中作用? lncRNA可多層面控制基因表達，與miRNA相互作用后共同調(diào)節(jié)其mRNA靶標，參與創(chuàng)建不同細胞過程的動態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。有研究發(fā)現(xiàn)，高齡產(chǎn)婦第二次減數(shù)分裂中期（MⅡ）的卵母細胞外圍的卵丘細胞上存在差異表達的lncRNA，參與了卵巢卵泡發(fā)育和女性生殖細胞成熟關鍵信號通路的競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡［38］。lncRNA在GC中起著關鍵調(diào)控因子作用，如lncRNA HCG26可以抑制細胞增殖和細胞周期進程［39］。Huang等［40］研究lncRNA中的Prader-Willi區(qū)域非蛋白編碼RNA2（PWRN2），發(fā)現(xiàn)PWRN2與PCOS患者的卵母細胞核成熟有關，且通過減少miR-92b-3P與TMEM120B靶結合，影響卵母細胞發(fā)育。此外，lncRNA-Y00062參與NEK7基因的調(diào)控，而NEK7是紡錘體組裝和有絲分裂所必需的基因，lncRNA-Y00062可能在調(diào)節(jié)卵母細胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用［41］。卵泡排卵后受促黃體生長素的作用形成具有內(nèi)分泌功能的黃體，lncRNA富核轉錄因子1（Neat1）在此過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明人絨毛膜促性腺激素（hCG）注射雌性小鼠后，lncRNA Neat1首先表達于竇卵泡的GC上，48 h后在黃體細胞表達達到頂峰，之后逐漸下降，推測其與黃體的形成有關。敲減Neat1基因表達的小鼠出現(xiàn)不能成功懷孕現(xiàn)象，表明lncRNA Neat1基因可影響黃體形成及孕酮分泌，致使生殖功能下降［42］。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與甾體類激素合成，lncRNA Gm2044作為miR-138-5p的競爭性內(nèi)源RNA，可解除miR-138-5p對Nr5a1的抑制作用，進而調(diào)節(jié)17β-雌二醇的合成［43］。

circRNA在卵泡發(fā)育中作用? circRNA是一種新型的ncRNA，豐度遠高于其同源線性轉錄本，也是一種穩(wěn)定存在于多個物種中的宿主基因，可參與多種疾病的進展，主要充當RNA海綿作用。Liu等［44］報道卵巢組織circPSMC3可阻滯細胞周期進程，通過海綿miR-296-3p調(diào)節(jié)第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白基因（PTEN）來抑制KGN的增殖，促進細胞凋亡。Lu等［45］從不同分子調(diào)控機制方面報道沉默circ-RANBP9介導miR-136-5p/XIAP通路抑制GC的增殖，促進細胞凋亡。circRNA作為調(diào)節(jié)分子，可調(diào)控卵泡發(fā)育，具有多種生物功能。一項研究顯示，差異表達的circRNA相關的宿主基因參與卵泡發(fā)育的信號傳導途徑，如女性GC中差異表達的circRNA-103827和circRNA-104816可能參與有絲分裂細胞周期、葡萄糖代謝，卵巢類固醇生成等信號通路負性調(diào)節(jié)，造成卵泡微環(huán)境受損，抑制了卵母細胞發(fā)育成熟的過程［46］。有研究發(fā)現(xiàn)卵泡排卵過程中，circAkap17b對miR-7海綿樣吸附作用，間接上調(diào)靶基因促卵泡激素β亞基的表達并促進促卵泡生成素分泌，影響卵泡排卵［47］。許多circRNA與卵泡發(fā)育有關的miRNA可相互作用，Ma等［48］研究發(fā)現(xiàn)miR-132與hsa-circ-0043533和hsa-circ-0043532存在潛在的結合位點，miR-132可以抑制人卵巢細胞中孕酮、雌二醇和睪酮的釋放，進而推測上調(diào)hsa-circ-0043533和hsa-circ-0043532可靶向改變miR-132，抑制PCOS患者體內(nèi)類固醇激素生成，影響卵泡發(fā)育。

總結與展望

EV可從活細胞中分泌，具有天然生物相容性和循環(huán)穩(wěn)定性，作為有效生物載體，庇護生物分子ncRNA穿梭于卵泡發(fā)育過程中各個環(huán)節(jié)不受外界環(huán)境影響，發(fā)揮調(diào)控卵泡生長的作用。ncRNA是功能性RNA，作為EV的信息傳遞關鍵調(diào)控分子，具有組織和細胞特異性，ncRNA的失調(diào)可影響卵泡相關基因的表達，導致卵泡發(fā)育異常。miRNA研究目前取得很大進步，已有miRNA成為調(diào)控卵泡發(fā)育的生物標志物，也為臨床治療提供了新靶點，相信興起的lncRNA和circRNA同樣也可在卵泡發(fā)育調(diào)控方面成為新的生物標志物和靶點。隨著對EV-ncRNA和ncRNA相關卵泡發(fā)育的分子機制和信號通路深入探索，相信不久將來臨床研究者可為排卵障礙性不孕患者提供更多新的生物標志物和精準治療靶點，降低不孕癥發(fā)病率。

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（收稿日期：2022-09-14）