雷愛弟 張健莉 周 衡 （廈門市第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廈門 361101）

腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）指因大腦缺血后恢復(fù)血液灌注導(dǎo)致的組織及功能損傷進一步加重的現(xiàn)象，是多種腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)［1］。CIRI 機制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、自噬等在其中具有重要作用［2］。其中自噬不僅可以通過清除受損或多余的細胞器修復(fù)神經(jīng)元損傷，且可以通過影響細胞凋亡和壞死調(diào)控神經(jīng)元死亡［3］。IL-4 是一種重要的抗炎因子，能夠使抗炎因子如IL-10、TGF-β 等分泌增加，同時抑制炎癥因子如IL-1、TNF-α 的釋放，發(fā)揮抗炎作用。研究表明，IL-4 能夠促進自噬產(chǎn)生，減輕小鼠CIRI，并改善遠期認知功能，具有腦保護作用［4］。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是細胞在低氧條件下的重要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，在常氧條件下受到抑制。Bcl-2/腺病毒E1B-19kDa 相 互 作 用 蛋 白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa interacting protein 3，BNIP3）是HIF-1α 的下游靶基因。自噬與缺氧關(guān)系密切，缺氧誘導(dǎo)的自噬對細胞主要起保護作用。研究表明，HIF-1α/BNIP3信號通路激活可引發(fā)自噬增加，減輕心肌CIRI 損傷［5］。而HIF-1α/BNIP3、IL-4、自噬三者之間的關(guān)系尚不明確。

本研究擬探討HIF-1α/BNIP3 信號通路在IL-4減輕大鼠CIRI中的作用及其與自噬的關(guān)系，為進一步明確其機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實 驗 動 物 SPF 級2 月 齡BALB/c 小 鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 g，購自豪威生物科技有限公司［SYXK（津）2019-0006］。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23～25 ℃、標準濕度55%～60%、12 h/12 h 晝夜交替、進食飲水正常、分籠飼養(yǎng)。于1 周后進行實驗。本研究經(jīng)廈門市第五醫(yī)院倫理委員會批準（20180723）。

1.1.2 主要試劑與儀器 重組小鼠IL-4（美國PeproTech 公司）；大鼠抗小鼠IL-4 中和抗體（美國Verax 公司）；2ME2（美國Selleck 公司）；HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、Beclin-1 抗體（美國CST 公司）；辣根過氧化物酶標記的二抗（北京博爾西科技有限公司）；TTC 染色試劑盒（美國Sigma 公司）；TUNEL 染色試劑盒（美國Roche 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（南京建成生物工程有限公司）。Thermo 酶標儀［賽默飛世爾科技(中國)有限公司］；冷凍離心機（美國Beckman公司）；蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；H7500透射電鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作與分組 將60只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為5 組：假手術(shù)組、缺血再灌注組（CIRI 組）、IL-4 組、HIF-1α 抑制劑2ME2 組（2ME2組）和IL-4+HIF-1α抑制劑2ME2組（IL-4+2ME2組）。采用線栓法構(gòu)建CIRI 組、IL-4 組、2ME2 組和IL-4+2ME2 組 大 腦 中 動 脈 栓 塞（middle cerebral artery embolism，MACO）模型，主要方法如下：腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并將其仰臥固定于手術(shù)臺上。剃毛和消毒后小心暴露左頸內(nèi)動脈，將尼龍線插入其中，當遠端稍遇阻力時停止插入并固定栓線，閉塞缺血60 min 后取出尼龍線，允許缺血區(qū)域再灌注 24 h，建立MACO 小鼠模型。術(shù)后肌內(nèi)注射200 000 U 青霉素，連續(xù)3 d。假手術(shù)組除不阻斷大鼠大腦中動脈外，其余操作同上。IL-4組、2ME2組、IL-4+2ME2 組建模前30 min 分別腹腔注射相應(yīng)的0.2 ml IL-4C復(fù)合體溶液（IL-4C復(fù)合體溶液配制：將10 μg 重組小鼠IL-4 抗體和50 μg 重組大鼠抗小鼠IL-4抗體混合，用含1%小鼠血清的生理鹽水稀釋到50 μg/ml），尾靜脈注射15 mg/kg 2ME2 溶液。再灌注24 h 時進行神經(jīng)行為學(xué)評分，然后處死小鼠取腦組織。

1.2.2 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 參考Longa 神經(jīng)功能缺損評分方法，在動物建模14 d 后進行評分，并記錄神經(jīng)功能缺失癥狀，評分標準如下：無神經(jīng)損傷癥狀計0 分；左側(cè)前肢不能完全伸展計1 分；行走時身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈計2 分；行走時身體向左側(cè)傾倒計3分；癱瘓，不能站立計4分。

1.2.3 TTC染色檢測腦梗死體積 采用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后斷頭取腦，將各組腦組織于-80 ℃冰箱冷凍5 min，制成2 mm 厚的冠狀切片。將切片置于2%TTC 溶液中室溫孵育30 min（正常組織染成紅色，梗死組織染成白色），4%多聚甲醛溶液中固定過夜，用數(shù)碼相機等距拍照并將圖像導(dǎo)入電腦，用Image-pro plus 6.0軟件計算大鼠腦梗死體積。

1.2.4 干濕重法測定大鼠腦組織含水量 取部分腦組織置于錫紙（重量為A）中稱重為B，濕重=B-A；用錫紙包裹腦組織放入烤箱烘干后反復(fù)稱量至恒重C，干重=C-A；計算公式：腦組織含水量（%）=（腦組織濕重-腦組織干重）/濕重×100%，即（B-C）/（BA）×100%。

1.2.5 TUNEL 染色檢測細胞凋亡 取部分腦組織制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟、梯度乙醇脫水后，加入3%H2O2室溫孵育10 min 后用蛋白酶K 于37 ℃消化10 min，加入TUNEL 反應(yīng)混合液37 ℃避光孵育1 h，分別進行梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡。最后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡（×400）下隨機選取5個視野，觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.6 透射電鏡下計數(shù)自噬小體 取部分腦組織剪成小塊，迅速置于2.5%戊二醛中固定4 h，然后依次進行1%鋨酸固定、梯度丙酮脫水、環(huán)氧樹脂包埋。超薄切片機切片（50～70 μm）后，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色后，于透射電鏡（×10 000）下隨機選取5個視野，觀察自噬小體情況。

1.2.7 比色法測定SOD、MDA 和ROS 水平 取部分腦組織用生理鹽水沖洗，并制成組織含量為10%的勻漿液，離心取上清，按照SOD、MDA 和ROS試劑盒說明書檢測SOD、MDA和ROS水平。

1.2.8 Western blot 檢測HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1表達 取1份腦組織，加入細胞裂解液勻漿進行總蛋白提取，BCA 蛋白檢測試劑盒測定各組蛋白濃度，蛋白定量變性后進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，電泳后迅速轉(zhuǎn)至PVDF 膜，置于含5%脫脂牛奶TBST 溶液中室溫封閉2 h，分別加入對應(yīng)一抗HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1（1∶2 000） 4 ℃過夜。TBST 洗滌3 次后，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，最后避光加入DAB 顯色劑顯色，Bio-Rad 凝膠成像儀記錄蛋白灰度并拍照，以GAPDH 作為對照，對各組蛋白進行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS22.0 軟件，計量資料以±s表示，采用獨立t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量比較 與假手術(shù)組相比，CIRI 組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量明顯升高（P＜0.05）；與CIRI 組相比，IL-4 組神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量降低（P＜0.05）；與IL-4 組相比，2ME2組、IL-4+2ME2組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量升高（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of neurobehavioral scores， cerebral infarction volume and cerebral water content of mice in each group （±s，n=5）

表1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積和腦含水量比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of neurobehavioral scores， cerebral infarction volume and cerebral water content of mice in each group （±s，n=5）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with CIRI group， 2）P＜0.05； compared with IL-4 group， 3）P＜0.05.

Cerebral water content/%75.32±1.25 80.47±1.161）77.34±1.211）2）83.43±1.361）3）82.23±1.131）3）Groups Sham CIRI IL-4 2ME2 IL-4+2ME2 Neurobehavioral scores/point 0.20±0.50 2.40±0.581）1.60±0.581）2）3.40±0.501）3）3.20±0.501）3）Cerebral infarction volume/%5.89±1.35 31.42±3.461）15.34±4.271）2）39.67±3.611）3）36.46±3.831）3）

2.2 各組小鼠細胞凋亡、SOD、MDA 和ROS 水平比較 與假手術(shù)組相比，CIRI 組小鼠細胞凋亡、MDA和ROS 水平明顯升高，SOD 水平明顯降低（P＜0.05）；與CIRI 組相比，IL-4 組細胞凋亡、MDA 和ROS 水平降低，SOD 水平升高（P＜0.05）；與IL-4 組相 比，2ME2 組、IL-4+2ME2 組 細 胞 凋 亡、MDA 和ROS水平升高，SOD水平降低（P＜0.05），見圖2、表2。2.3 各組小鼠自噬小體形成情況比較 假手術(shù)組小鼠偶見單個自噬小體；CIRI 組細胞內(nèi)有較多自噬小體；IL-4 組可見明顯增多的雙層磷脂雙分子層包裹的自噬小體；2ME2 組、IL-4+2ME2 組細胞存在少量自噬小體，見圖3。

表2 各組小鼠細胞凋亡、SOD、MDA和ROS水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cell apoptosis， SOD， MDA and ROS levels of mice in each group （±s，n=5）

表2 各組小鼠細胞凋亡、SOD、MDA和ROS水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cell apoptosis， SOD， MDA and ROS levels of mice in each group （±s，n=5）

Note：Compared with sham group， 1）P＜0.05； compared with CIRI group， 2）P＜0.05； compared with IL-4 group， 3）P＜0.05.

ROS/（U·mg-1）34.65±8.96 93.47±13.871）58.36±11.471）2）118.14±13.461）3）111.29±10.131）3）Groups Sham CIRI IL-4 2ME2 IL-4+2ME2 Apoptosis/%4.24±1.53 23.34±3.461）13.42±3.581）2）32.36±3.521）3）30.19±3.921）3）SOD/（U·mg-1）269.35±15.11 124.14±10.461）215.39±17.371）2）101.76±12.311）3）106.24±10.181）3）MDA/（nmol·mg-1）5.32±0.95 12.37±1.161）7.14±0.911）2）15.83±1.261）3）14.32±1.611）3）

圖2 各組小鼠細胞凋亡觀察（TUNEL染色，×400）Fig.2 Observation of apoptosis of mice in each group（TUNEL staining， ×400）

圖3 各組小鼠自噬小體形成情況比較（透射電鏡，×10 000）Fig.3 Comparison of formation of autophagosomes in each group of mice（Transmission electron microscope，×10 000）

2.4 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較 與假手術(shù)組相比，CIRI 組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1 水平明顯升高（P＜0.05）；與CIRI組相比，IL-4組HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1 水 平 明 顯 升 高（P＜0.05）；與IL-4 組 相 比，2ME2 組、IL-4+2ME2 組HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平明顯降低（P＜0.05），見圖4、表3。

表3 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of levels of HIF-1α， BNIP3， LC3-Ⅱ and Beclin-1 of mice in each group （±s，n=5）

表3 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of levels of HIF-1α， BNIP3， LC3-Ⅱ and Beclin-1 of mice in each group （±s，n=5）

Note：Compared with sham group， 1）P＜0.05； compared with CIRI group， 2）P＜0.05； compared with IL-4 group， 3）P＜0.05.

Beclin-1 0.11±0.04 0.46±0.111）0.98±0.161）2）0.28±0.061）3）0.20±0.061）3）Groups Sham CIRI IL-4 2ME2 IL-4+2ME2 HIF-1α 0.15±0.08 0.45±0.051）0.84±0.181）2）0.29±0.071）3）0.19±0.043）BNIP3 0.11±0.06 0.38±0.061）0.96±0.171）2）0.24±0.111）3）0.14±0.123）LC3-Ⅱ0.13±0.05 0.44±0.071）0.77±0.211）2）0.23±0.061）3）0.21±0.073）

圖4 各組小鼠HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ和Beclin-1水平比較Fig.4 Comparison of levels of HIF-1α， BNIP3， LC3-Ⅱand Beclin-1 of mice in each group

3 討論

在缺血性腦血管疾病中，缺血性腦卒中具有高發(fā)病率和高病死率特點，臨床一般通過恢復(fù)缺血區(qū)的血流灌注進行治療，但恢復(fù)血流灌注會使組織損傷及功能障礙更加嚴重，即為CIRI。近年研究發(fā)現(xiàn)，CIRI 與自噬調(diào)節(jié)密切相關(guān)，在體內(nèi)、外模型中，再灌注期間抑制自噬均不利于神經(jīng)細胞存活。如ZHANG 等［6］發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可降低MCAO 大鼠神經(jīng)功能評分，減小腦梗死體積，降低氧-葡萄糖剝奪/再灌注損傷（OGD/R）后HT22 細胞凋亡率，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達，通過促進自噬下調(diào)細胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用。SUN 等［7］發(fā)現(xiàn)缺血再灌注處理能夠減少線粒體細胞色素C 釋放，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）抑制了缺血再灌注處理的這種保護作用，表明缺血再灌注通過激活自噬加速了受損線粒體的清除，有利于神經(jīng)元存活。IL-4是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細胞因子，對各種損傷、感染性及自身免疫性疾病均具有治療作用。研究發(fā)現(xiàn)IL-4缺乏會導(dǎo)致神經(jīng)過度興奮，并加重IR 損傷，激活I(lǐng)L-4 信號有助于腦卒中后缺血性損傷的恢復(fù)［8］。LIU 等［9］發(fā)現(xiàn)IL-4 通過激活自噬減輕小鼠CIRI，并改善遠期認知功能。LI 等［10］發(fā)現(xiàn)IL-4 能夠顯著減輕IR 小鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積、氧化應(yīng)激、細胞凋亡，通過激活自噬發(fā)揮腦保護作用。本研究通過構(gòu)建小鼠MCAO 模型，發(fā)現(xiàn)CIRI 組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積、腦含水量、細胞凋亡、氧化應(yīng)激及自噬水平升高；IL-4 處理后，IL-4 組神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積、腦含水量、細胞凋亡、氧化應(yīng)激水平降低，自噬水平升高，說明IL-4 能夠減輕CIRI。

腦組織缺血、缺氧造成腦內(nèi)能量代謝障礙，引起大量ROS、興奮性氨基酸的堆積和釋放，從而導(dǎo)致自噬潮發(fā)生。Beclin-1、LC3 蛋白與自噬的發(fā)生關(guān)系密切。Beclin-1 基因是酵母ATG6 的同系物，可誘導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬泡，是自噬體形成過程中的重要分子。LC3 是自噬體膜蛋白，參與自噬形成的各個階段，可作為檢測自噬活性的標志物，當發(fā)生自噬后，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化修飾形成LC3-Ⅱ，從而啟動自噬。HE 等［11］發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血再灌注階段，白藜蘆醇能夠提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值、降低p62 及炎癥小體NLRP3 表達，通過增強自噬活性減輕CIRI 所致的炎癥損傷，并且3-MA 預(yù)處理時增強了NLRP3 表達。SUN 等［12］發(fā)現(xiàn)MCAO 誘導(dǎo)了細胞自噬，丁香酚給藥后進一步促進了自噬產(chǎn)生，從而防止體外OGD/R 及CIRI。ZHANG 等［13］發(fā)現(xiàn)氯通道-3（ClC-3）誘導(dǎo)能夠提高Beclin-1 表達，激活自噬，對CIRI 具有保護作用，敲低ClC-3 通過抑制體內(nèi)自噬，顯著加重腦IR 損傷，本研究中與CIRI 組相比，IL-4組小鼠LC3-Ⅱ和Beclin-1 水平升高，自噬小體數(shù)量增多，說明IL-4通過激活自噬發(fā)揮腦保護作用。

HIF-1α 是缺氧細胞反應(yīng)的關(guān)鍵因子，參與調(diào)節(jié)線粒體自噬，使得ROS 和促凋亡因子釋放減少，防止細胞進一步損傷，增加細胞存活。HIF-1α 是BNIP3 的上游基因，活化的HIF-1α 通過上調(diào)BNIP3增強線粒體自噬，從而產(chǎn)生細胞保護作用。研究表明HIF-1α/BNIP3 信號通路通過增強自噬，保護心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。如LIU等［14］發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌損傷模型中，三七總皂苷通過激活HIF-1α/BNIP3信號通路增強線粒體自噬，對MIRI具有顯著保護作用。YANG 等［15］發(fā)現(xiàn)去鐵胺聯(lián)合七氟醚可通過恢復(fù)和促進HIF-1/BNIP3 介導(dǎo)的線粒體自噬減輕糖尿病大鼠MIRI。ZHU 等［16］發(fā)現(xiàn)小檗堿通過誘導(dǎo)心肌細胞增殖、抑制心肌細胞凋亡及誘導(dǎo)線粒體自噬介導(dǎo)HIF-1α/BNIP3 通路防止MIRI 損傷。本研究中，與CIRI 組相比，IL-4 組小鼠HIF-1α、BNIP3 水平升高；HIF-1α/BNIP3 信號通路抑制劑2ME2 處理后，2ME2組、IL-4+2ME2組HIF-1α、BNIP3水平降低，說明IL-4通過激活HIF-1α/BNIP3 信號通路發(fā)揮腦保護作用。見圖5。

圖5 IL-4減輕小鼠CIRI的作用機制Fig.5 Mechanism of IL-4 attenuating CIRI in mice

綜上所述，IL-4 可通過激活HIF-1α/BNIP3 信號通路，增強細胞自噬，減少細胞凋亡和氧化應(yīng)激，從而減輕小鼠CIRI。