何苗, 姚文秀, 谷涉群

1.綿陽市第三人民醫(yī)院 四川省精神衛(wèi)生中心健康管理中心,四川綿陽 621000;2.四川省腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤內(nèi)科,四川成都 610041;3.郴州市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,湖南郴州 423099

中藥溪黃草在肝癌、結(jié)腸癌的發(fā)生或進(jìn)展方面具有抑制作用[1-2]。研究表明,環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)和微RNA(microRNA,miRNA)表達(dá)失調(diào)與癌癥啟動(dòng)、進(jìn)展關(guān)系密切,靶向circRNA和miRNA治療可能是阻止癌癥發(fā)生發(fā)展的有效措施[3]。circ_0091579在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者中顯著上調(diào),下調(diào)circ_0091579表達(dá)可顯著抑制HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[4]。miR-515-5p介導(dǎo)沉默LINC00519對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和腫瘤生長的抑制作用[5]。本研究探討溪黃草對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

肺癌A549細(xì)胞購自美國ATCC公司;溪黃草生藥飲片由本院中藥房提供;Lipofectamine? 2000購自美國Invitrogen公司;重組熒光素酶載體、si-circ_0091579(5′-AGUCAUGUCGAUGUCGUACUU-3′)、si-NC、pcDNA-circ_0091579、pcDNA購自上海生工技術(shù)公司;CCK-8、GAPDH兔多抗(ab9485)、山羊抗兔IgG二抗(ab205718)、裂解的Caspase-3(cleaved-Caspase-3)兔多抗(ab2302)購自上海艾博抗貿(mào)易公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V/FITC)凋亡檢測試劑盒、TRIzol試劑購自北京索萊寶生物公司。Multiskan SkyHigh全波長酶標(biāo)儀購自美國ThermoFisher公司;CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自BeckmanCoulter公司;熒光定量PCR儀購自美國ABI stepone公司;電轉(zhuǎn)儀、瓊脂糖凝膠電泳裝置購自北京六一儀器廠。

1.2 溪黃草乙醇提取物的制備

參照文獻(xiàn)[2]制備溪黃草乙醇提取物,將溪黃草飲片粉碎,75%乙醇提取1 h,共3次,過濾,合并濾液,回收乙醇,濃縮至稠膏,冷凍干燥,得到干粉。磷酸鹽緩沖液(PBS)將干粉配制成10 g/L的貯存液,過微孔濾膜(0.22 μm)除菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 A549細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將A549細(xì)胞于含5%二氧化碳DMEM培養(yǎng)液、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染si-circ_0091579(si-circ_0091579組)、si-NC(si-NC組)、pcDNA(pcDNA組)、pcDNA-circ_0091579(pcDNA-circ_0091579組)到A549細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)染48 h A549細(xì)胞,qRT-PCR檢測circ_0091579表達(dá)水平。分別用含0、20、40、80 mg/L溪黃草的培養(yǎng)液孵育A549細(xì)胞,記為對照組、溪黃草20 mg/L組、溪黃草40 mg/L組、溪黃草80 mg/L組。用含80 mg/L溪黃草的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_0091579的A549細(xì)胞,記為溪黃草+pcDNA-circ_0091579組,并使用含80 mg/L溪黃草的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞作為對照,記為溪黃草組。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將對照組、si-circ_0091579組、si-NC組、pcDNA-circ_0091579組的細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板,按照各組給與對應(yīng)質(zhì)量濃度溪黃草的培養(yǎng)液,孵育48 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液在37 ℃下孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度(optical density,OD)值。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成數(shù)

將各組A549細(xì)胞以5×102個(gè)/孔接種到6孔板,每周換液2～3次,持續(xù)培養(yǎng)2周。細(xì)胞克隆用甲醇固定15 min,0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min,PBS洗去多余染色液,自然晾干,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

各組A549細(xì)胞PBS洗滌2次,向約1×105個(gè)細(xì)胞中加入500 μL結(jié)合緩沖液,隨后加入Annexin V/FITC和碘化丙啶避光染色15 min。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.7 Western blotting檢測cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)

RIPA裂解法從各組細(xì)胞樣品中提取總蛋白。定量后,將蛋白與上樣緩沖液混勻,100 ℃煮沸5 min。取30 μg蛋白樣品行SDS-PAGE,隨后濕法轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶室溫下封閉膜1 h,加入cleaved-Caspase-3兔多抗(1∶1 000)4 ℃下孵育過夜。GAPDH兔多抗(1∶1 000)作為內(nèi)參。加入山羊抗兔IgG二抗孵育膜1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,凝膠成像儀下拍照。采用Quantity One v4.6.2軟件對cleaved-Caspase-3條帶灰度值定量分析。

1.8 qRT-PCR檢測circ_0091579、miR-515-5p表達(dá)

TRIzol試劑提取各組A549細(xì)胞總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,將生成的cDNA與SYBR green master mix、特異性引物混合,然后進(jìn)行qRT-PCR。circ_0091579上游5′-TGAGCCAGTGGTCA GTCAAA-3′,下游5′-GTGGAGTCAGGCTTGGGTAG-3′;GAPDH上游5′-TGAATGGGCAGCCGTTAGG-3′,下游5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′;miR-515-5p上游5′-CGGGTTCTCCAAAAGAAAGCA-3′,下游5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′。RNA、蛋白檢測分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算其相對表達(dá)量。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

circular RNA interactome預(yù)測circ_0091579、miR-515-5p之間的靶向關(guān)系。將含有miR-515-5p結(jié)合位點(diǎn)的circ_0091579片段克隆到pmirGLO載體,構(gòu)建野生型(wild type,WT)重組載體WT-circ_0091579、突變型(mutant,MUT)重組載體MUT-circ_0091579。Lipofectamine 2000將WT-circ_0091579載體、MUT-circ_0091579載體分別與miR-515-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)染48 h熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 溪黃草對A549細(xì)胞circ_0091579、miR-515-5p表達(dá)及細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對照組比較,各溪黃草(20、40、80 mg/L)組A549細(xì)胞circ_0091579水平、細(xì)胞克隆形成數(shù)降低(P<0.05),miR-515-5p、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著升高,且呈質(zhì)量濃度依賴性(P<0.05;圖1、表1)。

圖1 溪黃草對A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響A為溪黃草誘導(dǎo)A549凋亡;B為cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá);C為顯微鏡下克隆細(xì)胞(結(jié)晶紫染色)。

表1 溪黃草對A549細(xì)胞circ_0091579、miR-515-5p表達(dá)及細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.2 下調(diào)circ_0091579對A549增殖和凋亡的影響

下調(diào)circ_0091579表達(dá)可降低A549細(xì)胞的克隆形成數(shù),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05;圖2、表2)。

圖2 下調(diào)circ_0091579對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響A為A549細(xì)胞凋亡;B為cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá);C為顯微鏡下克隆細(xì)胞(結(jié)晶紫染色)。

表2 下調(diào)circ_0091579對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 上調(diào)circ_0091579逆轉(zhuǎn)溪黃草對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對照組比較,溪黃草組A549細(xì)胞抑制率、凋亡率、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)、miR-515-5p相對水平顯著升高(P<0.05),克隆形成數(shù)、circ_0091579相對水平顯著減少(P<0.05);與溪黃草組比較,溪黃草+pcDNA-circ_0091579組A549細(xì)胞上述指標(biāo)逆轉(zhuǎn)(P<0.05;圖3、表3)。

圖3 上調(diào)circ_0091579可逆轉(zhuǎn)溪黃草對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響A為A549細(xì)胞凋亡;B為cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá);C為顯微鏡下克隆細(xì)胞(結(jié)晶紫染色)。

表3 上調(diào)circ_0091579可逆轉(zhuǎn)溪黃草對A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用

2.4 circ_0091579靶向調(diào)控miR-515-5p表達(dá)

circ_0091579和miR-515-5p存在互補(bǔ)位點(diǎn)(圖4A)。與miR-NC組比較,miR-515-5p組WT-circ_0091579相對熒光素酶活性顯著下降(P<0.05;圖4B)。si-circ_0091579組A549細(xì)胞miR-515-5p相對水平高于si-NC組(P<0.05);pcDNA-circ_0091579組A549細(xì)胞miR-515-5p相對水平低于pcDNA組(P<0.05;圖4C)。

圖4 circ_0091579靶向調(diào)控miR-515-5p表達(dá)A為circ_0091579和miR-515-5p的互補(bǔ)序列;B為雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn);C為circ_0091579調(diào)控miR-515-5p的表達(dá)。a為P<0.05,與miR-NC組比較;b為P<0.05,與si-NC組比較;c為P<0.05,與pcDNA組比較。

3 討 論

近年來肺癌的發(fā)病率和病死率明顯上升,其常用治療手段存在較大的不良反應(yīng),嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[6]。中藥具有成本低、毒副作用小、耐藥概率低,其優(yōu)勢極大彌補(bǔ)現(xiàn)有腫瘤治療藥物的不足,是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,溪黃草顯著降低A549細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,誘導(dǎo)cleaved-Caspase-3表達(dá)上調(diào),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,且具有一定的質(zhì)量濃度依賴性,這與前人[7]報(bào)道溪黃草的體外抗腫瘤活性一致,但其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn),circRNA、miRNA與天然植物提取物的抗癌作用密切相關(guān),circRNA、miRNA可能作為致癌因子或抑癌因子參與其中[8]。本研究中,經(jīng)溪黃草處理后,A549細(xì)胞中circ_0091579表達(dá)降低,miR-515-5p表達(dá)增加。circ_0091579靶向miR-515-5p。研究發(fā)現(xiàn),HCC中circ_0091579高表達(dá)具有致癌作用,下調(diào)circ_0091579可抑制體內(nèi)移植瘤生長,抑制HCC細(xì)胞的增殖、瓦博格效應(yīng)、遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。本研究結(jié)果顯示,下調(diào)circ_0091579表達(dá)可降低A549細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)cleaved-Caspase-3表達(dá)上調(diào),證實(shí)circ_0091579在肺癌中的致癌作用。miR-515-5p曾被報(bào)道可抑制多種腫瘤進(jìn)展,多種非編碼RNA的下游靶點(diǎn)在肺癌中發(fā)揮抑癌功能[10-13]。本研究結(jié)果提示溪黃草可能通過調(diào)控circ_0091579/miR-515-5p通路發(fā)揮抗癌功能。上調(diào)circ_0091579逆轉(zhuǎn)了溪黃草對A549細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)功能,進(jìn)一步證實(shí)溪黃草通過調(diào)控circ_0091579/miR-515-5p通路在肺癌中發(fā)揮抗腫瘤活性。

綜上所述,溪黃草可抑制肺癌細(xì)胞A549增殖,誘導(dǎo)凋亡,其機(jī)制與下調(diào)circ_0091579/miR-515-5p途徑有關(guān),為肺癌防治提供了新的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。