王青慧 李 波 王曉黎 胡傳翠 聶明朝 龐曉慶 張亞芳

（海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，?？?570206）

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，統(tǒng)計學(xué)研究顯示2020 年全球?qū)m頸癌新增發(fā)病人數(shù)超過60 萬，雖然宮頸癌篩查和早期診斷技術(shù)已取得極大進步，但病死率仍居高不下，需要探究其發(fā)生發(fā)展機制，尋找更多用于宮頸癌治療的方法［1-2］。腫瘤免疫治療是一種新型腫瘤治療手段，CD8+T 細胞在腫瘤微環(huán)境中主要發(fā)揮殺傷腫瘤細胞作用，且CD8+T 細胞浸潤與宮頸癌的生長、轉(zhuǎn)移、化療密切相關(guān)［3-4］。腫瘤細胞通過多種途徑抑制T 細胞功能，促進腫瘤免疫逃逸［5］。探究調(diào)控CD8+T 細胞功能的分子機制對宮頸癌治療至關(guān)重要。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織大量表達circRNA-1565。而腫瘤細胞可通過旁分泌途徑向腫瘤微環(huán)境釋放外泌體，傳遞circ-RNA 等抑制免疫細胞對腫瘤的殺傷作用［6-7］。本研究擬探討circRNA-1565能否通過抑制CD8+T細胞功能影響其對腫瘤的殺傷作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 患者來自海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心，所有患者均為原發(fā)性宮頸癌患者，且經(jīng)病理驗證為首次確診者，入選患者均未經(jīng)放化療、免疫或激素干預(yù)，患者或家屬知情同意，且經(jīng)海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準(zhǔn)，批號：HNWCMC倫審2022年第[14]號。

1.1.2 主要試劑 人淋巴細胞分離液（貨號：P8900，索萊寶生物科技有限公司）；MACS 緩沖液、CD8 磁珠分選試劑盒、CD3/CD28 激活磁珠試劑盒（貨號：130-091-221、130-045-201、130-050-101，德國美天旎生物技術(shù)有限公司）；細胞毒性試劑盒（貨號：G1780，美國Promega 公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Realtime PCR 擴 增 試 劑 盒（貨 號：MF787-T 和MF787-02，北京聚合美生物科技有限公司）；宮頸癌細胞HeLa 和SiHa（貨號：UBS294-01、UBS295-02，廣州欣源生物科技有限公司）；TNF-α（貨號：SEKH-0047）、IFN-γ、Granzyme-B、perforin ELISA 試劑盒（貨號：SEKH-0046、SEKH-0049、SEKH-0295）、Lipofectamine 2000 試劑盒（貨號：YZ-11668）；CCK-8 試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：CA1210、CA1020）均購自北京索萊寶科技有限公司；CD8 抗體、Bcl-2 抗體、Bax 抗體、cleaved-caspase-3 抗 體、GAPDH 抗 體、山 羊 抗 兔IgG（貨 號：66868-1-Ig、12789-1-AP、50599-2-Ig、66470-2-Ig、60004-1-Ig、30000-0-AP，武漢三鷹生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取液氮中保存的宮頸癌細胞HeLa 和SiHa 迅速融化，1 000 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀，10 ml 含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至10 cm 細胞培養(yǎng)皿，隔天更換培養(yǎng)基，細胞生長至80%匯合時傳代。

1.2.2 CD8+T 細胞分離、培養(yǎng)與鑒定 取宮頸癌患者外周血10 ml，1 500 r/min 離心10 min，收集血漿，30 ml 無菌PBS 溶液重懸，在50 ml 離心管中加入15 ml 人 淋 巴 細 胞 分 離 液，加 入3 ml 血 漿 溶 液，2 500 r/min 離心25 min，取中間分層的白色絮狀物，10 ml無菌PBS重懸，1 500 r/min離心10 min，所得沉淀加入10 ml RPMI1640培養(yǎng)基重懸，即為PBMC。

1.2.3 CD8+T 細 胞 磁 珠 分 選PBMC CD8+T 細 胞

MACS緩沖液重懸PBMC，取1×107個細胞加入20 μl CD8 磁珠和80 μl MACS 緩沖液，避光孵育20 min，采用試劑盒將孵育的細胞加入磁分選的LS/MS 柱，液體流出后取出柱子，遠離磁場，使用2 ml MACS緩沖液將柱中的細胞打入離心管，1 500 r/min 離心10 min，所得沉淀使用10 ml RPMI1640培養(yǎng)基重懸，即為CD8+T細胞。根據(jù)CD3/CD28激活磁珠數(shù)（細胞數(shù)為1∶1），在分選的CD8+T 細胞中加入CD3/CD28激活磁珠緩沖液激活72 h，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)。

1.2.4 流式細胞術(shù)鑒定CD8+T細胞 取2×104個分選細胞，20 μl FACS緩沖溶液重懸，加入2 μl CD8抗體，避光孵育15 min，200 μl FACS緩沖液清洗，200 μl FACS緩沖液重懸，流式細胞儀檢測CD8表達。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說明書，取1 支離心管加入240 μl 無血清RPMI1640培養(yǎng)基，加入Lipofectamine 2000 試劑10 μl 進行稀釋。再取2 支離心管，每管加入120 μl 無血清RPMI1640 培養(yǎng)基，分別加入5 μl 空白質(zhì)粒和5 μl circRNA-1565 質(zhì)粒。在上述2 支離心管中每管加入125 μl Lipofectamine 2000 稀釋液，室溫下共孵育15 min。將CD8+T 細胞接種至12 孔板（3×105個/孔，750 μl），將250 μl上述混合液分別加入對應(yīng)的12孔板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，將12 孔板中的培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，所得細胞用于后續(xù)研究，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和circRNA-1565 質(zhì)粒的細胞記為Control組和circRNA-1565組。

1.2.6 qRT-PCR 檢 測circRNA-1565 表 達 采 用TRIzol 試劑盒提取轉(zhuǎn)染后各組CD8+T 細胞的總RNA，定量，使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA，Realtime PCR 擴增試劑盒進行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 個循環(huán)。2-ΔΔCt計算基因相對表達，引物序列為circRNA-1565 F：5'-GATCACACCGTTAACCGCC-3'，R：5'-ACGACGTTCTTTGTCAGCTT-3'；β-actin F：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，R：5'-GCTGTCACCTTAACCGTTCC-3'。

1.2.7 CCK-8 檢測細胞增殖 將Control 組和circ-RNA-1565 組CD8+T 細胞以2 000 個/孔接種于96 孔板（90 μl/孔），設(shè)置5個平行孔作為重復(fù)，24 h、48 h、72 h 時取出96 孔板，每孔添加10 μl CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光度。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取Control 組和circRNA-1565 組CD8+T 細 胞各1×105個，分別加入200 μl 凋亡檢測結(jié)合緩沖液重懸細胞，每管加入5 μl Annexin V-FITC，避光孵育10 min，加入5 μl PI混勻避光孵育5 min，設(shè)置單染管PI 和Annexin VFITC調(diào)節(jié)補償，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.9 ELISA 檢測TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B 和perforin 濃度 在6 孔板中將HeLa 和SiHa 細胞分別與Control組和circRNA-1565組CD8+T 以5∶1比例共孵育24 h，分別記為：HeLa+CD8+T+Vector 組、HeLa+CD8+T+circRNA-1565 組、SiHa+CD8+T+Vector 組、SiHa+CD8+T+circRNA-1565 組，取共孵育的細胞懸液100 g 離心10 min，收集上清，ELISA 試劑盒檢測上清中TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B 和perforin 濃度：分別取100 μl 待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加至相應(yīng)樣品孔，37 ℃水浴避光孵育90 min，棄上清，緩沖洗滌液，洗滌甩干，重復(fù)4次，每孔加入100 μl上述備用的生物素化抗體工作液，37 ℃水浴避光孵育60 min，洗板4 次，每孔加入100 μl 顯色液，37 ℃水浴避光孵育20 min，每孔加入終止液混勻，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（OD450）。

1.2.10 CD8+T 細胞殺傷能力檢測 收集 HeLa 和SiHa 細胞并調(diào)整濃度至2×104個/ml，將細胞懸液以50 μl/孔接種于96 孔板，將HeLa 和SiHa 細胞分別與Control組和circRNA-1565組CD8+T 以5∶1比例接種至96 孔板，共同培養(yǎng)24 h，分別記為CD8+T+Vector組、和CD8+T+circRNA-1565組。按照細胞毒性試劑盒說明書，96 孔板中每孔加入50 μl CytoTox-GloTMCytotoxicity 試劑，搖晃均勻，室溫孵育15 min，檢測570 nm處各孔吸光度（OD）。計算腫瘤殺傷率，細胞毒性（%）=（ODE+T-ODE-ODT）/（ODEmax-ODE）×100%，其中ODE+T為（效應(yīng)細胞+靶細胞）OD，ODE為效應(yīng)細胞OD，ODT為靶細胞OD，ODEmax為靶細胞全部裂解后的OD，HeLa 和SiHa 細胞為靶細胞，Control 組和circRNA-1565組CD8+T為效應(yīng)細胞。

1.2.11 Western blot 收集轉(zhuǎn)染后的各組CD8+T細胞，加入適量細胞裂解液冰上裂解10 min，離心取上清為總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取10 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、GAPDH一抗于4 ℃過夜孵育，山羊抗兔IgG室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后顯影。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和制圖。實驗重復(fù)3次，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+T 細胞鑒定與轉(zhuǎn)染結(jié)果 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示（圖1A），磁珠分選的人PBMC CD8+T 細胞陽性率＞88%。qRT-PCR 結(jié)果顯示（圖1B），circRNA-1565 組CD8+T 細 胞circRNA-1565 表 達 顯 著 高 于Control組（P＜0.001），說明CD8+T分選及轉(zhuǎn)染成功。2.2 circRNA-1565 抑制CD8+T 細胞增殖 CCK-8結(jié) 果 顯 示，24 h、48 h、72 h 時，circRNA-1565 組CD8+T 細胞OD 值均顯著低于Control 組（P＜0.001，圖2），說明circRNA-1565抑制CD8+T細胞增殖。

圖1 CD8+T細胞鑒定與轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.1 Identification and transfection results of CD8+T cells

圖2 Control組和circRNA-1565組CD8+T細胞增殖能力Fig.2 Proliferation ability of CD8+T cells in control group and circRNA-1565 group

2.3 circRNA-1565 促進CD8+T 細胞凋亡 流式細胞術(shù)結(jié)果（圖3A）顯示，circRNA-1565 組CD8+T 細胞凋亡水平顯著高于Control 組（P＜0.001）。相比于Control 組，circRNA-1565 組CD8+T 細胞cleaved-caspase-3 表 達 顯 著 增 加，Bcl-2/Bax 顯 著 降 低（P＜0.001）。說明circRNA-1565促進CD8+T細胞凋亡。

圖3 circRNA-1565對CD8+T細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of circRNA-1565 on apoptosis of CD8+T cells

2.4 circRNA-1565 抑 制CD8+T 細 胞 分 泌TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B 和perforin ELISA 結(jié)果（圖4）顯示，相比于HeLa+CD8+T+Vector組，HeLa+CD8+T+circ-RNA-1565 組細胞上清中TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B和perforin 濃度顯著降低（P＜0.001）。相比于SiHa+CD8+T+Vector 組，SiHa+CD8+T+circRNA-1565 組 細胞上清中TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B和perforin濃度顯著降低（P＜0.001），說明circRNA-1565可抑制CD8+T細胞分泌TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B和perforin。

圖4 circRNA-1565 對CD8+T 細胞TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B和perforin分泌的影響Fig.4 Effect of circRNA-1565 on secretions of TNF-α，IFN-γ， Granzyme-B and perforin in CD8+T cells

2.5 circRNA-1565 抑制CD8+T 細胞對宮頸癌細胞的殺傷作用 細胞殺傷檢測結(jié)果（圖5）顯示，CD8+T+circRNA-1565 組CD8+T 細 胞 對HeLa 和SiHa細胞的殺傷能力顯著低于CD8+T+Vector 組（P＜0.001）。說明circRNA-1565可抑制CD8+T細胞對宮頸癌細胞的殺傷作用。

圖5 circRNA-1565 對CD8+T 細胞殺傷HeLa（A）和SiHa（B）細胞的效果Fig.5 Effect of circRNA-1565 on killing of HeLa （A） and SiHa （B） cells by CD8+T cells

3 討論

CD8+T 細胞是調(diào)控病毒感染的重要免疫細胞之一。目前人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗均以調(diào)節(jié)細胞毒性T 細胞殺傷活性達到清除HPV 的目的［8-9］。CD8+T 細胞在宮頸免疫微環(huán)境中發(fā)揮免疫監(jiān)視、免疫效應(yīng)、殺傷腫瘤細胞作用［10-11］。研究表明CD8+T、CD4+T細胞、B淋巴細胞在宮頸癌患者外周血中含量顯著增加，CD8+T 細胞可對宮頸癌細胞起顯著殺傷作用，但腫瘤細胞會通過自分泌胞外囊泡等多種方式調(diào)控CD8+T 細胞功能，促進自身免疫逃逸［12-13］。發(fā)現(xiàn)更多調(diào)控CD8+T 細胞功能的分子對CD8+T細胞相關(guān)免疫治療至關(guān)重要。

circRNA 是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)特點的非編碼RNA，具有穩(wěn)定性、組織細胞發(fā)育時空特異性以及保守性等生物學(xué)特性，在基因調(diào)控過程中具有重要作用［14-15］。研究表明N6-甲基腺苷修飾的circ-IGF2BP3 通過促進非小細胞肺癌PD-L1 去泛素化抑制CD8+T細胞功能以促進腫瘤免疫逃逸［16］。本課題組在前期研究中對宮頸癌組織進行了circRNA 測序分析，篩選得到多種宮頸癌腫瘤組織中高表達的circRNA，其中circRNA-1565 在宮頸癌組織中顯著高表達，因此本研究集中于circRNA-1565，初步探究circRNA-1565能否通過調(diào)控CD8+T細胞功能并影響其對腫瘤的殺傷功能。

本研究首先從人PBMC 中分離得到CD8+T 細胞，將空白質(zhì)粒和circRNA-1565 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CD8+T細胞構(gòu)建差異表達circRNA-1565 的CD8+T 細胞，并發(fā)現(xiàn)circRNA-1565 可顯著抑制CD8+T 細胞增殖，促進CD8+T 細胞凋亡。研究表明抗原持續(xù)暴露條件下，CD8+T細胞會逐漸降低其增殖能力，處于功能耗竭狀態(tài)，降低CD8+T 細胞的殺傷能力［17］。耗竭的CD8+T 細胞可發(fā)生代謝功能不全，伴隨信號級聯(lián)和表觀遺傳背景改變，從而抑制效應(yīng)性免疫，并導(dǎo)致對免疫檢查點阻斷治療反應(yīng)不良，抑制circRNA-1565 可能改善CD8+T 耗竭，進而促進腫瘤免疫治療。將差異表達circRNA-1565的CD8+T細胞分別與宮頸癌細胞HeLa 和SiHa 細胞共孵育，且發(fā)現(xiàn)高表達circRNA-1565 的CD8+T 細胞與HeLa 和SiHa 細胞共孵育后其TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B 和perforin 分泌能力顯著減弱，且CD8+T 細胞的腫瘤細胞殺傷能力顯著減弱。研究表明CD8+T 細胞可通過分泌TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B 和perforin 殺傷靶細胞，其中TNF-α 對機體免疫有調(diào)節(jié)作用，TNF-α 通過促進T細胞及其他殺傷細胞表達而殺傷或抑制腫瘤細胞；IFN-γ 可通過誘導(dǎo)凋亡或非凋亡細胞死亡殺傷腫瘤細胞；Granzyme-B 是一種絲氨酸蛋白酶，介導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞凋亡信號通路；perforin 是一種T 細胞分泌的可刺穿靶細胞外膜的蛋白，起腫瘤殺傷作用［18-19］。本研究說明circ-RNA-1565 可通過抑制CD8+T 細胞TNF-α、IFN-γ、Granzyme-B和perforin分泌而抑制其腫瘤殺傷功能。

研究表明腫瘤細胞可通過分泌外泌體傳遞遺傳物質(zhì)進而調(diào)控CD8+T 細胞功能，如腫瘤細胞可通過外泌體轉(zhuǎn)移circUSP7 而調(diào)控非小細胞肺癌CD8+T細胞功能，膀胱癌細胞外泌體可通過轉(zhuǎn)移circTRPS1促進CD8+T 細胞耗竭［20-21］。本研究推測宮頸癌細胞或可通過外泌體而向CD8+T細胞轉(zhuǎn)移circRNA-1565調(diào)控其殺傷能力，本課題組會進行進一步探究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)circRNA-1565 可調(diào)控CD8+T細胞增殖和凋亡，進而抑制CD8+T 細胞對宮頸癌細胞的殺傷作用，但circRNA-1565 的調(diào)控機制及其臨床應(yīng)用潛力還需進一步探究。