蔡 飛 李 沁 李海濤 滕云飛 胡國富 （華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢 430000）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)浸潤(rùn)和慢性炎癥等為主要特征的慢性疾?。?］。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是AS 發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵因子。AS發(fā)展早期，單核細(xì)胞向內(nèi)膜遷移聚集分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過其表面的跨膜蛋白，如SR-A、CD36 等過度攝取ox-LDL，變?yōu)槟懝檀钾?fù)載的泡沫細(xì)胞［2］。泡沫細(xì)胞可通過分泌炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β、TNF-α等加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定性從而加重AS［3-4］。NLRP3 在炎癥刺激和調(diào)節(jié)過程中起重要作用。研究表明，急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者外周血中檢測(cè)到NLRP3 蛋白表達(dá)升高，并與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，說明NLRP3 過度激活能夠加快AS 相關(guān)疾病進(jìn)展［5］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)AS模型小鼠表現(xiàn)出NLRP3炎癥通路激活，而NLRP3沉默能夠緩解機(jī)體炎癥以及延緩斑塊形成［6］。薯蕷皂苷元是（Diosgenin）主要以穿龍薯蕷、盾葉薯蕷作為原料，經(jīng)水解、提取制得的中藥單體，具有治療糖尿病、治療阿爾茨海默病、抗腫瘤、抗感染、抗炎及抗心血管疾病等功效［7-8］。已有研究表明，薯蕷皂苷元能夠抑制AS 中炎癥因子表達(dá)及斑塊形成，但與AS中NLRP3炎癥通路的相關(guān)作用機(jī)制尚未闡明［9］。鑒于此，本研究通過構(gòu)建RAW264.7 來源泡沫細(xì)胞模型探討薯蕷皂苷元對(duì)RAW264.7 來源泡沫細(xì)胞NLRP3炎癥通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7 細(xì)胞購自武漢普諾賽公司（貨號(hào)：CL-0190）；薯蕷皂苷元購自德國默克生物有限公司（貨號(hào)：D1634）；ox-LDL、蛋白提取試劑盒及BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自北京索萊寶生物有限公司（貨號(hào)：IO1300、BC3711、PC0020）；IL-1β及IL-18 ELISA 檢測(cè)試劑盒均購自武漢華美生物科技有限公司（貨號(hào)：CSB-E08054m、CSB-E04609m）；CCK-8 試劑盒、兔多抗GAPDH 及兔多抗Caspase-1均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司（貨號(hào)：RM02823、AC001、A0964）；兔單抗NLRP3 及兔單抗Cleaved GSDMD 購自美國CST 生物有限公司（貨號(hào)：15101、10137）；離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司；超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞置于含10%FBS、1% 青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2～3 d傳代1 次，0.25%胰酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7 細(xì)胞，采用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，接入96孔板（100 μl/孔），實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、薯蕷皂苷元組。其中模型組通過采用80 μg/ml ox-LDL 誘 導(dǎo)RAW264.7 細(xì) 胞24 h 建 立RAW264.7 來源泡沫細(xì)胞模型［10］；薯蕷皂苷元組分別加入不同濃度薯蕷皂苷元（1、2、4、8、16 μmol/L）及80 μg/ml ox-LDL 處理24 h，每組設(shè)空白對(duì)照孔，每孔重復(fù)3 次。加藥培養(yǎng)結(jié)束后加入10 μl CCK-8溶液37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)定各孔吸光度（A），細(xì)胞增殖率（%）=［A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組］/［A對(duì)照組-A空白對(duì)照組］×100%。

1.2.3 油紅O染色 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（不經(jīng)藥物干預(yù)）、模型組（80 μg/ml ox-LDL）、低劑量薯蕷皂苷元組（加入1 μmol/L 薯蕷皂苷元）及高劑量薯蕷皂苷元組（加入4 μmol/L 薯蕷皂苷元）。細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的6 孔板，藥物處理24 h 后去除培養(yǎng)基，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定10 min，新鮮配制的油紅O染液室溫孵育15 min，PBS 沖洗后甘油封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-1β 及IL-18 表達(dá) 藥物處理24 h 后收集對(duì)照組、模型組、低劑量薯蕷皂苷元組及高劑量薯蕷皂苷元組細(xì)胞，分別采用ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞IL-1β 及IL-18 表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) 藥物處理24 h 后收集對(duì)照組、模型組、低劑量薯蕷皂苷元組及高劑量薯蕷皂苷元組細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒步驟提取細(xì)胞總蛋白，定量30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPDH 一抗（1∶20 000 稀釋）、Caspase-1 一抗（1∶500 稀釋）、NLRP3 和Cleaved GSDMD 一抗（1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000 稀釋）室溫孵育2 h，TBST 清洗4 次。加入ECL 化學(xué)發(fā)光顯影后掃描膠片，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)通過SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 檢測(cè)不同濃度薯蕷皂苷元對(duì)RAW264.7 來源泡沫細(xì)胞活力的影響 CCK-8 檢測(cè)結(jié) 果 顯 示，80 μg/ml ox-LDL 處 理RAW264.7 細(xì) 胞24 h后細(xì)胞活力相比于正常組明顯下降。與模型組相比，2、4、8 μmol/L 薯蕷皂苷元處理后細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），且呈劑量依賴性（圖1）。

圖1 不同濃度的薯蕷皂苷元對(duì)RAW264.7 來源泡沫細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of diosgenin on viability of RAW264.7-derived foam cells

2.2 油紅O 染色觀察各組RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變化 油紅O染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)80 μg/ml ox-LDL 誘導(dǎo)24 h 后可見細(xì)胞中存在大量紅色脂滴，表明RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞建立成功；與模型組相比，低劑量及高劑量薯蕷皂苷元組泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴染色較淡（圖2）。

圖2 各組RAW264.7來源泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變化（×400）Fig.2 Changes of lipids in RAW264.7-derived foam cells in each group （×400）

2.3 試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β 及IL-18 表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞IL-1β 及IL-18水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，高劑量薯蕷皂苷元組RAW264.7 細(xì)胞IL-1β 及IL-18 水平顯著降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組細(xì)胞IL-1β及IL-18表達(dá)變化Fig.3 Changes of IL-1β and IL-18 expressions of cells in each group

2.4 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及Cleaved GSDMD 蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞NLRP3、Caspase-1 及Cleaved GSDMD表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，低劑量薯蕷皂苷元組RAW264.7 細(xì)胞Caspase-1 表達(dá)顯 著 降 低（P＜0.05），高 劑 量 薯 蕷 皂 苷 元 組RAW264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及Cleaved GSDMD表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1及Cleaved GSDMD 蛋白表達(dá)變化Fig.4 Expression changes of NLRP3， Caspase-1 and Cleaved GSDMD proteins of cells in each group

3 討論

AS是一種常見慢性疾病，主要特點(diǎn)為動(dòng)脈血管管腔在粥狀脂質(zhì)斑塊沉積作用下變窄，引起血流不暢，最終造成其下游組織缺血性損傷。AS不僅直接危害機(jī)體健康，還能引發(fā)動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層及冠狀動(dòng)脈疾病等一系列高危疾病，有較高的發(fā)病率和致死率，且治療難度大，治療成本高［11］。隨著人們生活水平逐漸提高，中老年人過量攝入高脂食物，AS 已成為中老年人易患的主要疾病之一。文獻(xiàn)報(bào)道，預(yù)估2020 年全球頸動(dòng)脈粥樣硬化患者有近20億人，我國可能有近2.7億患者，且呈逐年上升趨勢(shì)［12］。目前臨床治療AS 的藥物主要以調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂水平為主，一般分為他汀類、煙酸類、貝特類及膽酸螯合劑類等，這類藥物雖對(duì)AS 有一定治療作用，但也存在許多副作用，如肝臟功能損傷、胃腸道消化不良、過敏反應(yīng)等［13］。我國傳統(tǒng)中草藥對(duì)AS的治療具有多靶點(diǎn)、多途徑及毒副作用小的特點(diǎn)［14］。近年中草藥及中草藥提取物在治療AS 方面已取得巨大成就。研究證明大黃素、白藜蘆醇、丹皮酚、水蛭和三七總苷等對(duì)AS 防治具有良好療效［15］。本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)表明2、4、8 μmol/L薯蕷皂苷元能夠提高ox-LDL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞活力，油紅O 染色結(jié)果表明低劑量（1 μmol/L）及高劑量（4 μmol/L）薯蕷皂苷元可抑制RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞形成。而巨噬源性泡沫細(xì)胞形成是AS 進(jìn)程的初始環(huán)節(jié)。AS 發(fā)病初期，巨噬細(xì)胞通過大量攝取ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞，后期泡沫細(xì)胞沉積能導(dǎo)致AS早期形狀不規(guī)則脂質(zhì)條紋出現(xiàn)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)斑塊形成［3］。薯蕷皂苷元抑制泡沫細(xì)胞形成可能是其防止AS 發(fā)生發(fā)展的重要手段。

炎癥反應(yīng)在AS 發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要。大量研究證明AS 病灶處有大量炎癥因子存在，進(jìn)而推進(jìn)AS 發(fā)展［16］。NLRP3 炎癥通路在炎癥刺激和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。體內(nèi)過量的ox-LDL 和膽固醇等危險(xiǎn)信號(hào)能激活NLRP3，NLRP3 進(jìn)一步招募ASC 與Caspase-1結(jié)合形成多蛋白復(fù)合物，進(jìn)而激活Caspase-1，活化的Caspase-1 一方面對(duì)IL-1β 和IL-18 前體進(jìn)行切割，形成具有活性的IL-1β 和IL-18，另一方面對(duì)GSDMD進(jìn)行切割，形成GSDMD N 端結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔破裂，釋放IL-1β 及IL-18 等炎癥因子到胞外引起炎癥反應(yīng)［17-18］。研究表明，NLRP3 蛋白在冠心病患者血液中過表達(dá)并與AS嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，說明NLRP3 過度激活能夠加快AS 相關(guān)疾病進(jìn)展［19］。IL-36 受體拮抗劑能通過抑制NLRP3 炎癥途徑發(fā)揮AS保護(hù)作用［20］。通過給予ApoE基因敲除的AS小鼠NLRP3抑制劑MCC950可減少IL-1β、MCP-1和Caspase-1 等表達(dá)，減少斑塊形成、促進(jìn)斑塊穩(wěn)定性并改善血管功能［21］。因此，針對(duì)NLRP3 炎癥途徑可能是防治AS的有效策略。本研究中，與模型組相比，低劑量及高劑量薯蕷皂苷元組RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、Cleaved GSDMD、IL-1β及IL-18 表達(dá)均降低且隨薯蕷皂苷元?jiǎng)┝可?，降低幅度增大，提示RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞NLRP3通路被激活，而薯蕷皂苷元可抑制NLRP3 通路激活，進(jìn)而減少RAW264.7源性泡沫細(xì)胞IL-1β及IL-18等炎癥因子分泌。

綜上，薯蕷皂苷元可減少RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，抑制泡沫細(xì)胞形成，調(diào)節(jié)NLRP3通路減少炎癥因子分泌，改善細(xì)胞炎癥狀態(tài)，對(duì)防治AS有重要意義。