艾奇淵 王 勇 徐瑞春 彭 臻 李勁松 （貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院神經外科，都勻 558000）

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage， SAH）指腦底部或表面病變血管破裂，血液直接流入蛛網膜引起的臨床綜合征，雖然血管介入技術等治療方法已取得很大進展，但SAH 患者預后仍不樂觀，早期腦損傷是SAH 患者死亡的主要原因［1-2］?？嗍w是雙子葉蓼科蕎麥屬植物的成熟種子，其生物黃酮含量尤為豐富［3］。黃酮是廣泛存在于植物界的酚類組分，因其減少自由基形成和清除存在自由基的抗氧化生物活性而在抗腫瘤、抗炎和心血管疾病治療方面顯示出卓越的治療效果［4-5］。研究表明，氧化應激在SAH 患者腦死亡的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用，出血后產生的過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）能夠激活相關信號通路，導致細胞凋亡［6］。神經炎癥以炎癥細胞和炎癥細胞因子增加為主要標志，是介導SAH 后早期腦損傷的另一發(fā)病機制［7］。因此有效控制SAH 患者神經炎癥，減緩腦組織氧化應激反應，對預防早期腦損傷具有重要意義。核轉錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路長久以來被認為是典型的炎癥信號轉導通路，在表達炎癥基因中占有樞紐性地位［8］。此外，研究發(fā)現(xiàn)多種心腦血管疾病與氧化應激和NF-κB信號通路激活有關［9］。本研究通過探索苦蕎黃酮提取物對SAH 模型大鼠NF-κB 等信號通路的影響，以期為防治SAH患者早期腦損傷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級新生Sprague-Dawley大鼠60 只，雌雄各半，體質量200～250 g，購自貴州中醫(yī)藥大學（實驗動物研究所），動物許可證號：SCXK（黔）2021-0003。本研究經貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核通過（批準號：202105001）。

1.1.2 主要試劑 伊文思藍染色液購自北京伊塔生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）檢測試劑盒均購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 檢測試劑盒均購自上海賓智生物科技有限公司；苦蕎黃酮提取物由南京道斯夫生物科技有限公司提供；基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、p-ERK、NF-κB P65 和p-NF-κB P65 單克隆抗體均購自Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒均購自上海碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 Perkin Elmer XElx800 型多功能酶標檢測儀；拓赫Tissuelyser-192 多樣品組織勻漿機；日立F-7000 型熒光分光光度計；Bio-Rad mini PROTEAN蛋白電泳儀和轉膜儀。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將60只大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組、苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組，每組10 只。將動物飼養(yǎng)在25 ℃、50%濕度、充滿聚乙烯和12 h/12 h光/暗交替的人造環(huán)境中自由飲食，7 d適應環(huán)境。

模型組、尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組大鼠采用血管內穿刺法建立SAH 模型［10］：通過腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液（45 mg/kg）麻醉，成功后仰臥固定至手術板上，75%乙醇消毒頸部皮膚，做頸部正中切口，分離暴露右側頸部動脈、頸內動脈和頸外動脈，將4-0 尼龍線頭從頸外動脈殘端插入右頸內動脈，穿透大腦前、中動脈分叉處。假手術組大鼠僅在手術操作過程中將尼龍線頭端送至右頸內動脈，但不刺破動脈管壁。

麻醉復蘇2 h 后，苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠分別灌胃苦蕎黃酮提取物（250 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg）和 尼 莫 地 平（0.2 mg/kg），模型組和對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃7 d［11-12］。

1.2.2 標本采集 取各組大鼠尾靜脈血2 ml，4 ℃、1 000 r/min 離心20 min，取上層血清，儲存于-80 ℃冰箱保存待測。末次干預后，2.5%戊巴比妥鈉溶液深度麻醉后處死大鼠，斷頭剝離大鼠大腦皮質組織，剪取約0.5 g 于4 ℃下加入pH=7.4的PBS中充分洗滌，隨后加入蛋白裂解液，將標本充分研成勻漿，4 ℃、1 000 r/min 離心20 min，收集上清液，儲存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3 大鼠神經功能缺損評分 從給藥結束24 h開始，根據(jù)大鼠活動情況，每日按照Longa 分級標準對各組大鼠神經功能進行評分［13］，0 分表示神經功能正常；1 分為輕度神經功能缺損，表現(xiàn)為對側前爪不能完全伸展；2 分為輕中度神經功能缺損，行走時向對側轉圈；3 分為中度神經功能缺損，表現(xiàn)為行走時身體向對側傾斜；4 分為中重度神經功能缺損，大鼠無法自發(fā)行走，意識減退；5 分為重度神經功能缺損，大鼠發(fā)生缺血相關性死亡。

1.2.4 腦含水量測定 末次給藥后，每組采用2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉處死3 只大鼠，迅速低溫取腦，去除小腦、腦干和軟腦膜等組織后，稱量濕重，然后置于85 ℃烤箱烘烤至恒重，稱量干重，通過公式：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%，計算各組大鼠腦含水量。

1.2.5 血腦屏障通透性 各組取3只大鼠，經股靜脈注射2%伊文思藍染料（5 ml/kg），1 h后采用2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉處死。迅速取出大腦，60 ℃甲酰胺中浸泡24 h，搜集大腦浸出液，采用熒光分光光度計檢測伊文思藍含量。

1.2.6 ELISA 檢測大鼠血清炎癥因子水平 取1.2.2 項下各組大鼠血清，ELISA測定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，嚴格按照試劑盒說明書包被酶標板，每孔50 μl，4 ℃靜置過夜。將包被好的酶標板用PBS 緩沖液沖洗3 次，緩沖液封閉，每孔100 μl，37 ℃下放置30 min。封閉好的板加標準品或待測組織勻漿各3孔，每孔50 μl，室溫放置4 h，每孔加入50 μl酶標抗體，室溫反應1 h，加入底物鄰苯二酚胺1 滴顯色，待標準曲線梯度明顯時用硫酸終止反應，讀取490 nm下光密度值。

1.2.7 ELISA 檢測大鼠大腦皮質組織中炎癥因子水平 取1.2.2項下各組大鼠大腦皮質勻漿，ELISA檢測其中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，嚴格按試劑盒說明書進行測定，詳細方法見1.2.6。

1.2.8 大腦皮質組織中氧化應激水平 取1.2.2項下各組大鼠大腦皮質勻漿，ELISA 檢測其中SOD、MDA 和GSH-Px 水平，嚴格按試劑盒說明書進行測定，詳細方法見1.2.6。

1.2.9 Western blot 檢測大鼠大腦皮質組織NF-κB/ERK 通路相關蛋白表達 取1.2.2項下各組大鼠大腦皮質勻漿，離心取上清液，按照BCA 試劑盒說明書步驟測得總蛋白濃度，將各組蛋白濃度調至相同。然后取同體積蛋白樣品液進行SDS-PAGE 電泳，分離蛋白，電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室溫下將膜與5%脫脂奶粉封閉孵育，獲得目的蛋白條帶，加入MMP-9、ERK、p-ERK、NF-κB P65 和p-NF-κB P65（1∶2 000）一抗4 ℃孵育過夜。洗膜，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜，電化學發(fā)光顯像，以GAPDH 作為內參，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對比條帶強弱，獲得各組蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，滿足正態(tài)分布的計量資料均以±s表示，采用單因素方差分析比較多組間差異性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 苦蕎黃酮提取物對大鼠神經功能缺損評分的影響 與模型組相比，尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠神經功能缺損評分明顯下降（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠神經功能缺損評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分（±s，分）Tab.1 Scores of neurological deficits of rats in each group （±s，score）

表1 各組大鼠神經功能缺損評分（±s，分）Tab.1 Scores of neurological deficits of rats in each group （±s，score）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Scores of neurological deficits 0 3.45±0.57 0.48±0.161）2.71±0.39 1.67±0.351）0.57±0.161）

2.2 苦蕎黃酮提取物對大鼠腦含水量和血腦屏障通透性的影響 與模型組大鼠相比，尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠腦含水量和伊文思藍滲出量明顯下降（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠腦含水量和伊文思藍滲出量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦含水量和血腦屏障通透性比較（±s）Tab.2 Comparison on water content of brain and permeability of blood-brain barrier of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腦含水量和血腦屏障通透性比較（±s）Tab.2 Comparison on water content of brain and permeability of blood-brain barrier of rats in each group（±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Water content of brain/%Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 69.42±1.77 77.73±2.75 72.08±1.771）Exudation volume of Evans blue dye/（ng·mg-1）3.13±0.56 15.03±2.42 4.78±0.861）76.95±2.25 11.45±1.94 74.07±1.981）8.39±1.701）72.57±1.641）4.88±0.921）

2.3 苦蕎黃酮提取物對大鼠血清炎癥因子水平的影響 ELISA 檢測結果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 苦蕎黃酮提取物對大鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of serum inflammatory factors of rats（±s，pg/ml）

表3 苦蕎黃酮提取物對大鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of serum inflammatory factors of rats（±s，pg/ml）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract TNF-α 42.37±4.21 109.02±9.02 46.82±3.941）IL-6 31.20±3.60 78.67±6.39 40.51±3.701）IL-1β 21.93±2.97 55.49±5.93 30.18±2.891）89.64±7.86 65.39±6.29 49.12±5.41 66.25±5.981）53.06±4.701）41.17±5.631）47.67±4.891）41.40±3.611）31.82±4.461）

2.4 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織中炎癥因子水平的影響 ELISA 檢測結果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質組織中TNF-α、IL-6和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠大腦皮質組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織中炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.4 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of inflammatory factors in brain cortex of rats （±s，pg/ml）

表4 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織中炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.4 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of inflammatory factors in brain cortex of rats （±s，pg/ml）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model TNF-α 6.57±1.43 22.01±2.77 IL-6 15.88±2.81 54.59±5.84 IL-1β 13.71±2.44 39.76±5.11 Nimodipine 7.60±1.781）27.89±3.571）15.70±2.741）Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 17.38±2.55 44.61±3.98 31.62±4.36 12.51±1.661）37.26±3.511）25.72±3.981）8.01±2.341）28.50±3.731）16.86±2.901）

2.5 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織中氧化應激水平的影響 ELISA 檢測結果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質組織中SOD 和GSH-Px 水平明顯升高，MDA水平明顯降低（P＜0.01）。見表5。

表5 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織中氧化應激水平的影響（±s）Tab.5 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on oxidative stress level in brain cortex of rats （±s）

表5 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織中氧化應激水平的影響（±s）Tab.5 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on oxidative stress level in brain cortex of rats （±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model SOD/（U·mg-1）112.57±2.33 61.35±1.44 MDA/（nmol·L-1）28.60±3.01 70.69±5.80 GSH-Px/（U·L-1）92.08±6.34 50.18±5.62 Nimodipine 104.81±2.531）31.06±3.101）82.60±8.231）Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 78.22±2.171）62.74±5.281）53.67±6.201）84.76±1.561）47.33±4.691）62.46±6.881）98.40±2.371）34.88±3.781）73.04±7.701）

2.6 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織NF-κB/ERK 通路相關蛋白表達的影響 如圖1、表6 所示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質組織中MMP-9、p-ERK/ERK和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平均明顯降低（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠大腦皮質組織中MMP-9、p-ERK/ERK 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 Western blot 檢測大鼠大腦皮質組織NF-κB/ERK通路相關蛋白表達Fig.1 Expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats detected by Western blot

表6 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織NF-κB/ERK 通路相關蛋白表達的影響（±s）Tab.6 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats （±s）

表6 苦蕎黃酮提取物對大鼠大腦皮質組織NF-κB/ERK 通路相關蛋白表達的影響（±s）Tab.6 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats （±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups MMP-9 p-ERK/ERK Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 0.22±0.04 1.36±0.19 0.34±0.061）0.16±0.05 0.79±0.15 0.23±0.051）p-NF-κB P65/NF-κB P65 0.04±0.01 0.38±0.04 0.08±0.041）1.22±0.13 0.60±0.10 0.35±0.05 0.63±0.101）0.45±0.101）0.21±0.041）0.34±0.051）0.24±0.051）0.11±0.041）

3 討論

SAH 是常見的腦部血管急癥，其起病迅速，致死致殘率高，常引起顱內壓升高、血腦屏障受損、腦水腫等腦部損傷［14］。臨床研究表明，尼莫地平在腦血管舒張作用方面具有較強的生物學活性，能夠通過血腦屏障進入腦組織發(fā)揮增加腦組織供血量、改善腦缺氧和修復受損腦神經等作用，使用尼莫地平治療SAH 患者也在臨床上取得了良好成效［15］。通過對比尼莫地平和苦蕎黃酮提取物對SAH 大鼠的治療效果及對ERK/NF-κB 信號通路的抑制作用，一定程度上能夠評估苦蕎黃酮提取物的臨床效應和調控SAH 大鼠腦組織神經炎癥和氧化應激的作用機制。本研究結果顯示，與模型組相比，尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠神經功能缺損評分、腦含水量和伊文思藍滲出量明顯下降。提示適宜濃度的苦蕎黃酮提取物能夠促進SAH 大鼠神經功能恢復，減輕腦水腫，修復血腦屏障，并顯示出劑量依賴性。

本研究結果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠血清及大腦皮質組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯下降，且隨劑量升高作用增強。說明中、高劑量苦蕎黃酮提取物能夠有效降低炎癥因子水平，SAH 所致的腦損傷的主要致病機制為蛛網膜下腔涌入大量血液，反應生成大量ROS，誘導TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎癥因子過表達，這類炎癥因子產生的趨化作用能夠介導中性粒細胞遷移和血管內皮細胞黏附，炎癥細胞向出血部位遷移，促使神經炎癥發(fā)生發(fā)展［16-17］。因此，苦蕎黃酮提取物能夠通過抑制SAH 引發(fā)的炎癥，發(fā)揮促進神經功能恢復的治療效果。此外，大量ROS引發(fā)脂質過氧化和DNA損傷，最終導致腦水腫和腦神經細胞死亡，同時自由基通過改變血管通透性，進一步損傷腦組織，是SAH 早期腦損傷的另一重要致病因素［18］。SOD 將超氧化物自由基轉化為H2O2，從而保護細胞不受氧自由基損傷，MDA 則是脂質過氧反應的終產物，可與核酸等大分子化合物交聯(lián)，影響線粒體活性，產生細胞毒性，二者常用作反映氧化損傷的指標。GSH-Px 能夠將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2分解，保護細胞膜結構與功能不受過氧化物的干擾及損害，其水平越高說明體內氧化應激水平越低，細胞功能越完善。既往研究發(fā)現(xiàn)，當機體氧化和抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡后，會形成氧化應激狀態(tài)，產生過量ROS 分子，造成細胞凋亡［19］。本研究結果顯示，苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質組織中SOD 和GSH-Px 水平較模型組明顯上升，MDA 水平明顯下降。說明苦蕎黃酮提取物能夠通過調節(jié)機體氧化應激水平，中斷SAH 引起的腦細胞損傷的快速級聯(lián)反應，促進神經功能恢復，修復SAH患者早期腦損傷。

SAH 發(fā)生后，ERK 信號被激活發(fā)生磷酸化，介導細胞凋亡、免疫炎癥反應等病理生理過程。既往研究表明，氧化應激、細胞因子和組織出血均能夠激活NF-κB 信號通路，使之磷酸化，并由胞質轉移至胞核，迅速調控相關基因轉錄和MMP-9 等下游蛋白水平，產生過度炎癥反應，引起組織和細胞損傷，抑制NF-κB 長久以來一直是研究新型抗炎藥物的風向標，通過抑制ERK 和NF-κB 信號通路，能夠抑制腦組織中炎癥水平，從而減輕腦損傷［20-21］。Western blot 檢測結果顯示，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠大腦皮質組織中MMP-9、p-ERK/ERK 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平均明顯低于模型組。說明苦蕎黃酮提取物可有效抑制ERK/NF-κB 信號通路相關蛋白表達，通過抑制ERK/NF-κB 信號通路可調節(jié)氧化應激和炎癥水平，修復腦損傷，發(fā)揮神經系統(tǒng)保護作用。

綜上所述，苦蕎黃酮提取物通過抑制ERK/NF-κB信號通路調控相關蛋白表達，減輕氧化應激與炎癥反應，進一步抑制腦組織神經元細胞凋亡，減輕SAH 早期腦損傷癥狀。該研究能夠為闡明苦蕎黃酮提取物治療SAH 早期腦損傷的作用機制提供理論支持，將為臨床診斷治療SAH提供新思路。