孟祥宇 葉亞運(yùn) 王俊斌 （蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，蚌埠 233000）

胃癌（gastric cancer，GC）是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2021 年中國國家癌癥中心的統(tǒng)計(jì)，GC已成為我國第二常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因［1］。與多數(shù)發(fā)達(dá)國家相比，我國GC病死率（0.845）和五年發(fā)病率（27.6/100 000）都更高，并突出了一個(gè)令人擔(dān)憂的特征，即年輕人群中早發(fā)性GC 發(fā)病率持續(xù)上升［2］。盡管目前采取手術(shù)切除、全身化療及靶向治療等綜合治療手段改善了胃癌的治療效果，但GC 患者長期生存情況仍不令人滿意，尤其是晚期GC 臨床預(yù)后仍不理想［3-4］。新興的免疫療法已成為GC 患者的一種有前途的替代療法。免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（anti-cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA4）單抗（Ipilimab）和抗程序性死亡受體-1（antiprogrammed cell death protein 1，anti-PD-1）單抗（nivolumab，pembrolizumab），開啟了腫瘤免疫治療的新時(shí)代，使癌癥治療模式發(fā)生轉(zhuǎn)變［5］。其中，PD-1單抗nivolumab 已被FDA 批準(zhǔn)用于晚期GC 患者一線治療，并取得了良好效果［6］。但僅有少部分GC患者從中獲益，眾多GC 患者仍需更多新的和敏感的標(biāo)志物預(yù)測或增強(qiáng)免疫治療應(yīng)答。近年越來越多的證據(jù)表明，骨膜蛋白（periostin，POSTN）在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤中的表達(dá)明顯增加，在細(xì)胞增殖、遷移和血管生成中的作用也被證實(shí)［7-11］。POSTN 在GC 中的致癌作用機(jī)制尚不清楚，且POSTN 在腫瘤免疫學(xué)及預(yù)后中的意義也鮮有報(bào)道。本研究初步分析POSTN 在GC 組織中的表達(dá)及意義，發(fā)現(xiàn)GC 組織高表達(dá)POSTN，且與生存期呈負(fù)相關(guān)。于是，本研究系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了GC 中淋巴細(xì)胞狀態(tài)，闡明了POSTN 與GC 免疫浸潤的關(guān)系以及POSTN 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答信號(hào)通路，以POSTN相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑確定免疫預(yù)后信號(hào)，結(jié)合此信號(hào)和臨床病理特征建立諾模圖，評(píng)估POSTN 在GC 中的免疫意義。

1 資料與方法

1.1 GC表達(dá)譜獲取和生存分析 從TCGA （https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取GC患者（非腫瘤組織32 例，腫瘤組織375 例）轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq 數(shù)據(jù)（Workflow Type：HTSeq-FPKM）及所有樣本臨床信息。從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫獲取GSE29998數(shù)據(jù)集99例GC及非GC組織基因表達(dá)譜。利用R 軟件“Limma”“GGplot2”“GGpubr”等軟件包對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理及分析，采用“survminer”包和KM 數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=gastric）繪制Kaplan-Meier圖。

1.2 免疫浸潤細(xì)胞評(píng)估和POSTN 與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析 采用Cibersort 方法對(duì)組織中22 種免疫細(xì)胞進(jìn)行定性和定量分析，主要依賴于LM22 的免疫細(xì)胞亞型表達(dá)矩陣，包含547 個(gè)標(biāo)志基因，可區(qū)分22 種人類造血細(xì)胞表型［12］。利用Cibersort（https：//cibersort.stanford.edu/）的CiberSort R 腳本對(duì)其表達(dá)矩陣進(jìn)行分析，蒙特卡羅法計(jì)算每種情況去卷積的經(jīng)驗(yàn)P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 POSTN 與免疫調(diào)節(jié)劑的相關(guān)性 從TISIDB（http：//cis.hku.hk/TISIDB/）數(shù)據(jù)庫提取POSTN 相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑，該數(shù)據(jù)庫旨在通過整合多種不同類型數(shù)據(jù)闡明腫瘤-免疫系統(tǒng)的相互作用［13］。采用Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)篩選與POSTN 表達(dá)顯著相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)劑。使用基因集分析工具（http：//www.webgestalt.org/）對(duì)上述基因進(jìn)行GO 注釋和KEGG 途徑富集分析，P和FDR均＜0.05為富集顯著。

1.4 風(fēng)險(xiǎn)與預(yù)測模型構(gòu)建 基于POSTN 相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑構(gòu)建一個(gè)可預(yù)測預(yù)后的模型。使用Cox 回歸模型的Akaike 信息標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行逐步變量選擇［14］。篩選出免疫基因后生成預(yù)后指數(shù)（風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分），風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=X1y1+X2y2+……+Xiyi，Xi 代表各基因風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，yi 代表各基因表達(dá)。采用Kaplan-Meier 生存曲線、對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)及單變量Cox 分析評(píng)價(jià)免疫相關(guān)基因特征和臨床特征與總生存率的關(guān)系。對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行多因素Cox 分析，調(diào)整年齡、性別、分級(jí)和臨床分期。使用“Survival ROC”軟件包繪制ROC 曲線，評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后準(zhǔn)確性。

1.5 諾模圖繪制 作為一種廣泛使用的預(yù)測模型，諾模圖可直觀地提供個(gè)性化的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［15］?；诨颊吲R床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，使用“RMS”軟件包構(gòu)建諾模圖預(yù)測一年、三年和五年總生存期（overall survival，OS）概率。Bootstrap（1 000 個(gè)重復(fù)）法計(jì)算一致性指數(shù)（Cindex）評(píng)估諾模圖的預(yù)測準(zhǔn)確性。繪制校準(zhǔn)曲線比較預(yù)測OS與實(shí)際OS概率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Rv 4.1.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。箱線圖顯示POSTN 在GC 中的表達(dá)分布，Wilcoxon 檢驗(yàn)差異表達(dá)。Kaplan-Meier 圖、HR、P或CoxP用于生存曲線log-rank檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析確定POSTN 表達(dá)與其他基因或免疫浸潤水平在腫瘤類型中的相關(guān)性。除非另有說明，否則截?cái)帱c(diǎn)設(shè)為中位值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 POSTN 在GC 中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值 為探討POSTN 在GC 中的表達(dá)及意義，本研究分析了TCGA STAD 及GSE29998 數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與非腫瘤組織相比，GC 中POSTN 表達(dá)顯著上調(diào)（圖1A、B）。以POSTN 在GC 中表達(dá)的中位值將其分為高、低表達(dá)兩組進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示POSTN 低表達(dá)組OS高于POSTN高表達(dá)組（圖1C、D）。

圖1 POSTN在GC中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值Fig.1 POSTN expression and its prognostic significance in GC

2.2 GC和正常胃組織中免疫細(xì)胞浸潤情況 為探討正常組織與GC 組織中免疫細(xì)胞浸潤水平，采用Cibersort 對(duì)組織中22 種免疫細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)正常組織和GC 組織腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞（tumorinfiltrating immune cells，TIIC）成 分 有 顯 著 差 異（圖2A），且與正常組織相比，腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤模式不同（圖2B）。各類型TIICs 呈正相關(guān)（圖2C）。POSTN 表達(dá)與記憶性B 細(xì)胞、初始B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖3A～E）；與γδT細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、未活化的NK細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞水平和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)（圖3F～L）。

圖2 375例GC和32例非GC組織22種TIICs表達(dá)及相關(guān)性分析Fig.2 22 TIICs expressions in 375 GC and 32 non-GC tissues and correlation analysis

圖3 GC患者POSTN與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性Fig.3 Correlation between POSTN and immune cell infiltration levels in GC patients

2.3 POSTN 與免疫細(xì)胞的相關(guān)性 幾個(gè)免疫亞群與POSTN mRNA 水平呈正相關(guān)（圖4）。深入研究POSTN 在調(diào)節(jié)GC 免疫應(yīng)答中的功能涉及的信號(hào)通路，29 種免疫刺激劑（CD27、CD28、CD40、CD48、CD70、CD80、CD86、CXCL12、CXCR4、ENTPD1、ICOS、IL2RA、IL6、KLRC1、KLRK1、LTA、MICB、NT5E、TMEM173、TNFRSF14、TNFRSF25、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF14、TNFSF13B、TNFSF4、TNFSF9 和ULBP1）和17 種免疫抑制劑（ADORA2A、CD96、CD160、CD274、CSF1R、CTLA4、HAVCR2、IDO1、IL10、KDR、LAG3、PDCD1LG2、PVRL2、TGFB1、TGFBR1、TIGIT和VTCN1）與GC中的POSTN顯著相關(guān)（圖5A）。對(duì)上述差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋（圖5B）。KEGG 分析表明，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞黏附分子、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫性甲狀腺疾病、瘧疾、移植物抗宿主病、同種異體移植排斥、1 型糖尿病、NF-κB信號(hào)通路、病毒性心肌炎、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、非洲錐蟲病與POSTN介導(dǎo)的免疫事件相關(guān)（圖5C）。

圖4 POSTN表達(dá)與免疫細(xì)胞亞群的相關(guān)性Fig.4 Correlation of POSTN expression with immune cell subpopulations

圖5 POSTN相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑鑒定與分析Fig.5 Identification and analysis of POSTN-related immunomodulators

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型構(gòu)建、獨(dú)立預(yù)后分析和生存分析 為探討POSTN 相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑在GC 中的臨床應(yīng)用價(jià)值，將上述因素納入單因素Cox分析，共鑒定出5 個(gè)預(yù)后基因：CSF1R、TGFB1、TGFBR1、CXCR4和NT5E（表1）。進(jìn)一步采用多因素Cox分析篩選出2 個(gè)獨(dú)立預(yù)后相關(guān)基因，即CXCR4 和NT5E，用其構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，風(fēng)險(xiǎn)值=（0.194 243 205 285 578×CXCR4）+（0.286 593 744 086 602×NT5E）。以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值為截?cái)嘀祵⒒颊叻譃楦?、低風(fēng)險(xiǎn)兩組并繪制生存相關(guān)圖形，Kaplan-Meier 分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組OS 較低風(fēng)險(xiǎn)組縮短（P=0.026，圖6A）。GC 風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)和生存狀態(tài)分布及特征性基因表達(dá)譜見圖7A。為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型獨(dú)立性，單因素Cox 分析顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存顯著相關(guān)（HR=2.470，95%CI=1.690～3.608，P＜0.001，圖7B）。多因素Cox 分析顯示調(diào)整年齡、性別、分級(jí)和分期后，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（HR=2.217，95%CI=1.472～3.341，P＜0.001，圖7C）可獨(dú)立預(yù)測GC 預(yù)后。ROC 分析得出風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC=0.696；結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和患者臨床特征時(shí)，AUC=0.734（圖6B）。

表1 POSTN相關(guān)免疫基因單因素和多因素Cox分析Tab.1 Univariate and multifactor Cox analysis of POSTNassociated immune genes

圖6 GC生存分析及ROC曲線Fig.6 GC survival analysis and ROC curve

圖7 構(gòu)建GC患者預(yù)后相關(guān)免疫相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)信號(hào)Fig.7 Immune-related risk signals associated with prognosis of GC patients

2.5 諾模圖構(gòu)建 基于TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集通過權(quán)衡風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)、年齡、分級(jí)、臨床分期、T、N和M預(yù)測個(gè)體生存概率，采用Cox回歸構(gòu)建預(yù)測GC患者的預(yù)后諾模圖（圖8A）。計(jì)算每位患者各項(xiàng)特征得分，預(yù)測一年、三年和五年OS 概率，有助于個(gè)性化精確治療。為驗(yàn)證該模型，計(jì)算該模型C-index并繪制校準(zhǔn)曲線，該模型C-index 為0.70，證實(shí)該模型具有一致性。校準(zhǔn)曲線顯示，諾模圖預(yù)測五年生存的概率（虛線）與實(shí)際生存的參考線（實(shí)線）很好地匹配（圖8B）。

圖8 GC附有校準(zhǔn)曲線的諾模圖Fig.8 Nomogram with calibration curve in GC

3 討論

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是指與腫瘤發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，主要由腫瘤細(xì)胞、多種基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子等組成，為細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了各種有利環(huán)境，同時(shí)也在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥方面發(fā)揮重要作用［16-17］。因此，研究GC 微環(huán)境及其潛在因素對(duì)臨床過程的影響對(duì)不同亞型GC 轉(zhuǎn)歸具有重要意義。大量證據(jù)表明一些特定基因可用于癌癥診斷和個(gè)性化治療。本研究基于TCGA及GEO數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)POSTN 在GC 組織中的表達(dá)高于正常組織，與ZHONG 等［18］與LI 等［19］通過不同方法檢測POSTN在GC 組織中的表達(dá)均高于正常胃組織的結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步結(jié)合臨床生存預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)：與POSTN 低表達(dá)患者相比，POSTN 高表達(dá)患者OS 更短，表明POSTN 高表達(dá)的GC 患者預(yù)后不良，且POSTN 影響GC 患者預(yù)后與TME 和免疫浸潤有關(guān)，可能為GC免疫治療提供新的靶點(diǎn)。

腫瘤免疫治療發(fā)展改變了許多腫瘤的治療方式，但并非所有患者都對(duì)免疫治療有效果［20］。多種腫瘤中，腫瘤浸潤細(xì)胞CD8+T 細(xì)胞數(shù)量與患者生存及對(duì)免疫治療的反應(yīng)相關(guān)［21-22］?；赥CGA數(shù)據(jù)集，本研究采用Cibersort 分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，GC 的22 個(gè)免疫亞群組成顯著變化，提示免疫細(xì)胞侵襲方式與GC 預(yù)后有關(guān)。目前臨床環(huán)境中很難捕捉到單個(gè)患者滲透免疫細(xì)胞的靶點(diǎn)。因此，發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物確定患者免疫狀態(tài)非常重要。本研究分析POSTN 與GC 免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，證實(shí)POSTN 與腫瘤免疫有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)POSTN 水平與記憶B 細(xì)胞、幼稚B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；與γδT 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、靜止NK細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞水平和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)。此前，POSTN 在幾種類型腫瘤中的功能已有報(bào)道。如POSTN 可通過ILK/AKT/mTOR 途徑促進(jìn)GC 細(xì)胞增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［23］。YUE 等［24］發(fā)現(xiàn)TGF-β1 可誘導(dǎo)間質(zhì)POSTN 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲。一種新的治療方法中，miR-599通過靶向下調(diào)POSTN 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲［25］。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了POSTN 在腫瘤進(jìn)展中的致癌作用，但潛在機(jī)制仍不清楚。本研究鑒定出POSTN 相關(guān)的46 種免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)其進(jìn)行GO 和KEGG 通路分析表明：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞黏附分子、NF-κB 信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等與POSTN 介導(dǎo)的免疫事件相關(guān)。已有研究證實(shí)其中2 個(gè)信號(hào)通路功能，NF-κB 可通過與其啟動(dòng)子結(jié)合直接誘導(dǎo)PD-L1 基因轉(zhuǎn)錄，也可通過間接途徑對(duì)PD-L1 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［26］。細(xì)胞黏附分子在介導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移到腫瘤部位并與惡性腫瘤相互作用過程中起重要作用［27］。其他信號(hào)通路功能尚待進(jìn)一步證實(shí)。此外，本研究通過POSTN 相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑建立GC 免疫基因預(yù)后模型，發(fā)現(xiàn)由此產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)與GC 生存密切相關(guān)。表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可區(qū)分由一組特征基因差異表達(dá)定義的風(fēng)險(xiǎn)人群，可能加速開發(fā)出對(duì)癌癥預(yù)后有良好驗(yàn)證作用的信號(hào)。

綜上，本研究表明，POSTN 不僅是GC 預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物，且可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的腫瘤侵襲在POSTN 微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，提示POSTN 可作為調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答的治療靶點(diǎn)。本研究也有一定局限性。首先，由于回溯性特征，研究可能導(dǎo)致選擇偏差，未來可進(jìn)行前瞻性研究以驗(yàn)證生物標(biāo)志物在GC 個(gè)性化管理中的臨床應(yīng)用。其次，未進(jìn)一步證實(shí)POSTN 在腫瘤中作用的相關(guān)通路。第三，POSTN 治療腫瘤免疫的基礎(chǔ)機(jī)制和免疫特征的預(yù)后價(jià)值應(yīng)進(jìn)一步研究。