潘紅英，寧天玉，許燁婷，周虹雨，徐 兵

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

鹿茸菇（Lyophyllum decastes） 學(xué)名荷葉離褶傘[1]，因其形狀與中藥鹿茸相似而得名。鹿茸菇富含膳食纖維、礦物質(zhì)、縮氨酸和維生素，口感鮮美滑嫩，具較高的營養(yǎng)價值[2]。其子實體含有鹿茸菇粗多糖，具有抗腫瘤、降血壓、降膽固醇、抵抗過敏原等功效，是一種特殊的食藥兼用菌[3]。基于口感優(yōu)勢和營養(yǎng)價值，鹿茸菇的市場前景較好，目前我國的部分地區(qū)已經(jīng)在生產(chǎn)基地實現(xiàn)了規(guī)?；耘?。但鹿茸菇菌種退化速度快，很難長期保持良好的性狀特征，使得產(chǎn)量難以維持，這成為制約鹿茸菇產(chǎn)業(yè)健康、快速、可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素[4]。近幾年，隨著菌種退化問題愈發(fā)嚴重，我國食用菌企業(yè)開始意識到應(yīng)當(dāng)重視并加強對菌種的保護和研發(fā)力度，不斷開展優(yōu)良菌種選育試驗[5]。

結(jié)合鹿茸菇生產(chǎn)基地栽培情況，課題組選擇了來自昆山、連云港、常熟3 個不同產(chǎn)地的菌種進行雜交，通過單孢雜交育種獲得具有雜種優(yōu)勢的鹿茸菇雜合子新菌株，以期為我國鹿茸菇的工廠化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種，助力我國鹿茸菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

鹿茸菇K，昆山青禾食用菌科技有限公司提供；鹿茸菇L，連云港中恒生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供；鹿茸菇C，采摘于常熟虞山。

1.1.2 試劑

無水乙醇、蔗糖、氯化鈉，中國國藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.1.3 試驗器材

M124A 電子天平，蘇州恒商工業(yè)設(shè)備有限公司；LDZX-75KBS 高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250BIII 生化培養(yǎng)箱，上海儀天科學(xué)儀器有限公司；DZF-6020 恒溫干燥箱，上海測博生物科技發(fā)展中心；SW-CJ-2F 超凈工作臺，上海川昱實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 單孢子的收集、分離

1） 孢子收集：選擇新鮮、菇形完整、發(fā)育健壯的鹿茸菇子實體，在超凈工作臺內(nèi)，用75%的酒精棉球?qū)β谷坠奖砻孢M行消毒[6]，去除菌柄，將菌蓋放入無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。每個產(chǎn)地的菌株均設(shè)5 組平行試驗，進行孢子的收集。

2） 單孢分離：恒溫24 h 后，在每個培養(yǎng)皿中分別加入1 mL 生理鹽水，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，讓生理鹽水和皿底充分接觸，以便形成孢子懸液。用移液槍從培養(yǎng)皿中吸出0.2 mL 孢子懸液，移入無菌PDA平板培養(yǎng)基中涂布均勻。每個處理設(shè)3 組平行試驗共9 個培養(yǎng)皿，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。待孢子萌發(fā)后，鏡檢觀察，將確認只有1 個孢子萌發(fā)的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基切下，轉(zhuǎn)接至試管斜面培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿試管。

1.2.2 單核菌絲的鑒定

將斜面中的鹿茸菇單孢萌發(fā)菌絲接種在PDA 平板培養(yǎng)基上，每個平板上呈正方形接種4 個菌塊。25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長至1～2 cm，用顯微鏡對采集到的孢子菌絲進行觀察。如果菌絲有鎖狀聯(lián)合，判斷該菌絲是雙核菌絲；如果菌絲無鎖狀聯(lián)合，則判斷該菌絲是單核菌絲。將單核菌絲的單孢子轉(zhuǎn)移至平板培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)12 d 后，觀察菌絲生長情況。

通過劃 “十” 字法測量菌落直徑，菌絲的平均生長速度（V，mm·d-1） 的計算公式為：

V=（φ－6）/2×D

式中：φ 為菌落直徑（mm）；D 為菌絲生長天數(shù)（d）。

1.2.3 單核菌株期的拮抗測定

3 個產(chǎn)地的鹿茸菇單核菌株首先采用兩兩組合的方法進行拮抗試驗，即分別在各菌株菌落邊緣菌絲生長旺盛的地方，用滅菌接種鏟切取約1 cm×1 cm的菌種塊，將兩菌塊接種于同一個PDA 平板培養(yǎng)基上，兩菌塊之間保持一定距離。接種后以封口膜封口，將平板倒置于25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中需及時剔除染雜菌的平板。待菌絲長滿平板后，觀察待測菌株在菌絲交界處是否出現(xiàn)拮抗反應(yīng)。

1.2.4 單孢雜交方法

在同一個PDA 平板培養(yǎng)基上，隨機挑選2 個長勢較快的不同親本的單孢菌株進行配對雜交，兩接種塊之間的距離約為2 cm。接種后用封口膜封好，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)2 個接種塊的菌絲生長至彼此接觸時，在交界處切取約1 cm × 1 cm的正方形菌塊，轉(zhuǎn)接至新制的PDA 平板培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。待菌絲長滿平板后，用無菌接種環(huán)挑取部分菌絲，用顯微鏡觀察菌絲間是否出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象[7]。如未出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，判斷是由鹿茸菇單孢萌發(fā)生成的單核菌絲；出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合的確定為雜交形成的新菌株，將其轉(zhuǎn)接至試管斜面培養(yǎng)基中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿試管[8]。

1.2.5 雜交菌株的拮抗測定

將獲得的子代雜交菌株依次進行編號，2 個親本和對應(yīng)的雜交菌株采用等邊三角形接種的方式，即分別切取雜交菌株和兩親本菌株的菌塊，將3 個菌塊接種于同一PDA 平板培養(yǎng)基上使之呈等邊三角形分布，兩兩之間間隔2～3 cm。轉(zhuǎn)接后的培養(yǎng)皿用封口膜封口，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記錄平板上的菌絲生長狀況。待菌絲長滿PDA 平板后，根據(jù)拮抗線來判斷三者之間的親緣關(guān)系。觀察2 個親本和雜交菌株在菌絲體交界處是否具有明顯的拮抗現(xiàn)象，如有明顯拮抗線，說明雜交獲得的新菌株與親本不是同種菌株。注意去除被雜菌污染的平板。

1.2.6 雜交菌株室內(nèi)子實體誘導(dǎo)

將雜交菌株接種在PDA 平板培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)5 d，后轉(zhuǎn)移至19 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，采用12 h 強光（3 000 lx） 光照加12 h暗光（無光照） 交替的方式進行光照刺激，誘導(dǎo)形成子實體。根據(jù)子實體形成情況保留結(jié)實能力好的雜交菌株，淘汰污染以及無結(jié)實能力的雜交菌株。每個雜交菌株進行3 個重復(fù)，25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 d 后，觀察菌絲生長情況并計算菌絲平均生長速度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢子的分離培養(yǎng)

2.1.1 單孢子的收集

經(jīng)過孢子的收集、單孢子的分離和鑒定，共獲得鹿茸菇K 單核菌株18 個，鹿茸菇L 單核菌株21個。經(jīng)鏡檢后培養(yǎng)獲得單核菌株39 個。

2.1.2 單核菌絲分離情況

單核菌絲分離情況詳見圖1 和圖2。

圖1 無鎖狀聯(lián)合的單核鹿茸菇菌絲（40× 物鏡）Fig.1 Mononuclear mycelia of Lyophyllum decastes without clamp connection (40× objective lens)

圖2 有鎖狀聯(lián)合的雙核鹿茸菇菌絲（40× 物鏡）Fig.2 Binuclear mycelia of Lyophyllum decastes with clamp connection (40× objective lens)

如圖1 和圖2 鏡檢結(jié)果顯示，試驗中采集到的單孢菌株中有37 個萌發(fā)出的菌絲無鎖狀聯(lián)合，判斷為單核菌絲；有2 個出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，為雙核菌絲。單核菌絲分離成功率約為95%。

2.2 單核菌株培養(yǎng)及親本選擇

2.2.1 單核菌絲生長情況

3 種鹿茸菇菌株的單核菌絲生長情況詳見表1。

表1 3 種鹿茸菇菌株的菌絲生長情況Tab.1 Mycelial growth of three strains of Lyophyllum decastes

如表1 所示，3 種鹿茸菇菌株單核菌絲的平均生長速度由快到慢為L＞K＞C；鹿茸菇K 的菌絲最為致密，鹿茸菇L 和鹿茸菇C 的菌絲密度為稠密；3種菌株的菌絲顏色均為白色；鹿茸菇L 的菌落邊緣整齊，鹿茸菇C 和鹿茸菇K 的菌落邊緣較整齊。

2.2.2 單核菌株拮抗測定結(jié)果

3 種鹿茸菇單核菌株的拮抗情況詳見表2 和圖3。

表2 3 種鹿茸菇菌株間的拮抗試驗結(jié)果Tab.2 Antagonistic relationship among three strains of Lyophyllum decastes

圖3 鹿茸菇K 和L 菌株間拮抗測定結(jié)果Fig.3 Antagonism test results between strains K and L of Lyophyllum decastes

如表2 和圖3 所示，3 種鹿茸菇菌株中，鹿茸菇C 和鹿茸菇K 菌株間拮抗最弱，鹿茸菇L 和鹿茸菇C 菌株間拮抗較強，鹿茸菇K 和鹿茸菇L 菌株之間拮抗最強。

2.2.3 親本菌株的選擇

根據(jù)3 種供試菌株的單核菌絲生長情況和拮抗試驗結(jié)果，選擇拮抗作用明顯、菌絲生長狀況較好、菌絲密度更為致密的鹿茸菇K 和鹿茸菇L 為親本進行后續(xù)試驗。

2.3 雜交菌株的鑒定和評價

2.3.1 雜交菌株生長狀況和鏡檢結(jié)果

挑選長勢旺盛的親本單核菌絲進行兩兩配對，其中鹿茸菇K、L 單核菌株各8 個，總共獲得了64個雜交組合，根據(jù)是否具有鎖狀聯(lián)合和鏡檢菌絲生長狀況，篩選得到優(yōu)良雜交菌株41 個。以雜交菌株KL7 為例，與親本的拮抗測定結(jié)果見圖4。

圖4 鹿茸菇雜交子KL7 的拮抗檢測Fig.4 Antagonism detection of hybrid KL7 of Lyophyllum decastes

如圖4 所示，篩選到的41 個雜交菌株中，有29個雜交菌株與2 個親本之間具有明顯的拮抗線，說明這29 個菌株為雜交獲得的新菌株。在實驗室內(nèi)經(jīng)過進一步的子實體誘導(dǎo)試驗，根據(jù)是否能誘導(dǎo)生成子實體，篩選得到具有結(jié)實能力的雜交菌株15 個。

2.3.2 優(yōu)良菌株篩選結(jié)果

對15 個具有結(jié)實能力的鹿茸菇雜交菌株進行菌絲培養(yǎng)，其菌絲生長情況詳見表3。

表3 雜交鹿茸菇菌株菌絲生長狀況Tab.3 Mycelial growth status of hybrid strain of Lyophyllum decastes

如表3 所示，綜合菌絲密度、顏色及菌落邊緣生長情況，篩選出生長良好的雜交菌株7 個，分別為：KL4、KL10、KL16、KL17、KL21、KL23、KL25。

對7 個雜交菌株進行出菇試驗，最終獲得3 株出菇情況較好的菌株，其子實體形態(tài)特征詳見圖5。

圖5 優(yōu)勢雜交菌株子實體形態(tài)Fig.5 Fruit body morphology of dominant hybrid strains

如圖5 所示，試驗共篩選出子實體性狀優(yōu)良的雜交菌株3 株，分別為KL4、KL10、KL17。鹿茸菇雜交菌株KL4 菌蓋呈暗褐色，菌柄呈淺褐色，有光澤；KL10 子實體菌蓋形態(tài)完整，呈饅頭形，無萎縮開裂；KL17 子實體表面光滑，菌柄淺褐色，完整無開裂，菌蓋完整，富有鹿茸菇本身的清香，且生產(chǎn)周期最短。

3 討論與結(jié)論

食用菌日益受到消費者的喜愛，因此食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，已經(jīng)超過棉、茶、油等，逐漸成為中國種植業(yè)第五大產(chǎn)業(yè)[9]。食用菌育種是獲得產(chǎn)量高、抗逆性強、品質(zhì)高的新品種的常用手段。目前食用菌領(lǐng)域常用的育種方法主要有雜交育種法、單孢分離法、組織分離法、原生質(zhì)體融合法、分子育種法、誘變育種法等[10-11]。

自然界中普遍存在的雜種優(yōu)勢現(xiàn)象，是指第一代雜合子比其親本生長狀況更好、品質(zhì)更加優(yōu)良。2 個親本的親緣關(guān)系越遠，性狀差異越大，所獲得的雜交后代越可能具有優(yōu)勢。對于同種擔(dān)子菌來說，在遺傳特性不同的營養(yǎng)體間，會因為異體識別出現(xiàn)菌絲不親合現(xiàn)象，稱為拮抗反應(yīng)，這種現(xiàn)象由多基因所控制[12-13]。將親緣關(guān)系較遠，基因組內(nèi)異核體不親合的2 株真菌菌株共同培養(yǎng)時，菌株間會產(chǎn)生拮抗反應(yīng)。這一現(xiàn)象可以防止在遺傳上具有明顯差異的個體間出現(xiàn)菌絲融合，對于真菌保持個體遺傳穩(wěn)定具有重要意義。根據(jù)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)》（NY/T 1845-2010）[14]，2 個菌株之間親緣關(guān)系的遠近，可以通過觀察2 個菌株菌落交界處菌絲間的拮抗反應(yīng)特征來進行簡單的判斷。如菌落交界處呈現(xiàn)隆起型、溝型或隔離型則確定為有拮抗反應(yīng)，可以判斷2 個菌種為不同品種。

將3 種鹿茸菇單核菌株進行兩兩配對測定拮抗反應(yīng)情況，從中選擇了拮抗線明顯、生理性狀優(yōu)良的“鹿茸菇K” 和 “鹿茸菇L” 作為雜交親本。從中挑選出長勢旺盛的單核菌絲進行兩兩配對，共獲得了64 個雜交組合，根據(jù)是否具有鎖狀聯(lián)合以及菌絲生長狀況，篩選得到優(yōu)良雜交菌株41 個，其中29 個雜交菌株與2 個親本之間形成明顯的拮抗線，通過實驗室內(nèi)誘導(dǎo)子實體形成的試驗，根據(jù)子實體形成情況，得到具有結(jié)實能力的雜交菌株15 個。通過對這些菌株的再次篩選，獲得菌絲生長情況良好的菌株7 個，通過出菇試驗，最終篩選出子實體性狀優(yōu)良的菌株3個，分別為KL4、KL10、KL17；其中KL17 菌株子實體性狀更為優(yōu)良，生產(chǎn)周期最短。

通過雜交育種技術(shù)獲得的雜交后代可能會出現(xiàn)各項性狀明顯優(yōu)于親本的雜種優(yōu)勢，但也可能出現(xiàn)生存能力下降的雜種劣勢[15]。因此在雜交育種中需要進行大量的重復(fù)試驗，才能篩選獲得滿足要求的優(yōu)良鹿茸菇新品種。后期課題組將對雜交獲得的新菌株在多地進行試驗，反復(fù)驗證性狀是否能穩(wěn)定遺傳。再通過栽培技術(shù)的優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的鹿茸菇人工栽培菌種。