趙海棋，高慶芳，張澤愷，苗立中，劉建釵，苑文嫻，唐娜**

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安 271000）

作為細胞生物學(xué)試驗研究中的一個重要環(huán)節(jié)，細胞培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物工程、生命科學(xué)和藥物研發(fā)等領(lǐng)域，原代細胞也已成為基本的細胞生物學(xué)試驗研究樣品，在生理學(xué)、細胞生物化學(xué)、藥學(xué)、毒理學(xué)等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其中，雞胚成纖維細胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）因具有適應(yīng)性強、繁殖速度快、來源廣、成本低等優(yōu)勢，被大量應(yīng)用于生物工程研究與疫苗生產(chǎn)中，多種常見的病毒如禽馬立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）[1]、傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease，IBDV）[2]、火雞皰疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）[3]等的研究都以CEF 為重要材料。

目前，實驗室制備CEF 需要現(xiàn)用現(xiàn)制，大量使用雞胚，既增加受污染的風(fēng)險，也不利于動物福利，還給試驗研究帶來額外的工作量。因此，通過多次試驗，本研究嘗試建立一種快速、小量制備雞胚成纖維細胞的候選方案，在保障細胞活力、提高制備效率的同時，能夠降低受污染風(fēng)險，且可短期保存細胞，從而減少制備次數(shù)和雞胚使用量。

1 材料與方法

1.1 材料

動物組織：SPF 雞胚，購于濟南斯帕法斯家禽有限公司。

試劑：細胞培養(yǎng)基（DMEM、MEM、M199）、血清（胎牛血清、新生牛血清）、胰蛋白酶等細胞培養(yǎng)試劑，購自賽默飛世爾；Cell Counting Kit-8 試劑盒，購自TargetMol 公司。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)胰酶消化法 組織處理：無菌取4 只9～11 日齡SPF 雞胚組織，去頭、四肢、內(nèi)臟，PBS 清洗1～2 次，均勻剪碎成1～2 mm 大小組織塊；反復(fù)清洗3～4 次，直至組織塊發(fā)白、液體清亮，用10 mL PBS 重懸后均勻分成兩份備用。

常規(guī)胰酶消化法：取一份上述組織懸液棄去PBS，以10 mL 胰酶（0.25 %）清洗一次，棄去大部分上清，重新加入胰酶至25 mL，37 ℃搖床（150 rpm）消化30 min。棄去大部分上清后用10 mL 無血清培養(yǎng)基反復(fù)吹打分散，直至組織塊松散消失。1 500 rpm 離心5 min，棄上清，加入10 mL 細胞培養(yǎng)基重懸，將組織混懸液濾過無菌尼龍濾網(wǎng)（70 μm）收集細胞混懸液，稱量濾網(wǎng)上組織殘留量。

1.2.2 短時多次消化法 取一份相同量的組織懸液于50 mL 錐形瓶中，靜置后棄去上層PBS，加入12 mL 胰酶，渦旋或手動搖勻2 min，確保組織完全懸起。靜置30 s，待組織塊下沉后，轉(zhuǎn)移上層至一個無菌收集管內(nèi)，加入0.2 mL 血清終止胰酶作用。向剩余組織塊中再次加入10 mL 胰酶，重復(fù)消化和收集步驟2～3 次，直至組織塊基本消化完全。將收集到的全部懸液以1 500 rpm 離心5 min，棄上清，加入10 mL 細胞培養(yǎng)基重懸，將組織混懸液濾過無菌尼龍濾網(wǎng)（70 μm）去除細胞團塊，收集細胞混懸液，稱量濾網(wǎng)上組織殘留量。

1.2.3 細胞計數(shù) 收集細胞樣品，用臺盼藍染色，采用細胞計數(shù)儀分別對1.2.1 和1.2.2 制備的細胞進行計數(shù)，乘以體積計算總細胞數(shù)量和活細胞數(shù)量。

分別對1.2.1 和1.2.2 制備細胞時所收集到的殘留組織進行稱重，比較殘留組織量。

1.2.4 細胞活力測定 分別用1.2.1 和1.2.2 制備的細胞鋪設(shè)96 孔細胞培養(yǎng)板，各設(shè)置3 個接種密度梯度（1×104個/mL、4×104個/mL、8×104個/mL），每個梯度設(shè)3 個重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h，按照說明書所述每孔按10:1 加入Cell Counting Kit-8 ，充分混合后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm 波長下的光吸收值，計算細胞活性[4]。

1.3 細胞4 ℃保存條件優(yōu)化

1.3.1 血清對細胞的影響 分別使用新生牛血清和胎牛血清兩種不同血清（按0、2%、5%濃度添加）配制細胞培養(yǎng)液，分別用于保存CEF 細胞5 d 以上，期間每天取樣鋪6 孔板，觀察細胞生長狀態(tài)，同時按照1.2.3 所述方法測定活細胞數(shù)量。

1.3.2 培養(yǎng)基對細胞的影響 分別使用M199、MEM和DMEM 3種不同培養(yǎng)基配制細胞培養(yǎng)液，分別用于保存CEF 細胞5 d 以上，期間每天取樣鋪6 孔板，觀察細胞生長狀態(tài)，同時按照1.2.3 所述方法測定活細胞數(shù)量。

1.3.3 胰酶殘留量對細胞的影響 分別向細胞培養(yǎng)液中添加0.1%、0.5%、2.0%、5.0%胰酶工作液，分別用于保存CEF 細胞5 d 以上，期間每天取樣鋪6 孔板，觀察細胞生長狀態(tài)，同時按照1.2.3 所述方法測定活細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Graphpad Prism 8 軟件進行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±平方差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 兩種消化方式對細胞數(shù)的影響

表1 為兩種消化方式對收獲細胞總數(shù)與活細胞數(shù)的影響。由表1 可知，兩種消化方式最終收獲的細胞總數(shù)與活細胞數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

表1 兩種消化方式對收獲細胞總數(shù)與活細胞數(shù)的影響

2.2 兩種消化方式對細胞活力的影響

圖1 為兩種消化方式對細胞活力的影響。由圖1 可知，在常用細胞接種條件下（4×104～8×104個/mL），短時多次消化法制備的CEF 細胞活力顯著高于常規(guī)胰酶消化法制備的CEF 細胞（P＜0.05）。

圖1 兩種消化方式對細胞活力的影響

2.3 不同血清類型及添加量對4 ℃保存條件下活細胞數(shù)的影響

圖2 為不同血清類型及添加量對4 ℃保存條件下活細胞數(shù)的影響。由圖2 可知，在低添加量血清條件下（≤2%），細胞保存效果較好，尤其是不添加血清時，保存72 h 內(nèi)活細胞量無明顯下降（P＞0.05）。新生牛血清對保存細胞的影響比胎牛血清更輕，但相同添加量差異不顯著（P＞0.05）。各試驗組的活細胞數(shù)量在72 h 后均有不同程度的下降，但是從細胞接種后的生長狀態(tài)來看，保存96 h 后的細胞接種培養(yǎng)24 h 后仍可長滿單層，生長狀態(tài)良好（圖3）。

圖2 不同血清類型及添加量對4 ℃保存條件下活細胞數(shù)的影響

圖3 無血清條件下保存的細胞生長能力比較（詳見附錄彩圖）

2.4 不同培養(yǎng)基對4 ℃保存條件下活細胞數(shù)的影響

圖4為不同培養(yǎng)基對4 ℃保存條件下活細胞數(shù)的影響。由圖4 可知，3 種不同培養(yǎng)基對不同保存時間的活細胞數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。

圖4 不同培養(yǎng)基對4 ℃保存條件下活細胞數(shù)的影響

2.5 胰酶濃度對細胞短期保存的影響

圖5為不同胰酶添加量對4℃保存條件下活細胞數(shù)的影響。由圖5 可知，盡管加入胰酶可以有效減少細胞結(jié)團，但是從細胞存活率來看，胰酶添加量越多，活細胞數(shù)下降越快。在低胰酶條件（≤0.5%）下的細胞保存48 h 內(nèi)活細胞數(shù)無顯著差異（P＞0.05），保存72～144 h 時無胰酶組活細胞數(shù)高于其他添加胰酶組（P＜0.05）。

圖5 不同胰酶添加量對4℃保存條件下活細胞數(shù)的影響

3 討論

原代細胞不能建立細胞庫，只能局限于原始培養(yǎng)或少數(shù)傳代[5]。實驗室內(nèi)制備原代細胞，往往需要新鮮制備，保存條件苛刻，而且需要大量動物或組織，耗費人力物力、污染風(fēng)險高、難以保持一致性，且不利于動物福利[6]。在本研究中，我們嘗試建立了一種胰酶消化時間更短的CEF 細胞制備方法，同時摸索了細胞在4 ℃短期保存的條件。

常規(guī)胰酶消化法在消化過程中，細胞長時間接觸胰酶、機械吹打分散等操作都會影響細胞活力。短時多次消化法減少了胰酶與細胞接觸的時間，同時也減少了機械分散的力度和作用時間。通過CCK-8 測定證實，該方法所收獲的細胞活力顯著高于常規(guī)消化法。此外，短時多次消化法無需反復(fù)更換容器，污染風(fēng)險低，操作易于標(biāo)準(zhǔn)化，操作用的耗材易于進一步開發(fā)成一次性原代細胞制備裝置[7]。

試驗發(fā)現(xiàn)，相較于培養(yǎng)基來講，血清和胰酶對細胞保存的影響更大。值得注意的是，胎牛血清比新生牛血清更不利于細胞保存，而且血清濃度越高，保存效果越差，細胞更容易起團，推測與血清中的某些生長因子有關(guān)，原因有待進一步研究。添加胰酶可以減少細胞結(jié)團，但會導(dǎo)致細胞活率下降。相較來看，不添加胰酶更利于細胞保存。

4 結(jié)論

本試驗建立了一種快速、簡易、可短期儲存的CEF 制備方法。該方法采用短時多次消化，將胰酶與細胞接觸時間縮短至2 min，可以有效保障細胞活力。新鮮制備的CEF 細胞在4 ℃、無血清、無胰酶條件下保存96 h，細胞生長和貼壁效果仍然較好。該方法的建立為實驗室內(nèi)快速制備、保存高質(zhì)量CEF 細胞提供參考方案。