耿宇航，周欣瑩，賈艷艷，孫浩男，劉冬云

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000）

毛茛科（Ranunculaceae）鐵線(xiàn)蓮屬（Clematis）植物大多為藤本植物，觀賞價(jià)值極高，不僅常被用于籬垣廊架的垂直綠化和裝飾，還可用于地被、盆栽等［1］。其植株姿態(tài)優(yōu)雅，花色艷麗，花型豐富，有平展呈盤(pán)狀、鐘狀、半鐘狀及鈴鐺狀，單瓣或重瓣，花期較長(zhǎng)，全年不同品種可交替開(kāi)花［2-3］。我國(guó)鐵線(xiàn)蓮種質(zhì)資源豐富，幾乎涵蓋了鐵線(xiàn)蓮屬所有類(lèi)型［4］。根據(jù)英國(guó)皇家園藝協(xié)會(huì)的分類(lèi)，目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的園藝品種可以分為：全緣組、南歐組、佛羅里達(dá)組、德克薩斯組和長(zhǎng)瓣組等［5］。德克薩斯組鈴鐺型鐵線(xiàn)蓮為多年生草質(zhì)藤本，花單生，花型精巧，杯型，似“小鈴鐺”，下垂，萼片4 枚，莖葉纖細(xì)，花色豐富，萼片反卷程度不同，上下萼花色不同，萼片邊緣有波浪狀起伏，觀賞價(jià)值高，花期長(zhǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)。根據(jù)在華北地區(qū)栽種的表現(xiàn)，鈴鐺鐵線(xiàn)蓮花期為5—9月，在夏季高溫天氣仍然能保持小鈴鐺般優(yōu)雅的姿態(tài)，為華北地區(qū)垂直綠化提供新的選擇，但由于鐵線(xiàn)蓮育種年限漫長(zhǎng)［6］，基因型高度雜合，后代分離廣泛［7］，只依靠形態(tài)學(xué)特征探究其真實(shí)性及遺傳特性會(huì)大大降低其育種效率。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鐵線(xiàn)蓮屬植物的研究仍然以大花鐵線(xiàn)蓮為主［8］，而有關(guān)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮的研究較少。鈴鐺鐵線(xiàn)蓮品種多產(chǎn)于北美和日本，其主要親本包括革花鐵線(xiàn)蓮（C.viorna）等，國(guó)內(nèi)也有部分花型相似野生種，如褐毛鐵線(xiàn)蓮（C.fusca）、芹葉鐵線(xiàn)蓮（C.aethusifolia）、甘青鐵線(xiàn)蓮（C.tangutica）等，褐毛鐵線(xiàn)蓮和甘青鐵線(xiàn)蓮早自19 世紀(jì)被引入歐洲［9］，可能也參與了鈴鐺鐵線(xiàn)蓮的育種進(jìn)程。有性雜交育種仍然是鐵線(xiàn)蓮屬植物品種創(chuàng)新的最主要的、效果顯著的途徑［8,10］，但國(guó)內(nèi)鐵線(xiàn)蓮育種起步較晚，與國(guó)外育種研究差異較大［11］。限制鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交育種的主要因素包括敗育［5］、育種年限漫長(zhǎng)等，而利用分子標(biāo)記對(duì)其雜交F1代進(jìn)行鑒定，可以在植株生長(zhǎng)早期從分子角度鑒定其是否為真雜種，較形態(tài)學(xué)鑒定更加穩(wěn)定、快捷和準(zhǔn)確。目前，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于鐵線(xiàn)蓮屬植物親緣關(guān)系及遺傳變異分析的研究中，如ISSR［12-13］、SSR［14］、RAPD［15］等，但對(duì)于其雜交子代，目前僅有雜交座果率和結(jié)實(shí)率、子代表型等研究［6,16-17］，Yuan 等［18］利用RAPD 技術(shù)對(duì)卷萼鐵線(xiàn)蓮（C.tubulosa）和短尾鐵線(xiàn)蓮（C.brevicaudata）的雜交F1代進(jìn)行了分子鑒定，其他分子鑒定研究鮮有所見(jiàn)。ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)是目前常用的分子生物學(xué)分析手段之一，它將SSR 和AFLP 的許多優(yōu)點(diǎn)與RAPD 的普遍性結(jié)合起來(lái)，具有多態(tài)性良好、成本低、操作便捷等特點(diǎn)［19-20］。本研究利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交F1代幼苗進(jìn)行真實(shí)性鑒定及遺傳多樣性分析，旨在為鈴鐺鐵線(xiàn)蓮新品種選育、指紋圖譜構(gòu)建等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料中6 個(gè)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮品種分別為‘蓬巴杜’‘妙?！鞣苼啞材崴_’‘斯嘉麗’和‘胭脂扣’（圖1）。將6 個(gè)品種進(jìn)行組配后進(jìn)行常規(guī)人工雜交，獲得結(jié)實(shí)數(shù)、有胚率及發(fā)芽率如表1 所示，挑選長(zhǎng)勢(shì)較為良好的F1代取材0.2 g 葉片，共獲得37 份雜交F1代材料。

表1 雜交組合信息Table 1 Information of hybrid combinations

圖1 雜交親本材料Fig.1 Flowers of the hybrid parents

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取與檢測(cè) 采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒（CW0531M，康為世紀(jì)），按照說(shuō)明書(shū)步驟提取親本和子代的DNA，將檢測(cè)合格的DNA 模板及引物濃度分別稀釋成50 ng/μL、10 μmol/L 的工作液，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 特異性引物的篩選及PCR 擴(kuò)增 本試驗(yàn)參照王鑫［11］對(duì)鐵線(xiàn)蓮屬植物的ISSR 引物及ISSR-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序進(jìn)行操作，引物及序列如表2 所示。挑選多態(tài)性良好的12 條引物進(jìn)行親本特異性篩選。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度依據(jù)引物設(shè)定，72 ℃延伸1 min，設(shè)置PCR 反應(yīng)總程序共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用FR-2000 成像系統(tǒng)上觀察并保存圖像。

表2 12 條多態(tài)性高的ISSR 引物Table 2 12 ISSR primers with high polymorphisml

1.2.3 子代真實(shí)性鑒定 用篩選出的多態(tài)性高、且具有父本特異性條帶的引物組合對(duì)供檢驗(yàn)的37 個(gè)F1代進(jìn)行雜交子代身份真實(shí)性鑒定。參照文獻(xiàn)［21］的判定標(biāo)準(zhǔn)，子代PCR 產(chǎn)物中產(chǎn)生與父本一致條帶或出現(xiàn)不同于父母本的條帶類(lèi)型即為真雜種，若產(chǎn)生母本一致條帶則為假雜種或自交種。從擴(kuò)增的電泳圖中選擇清晰可重復(fù)的條帶，同位點(diǎn)上有條帶的記“1”，無(wú)條帶的記“0”，轉(zhuǎn)化為1、0 矩陣，利用利用 Popgene 32 軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Na）等指數(shù)，利用 NTsys 2.10 軟件分析，使用UPGMA 法繪制聚類(lèi)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 的純度檢測(cè)

對(duì)37 份雜交F1 代材料提取DNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度（圖2），所提取DNA 條帶清晰無(wú)拖帶，其OD 值的結(jié)果均在1.7 ～2.2 之間，說(shuō)明DNA 純度較高、無(wú)蛋白質(zhì)和RNA 污染，可以投入試驗(yàn)繼續(xù)使用。

圖2 37 份雜交F1 代DNA 基因組電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of genomic DNA from 37 hybrids

2.2 ISSR 標(biāo)記特異性條帶鑒定

由圖3 和表3 可知，12 條引物在鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交親本和F1代中可產(chǎn)生多個(gè)片段，多態(tài)性高，均可表現(xiàn)父本特異性，觀察到的特異性條帶可用作評(píng)估雜種純度的標(biāo)記，利用能夠表現(xiàn)父本特異性的引物進(jìn)行下一步雜種的鑒定。

表3 不同雜交組合的引物篩選結(jié)果Table 3 Filtering results of different primer combination

圖3 6 個(gè)雜交組合在引物下的部分PCR 擴(kuò)增電泳圖譜Fig.3 Partial PCR amplification results of 6 hybridization combinations

2.3 后代擴(kuò)增結(jié)果和分析

在ISSR 鑒定結(jié)果中，只有成功擴(kuò)增出每個(gè)雜交組合中父本的特異性條帶的引物才可被認(rèn)定是驗(yàn)證該雜交子代真實(shí)性的引物。雜種和親本共43 份材料，在上述特異性引物檢測(cè)下條帶主要分布在250 ～2 000 bp，條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表所示（表4）。37 份材料均具有豐富的遺傳多樣性，F(xiàn)1代與親本共有條帶占多數(shù)，但也有X38 和X55 組合中子代條帶與父本共有偏多，說(shuō)明這些雜交F1代得到父本的遺傳物質(zhì)較多，也說(shuō)明了產(chǎn)生的F1代為真雜種；雜交F1代出現(xiàn)的多態(tài)性條帶分別來(lái)自父本或母本，說(shuō)明不同子代遺傳了父母本不同的遺傳物質(zhì)，同時(shí)有些子代還出現(xiàn)了雙親均無(wú)的條帶，說(shuō)明在雜交過(guò)程中，可能由于基因重組發(fā)生了新的變異。

表4 雜交F1 代的ISSR 擴(kuò)增位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)信息Table 4 Statistical information of ISSR amplified loci of F1 hybrid

2.4 遺傳多樣性分析

采用多個(gè)遺傳參數(shù)對(duì)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交后代遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，鈴鐺鐵線(xiàn)蓮親本和F1代的等位基因數(shù)范圍在1.829 ～1.939 之間，等位基因數(shù)在1.410 ～1.639 之間、基因多樣性為0.251 ～0.362 之間、多樣性信息指數(shù)為0.385 ～0.531之間，基因庫(kù)較為豐富。

植物間遺傳相似系數(shù)越大，說(shuō)明遺傳背景越相似。鈴鐺鐵線(xiàn)蓮親本和子代之間的遺傳相似性系數(shù)在0.400 ～0.771 之間，F(xiàn)1代與親本相差較大的為X155 雜交組合（表5），變動(dòng)幅度為0.371，其中D5 與父本‘安尼薩’親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，相似性系數(shù)為0.400，D3、D4、D6 與母本‘索菲亞’最為相似，相似性系數(shù)為0.771。F1代之間相似性系數(shù)相差較大的為X162 組合，7 個(gè)F1代遺傳相似性系數(shù)在0.523 ～0.886 之間，平均相似性系數(shù)為0.702，其中，D5 和D6 親緣關(guān)系最近，相似性系數(shù)可達(dá)0.886，D4 和D9 相似性系數(shù)最低，為0.523。由此可見(jiàn)，F(xiàn)1代和親本之間、F1代之間都存在著豐富的遺傳變異。

表5 ISSR 標(biāo)記的X155 組合中親本與雜交F1 代遺傳相似性系數(shù)Table 5 Genetic similarity coefficients between parents and F1 hybrids in the X155 combination marked by ISSR

2.5 聚類(lèi)分析

根據(jù)遺傳相似性系數(shù)矩陣，利用UPMGMA 法進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖（圖4）。從樹(shù)狀圖看出，鈴鐺鐵線(xiàn)蓮F1代雜種和父母本的遺傳相似系數(shù)在0.420 ～0.770 之間，變動(dòng)幅度為0.350，雜交F1代和親本可大致都分為2 類(lèi)，X38、X155、X168 組合中F1代為偏父型，X18、X55、X162 組合中F1代為偏母型。在X18 組合中，親本和F1代的遺傳相似系數(shù)在0.510 ～0.820 之間，以遺傳相似系數(shù)0.542 為閾值，親本和子代可分為2 大類(lèi)，第1類(lèi)為母本‘妙?！? 個(gè)子代，第2 類(lèi)為父本‘蓬巴杜’，其中子代中的A4 和A7 最為相似，相似性系數(shù)達(dá)0.820，A4、A7、A1、A5 與母本的親緣關(guān)系較近。在X38 組合，親本和6 個(gè)雜交F1代的遺傳相似系數(shù)在0.480 ～0.890 之間，以遺傳相似系數(shù)0.568 為閾值，親本和子代可分為2 大類(lèi)，第1 類(lèi)為母本‘蘇菲’，第2 類(lèi)為父本‘蓬巴杜’和雜交F1代，而在第2 個(gè)分支中，F(xiàn)1代先聚為1 類(lèi)，再與父本聚為1 個(gè)分支，表明F1代都為偏父型，與父本親緣關(guān)系較近，但雜交F1代之間又比其在雙親間親緣關(guān)系更近，其中子代B3 和B6 最為相似，遺傳相似性系數(shù)可達(dá)0.900。

圖4 6 個(gè)雜交組合親本和子代的UPGMA 聚類(lèi)圖Fig.4 UPGMA clustering of parents and hybrids of the 6 hybrid combination

3 討論

雜交可以繼承父母本的優(yōu)良性狀，還可以創(chuàng)造新的優(yōu)良性狀，豐富物種遺傳多樣性。對(duì)于鈴鐺鐵線(xiàn)蓮的生物學(xué)特性來(lái)說(shuō)，對(duì)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交后代進(jìn)行早期鑒定是十分必要的，利用分子鑒定能夠較早地剔除假雜種，為進(jìn)一步育種工作的展開(kāi)提供依據(jù)［22］。12 條引物在鈴鐺鐵線(xiàn)蓮中都能擴(kuò)增出多態(tài)性高且具有特異性的條帶，但不同品種的特異性引物有所區(qū)別。F1代在引物的擴(kuò)增下，均遺傳了父本的特異性條帶或產(chǎn)生了新的帶型，為真雜種，且多數(shù)條帶都來(lái)自于親本，出現(xiàn)了父母本條帶結(jié)合的情況，例如X18、X168 組合，雙親共有條帶可占比45.38%、52.20%，說(shuō)明這些F1代融合了父母本的遺傳物質(zhì)，可能表型會(huì)更加豐富。但也有F1代在引物的擴(kuò)增下出現(xiàn)了新的條帶，即產(chǎn)生了父母本均不具有的條帶類(lèi)型，尤其是X38 和X162 組合中，分別出現(xiàn)了25 和28 個(gè)新位點(diǎn)，說(shuō)明雜交后代的基因發(fā)生了重組，可能會(huì)產(chǎn)生新的性狀，原因可能是父母本雜合性較高，不同長(zhǎng)度的等位核苷酸序列之間形成了異源雙鏈體，表現(xiàn)為不同于親代的新位點(diǎn)，這在Dongre［23］對(duì)棉屬（Gossypium）雜種后代的鑒定、Jade［24］對(duì)珍珠粟（Pennisetum glaucum）和象草（(Pennisetum purpureumSchumach）種間雜種后代的研究中都出現(xiàn)了相似的情況。

鈴鐺鐵線(xiàn)蓮37 個(gè)F1代真雜種單株和父母本的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.400 ～0.771，變動(dòng)幅度為0.371，說(shuō)明鐵線(xiàn)蓮雜交F1代具有較豐富的遺傳變異性。ISSR 聚類(lèi)圖分析結(jié)果表明這6 個(gè)組合出現(xiàn)了不同的偏向父母本的情況，X18、X55、X162為偏母型，和母本親緣關(guān)系較近的原因可能是細(xì)胞質(zhì)基因在遺傳性狀的表達(dá)中發(fā)揮了作用［25］；而X38、X155、X168 都為偏父型，推斷可能是在雜交過(guò)程中發(fā)生了染色體的不均衡分配，一些DNA 片段的插入所導(dǎo)致［26］。而Carvalho［27］在對(duì)小麥族（Triticeae）種間雜交F1代遺傳關(guān)系進(jìn)行分析時(shí)，也出現(xiàn)了不同雜交組合偏向不同父母本的現(xiàn)象。

在雜交過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，溫度降低會(huì)延長(zhǎng)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交種的成熟時(shí)間，且鈴鐺雜交成熟種存在休眠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的現(xiàn)象，有的可長(zhǎng)達(dá)1 年，但余偉軍［9］發(fā)現(xiàn)，在雜交種由綠變黃時(shí)取下，隨取隨播可以減少種子休眠物質(zhì)的積累，可以起到促進(jìn)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜種萌發(fā)的作用。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)以‘蓬巴杜’品種作為雜交組合的母本，結(jié)實(shí)率高，出苗時(shí)間較早，長(zhǎng)勢(shì)較快，Xu［28］等對(duì)白樺（Betula platyphylla）雜種后代進(jìn)行分析研究后發(fā)現(xiàn)以白樺系Q3 作為雜交組合的母本，其后代具有較強(qiáng)的性狀，身高和直徑表現(xiàn)較好；Gupta［29］也發(fā)現(xiàn)珍珠粟（Pennisetum glaucum）雜交F1代的雜種優(yōu)勢(shì)和G4R、G10B 等親本有關(guān)。待F1代植株成熟后，可結(jié)合其形態(tài)特征進(jìn)行進(jìn)一步分析，為未來(lái)其育種做準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

本研究首次利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交F1代進(jìn)行真實(shí)性鑒定和遺傳多樣性分析，37 個(gè)F1代均為真雜種，獲得親本結(jié)合的遺傳物質(zhì)較多，還產(chǎn)生了新的遺傳物質(zhì)，具有產(chǎn)生遺傳變異的特點(diǎn)，且遺傳多樣性豐富。F1代在基因上出現(xiàn)了明顯偏向某一方的現(xiàn)象，為后續(xù)雜交親本選擇與選配提供借鑒。ISSR 分子標(biāo)記可有效地在鈴鐺鐵線(xiàn)蓮雜交后代生長(zhǎng)早期用于鑒定其是否為真雜種，為鈴鐺鐵線(xiàn)蓮新品種選育、指紋圖譜構(gòu)建等提供分子依據(jù)。