丁秀, 王小琴

湖北省中醫(yī)院 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科,湖北省中醫(yī)藥研究院腎病研究所,湖北武漢 430061

膜性腎病是指以腎小球基底膜上皮細胞下免疫復(fù)合物沉積為特征的一組疾病,伴有腎小球基底膜增厚,排除了繼發(fā)性因素的膜性腎病稱為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)[1]。近年來IMN發(fā)病逐年增加,常以水腫、蛋白尿、低蛋白血癥、高血壓等為主要臨床表現(xiàn),且病程長、預(yù)后差、易反復(fù)發(fā)作[2-3]。膜腎協(xié)定方是臨床治療IMN的有效方劑[4-5],然而膜腎協(xié)定方治療IMN的具體機制尚未清晰。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討膜腎協(xié)定方治療特發(fā)性膜性腎病的分子機制,以期為膜腎協(xié)定方的臨床進一步推廣提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 膜腎協(xié)定方主要活性成分的作用靶點

本研究通過設(shè)置口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)[6]在BATMAN-TCM(中藥分子機理的生物信息學(xué)分析工具)、TCMSP(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺)、TCMID(中藥綜合數(shù)據(jù)庫)、Swiss Target Prediction、CNKI等數(shù)據(jù)庫收集桂枝、茯苓、防己、黃芪、蒼術(shù)、白術(shù)、柴胡、黃芩、黨參、升麻、三棱、莪術(shù)相關(guān)成分及靶點,建立膜腎協(xié)定方成分及靶點數(shù)據(jù)庫,用于后續(xù)分析。

1.2 IMN相關(guān)靶點的預(yù)測與篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索IMN相關(guān)靶點,通過比較毒物基因組學(xué)(comparative toxicogenomics database,CTD)數(shù)據(jù)庫獲取與IMN相關(guān)的靶點。將兩個數(shù)據(jù)庫獲取的IMN相關(guān)基因合并刪除重復(fù)項,得到IMN相關(guān)靶點。再將IMN的靶點與膜腎協(xié)定方活性成分靶點映射后取交集,獲得膜腎協(xié)定方治療IMN的潛在作用靶點。

1.3 靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用STRING[7](Version 10.0)在線數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測靶點的相互作用。物種設(shè)為“Homo sapiens”,對數(shù)據(jù)進行預(yù)讀后將置信度設(shè)置為≥0.90,并隱藏孤立蛋白,導(dǎo)出TSV文件。進行拓撲排序算法分析,篩選出蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)中的關(guān)鍵靶點。

1.4 KEGG和GO富集分析

使用R studio的cluster Profiler包[8]對所篩選靶點進行GO和KEGG通路分析,選擇P<0.05的通路。將上述靶點-通路-中藥數(shù)據(jù)制成Excel表格并導(dǎo)入Cytoscape軟件中,對節(jié)點參數(shù)及網(wǎng)絡(luò)形狀進行設(shè)置后繪制膜腎協(xié)定方成分調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 膜腎協(xié)定方活性成分及靶點的收集與篩選

收集到膜腎協(xié)定方中的主要活性成分共34個(表1)。從TCMSP獲得466個膜腎協(xié)定方靶點,從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得1 262個膜腎協(xié)定方靶點,從Swiss Target數(shù)據(jù)庫獲得833個膜腎協(xié)定方靶點。去重后得到了1 909個靶點。從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得8 259個與IMN相關(guān)的靶點,從CTD數(shù)據(jù)庫獲得了23 610個與IMN相關(guān)的靶點,去重后得到了24 171個靶點。將疾病數(shù)據(jù)庫與成分數(shù)據(jù)庫收集到的靶點映射后共得到1 863個膜腎協(xié)定方治療IMN的靶點。

表1 膜腎協(xié)定方中的主要活性成分信息表

2.2 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述1 863個靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫后篩選出148個靶點。以148個靶點作為膜腎協(xié)定方在治療IMN過程中的關(guān)鍵靶點,并建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1),共包括148個節(jié)點,3 786條邊。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖初步推測,膜腎協(xié)定方可能通過HRH1、HTR1A、NR3C1、OPRK1、IL-6、JAK3、F2R、MAPK14、MAPK11、MAPK8、TNF、TGF-β1、AKT1、PIK3CA等148個關(guān)鍵靶點防治IMN。

圖1 靶點蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 靶點的功能富集分析

KEGG通路分析共得到177條通路,選擇P<0.05的20條(圖2A),148個靶點主要通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用、信號通路、磷脂酶D信號通路、乙型肝炎、AGE-RAGE信號通路、cAMP信號通路、FoxO信號通路等治療IMN。將148個靶點進行GO富集,根據(jù)P<0.05篩選,148個靶點在生物過程中顯著富集(圖2B、C、D),共參與生物過程2 430個。根據(jù)GO生物學(xué)過程富集結(jié)果,膜腎協(xié)定方可能通過調(diào)節(jié)細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、細胞中的二價無機陽離子穩(wěn)態(tài)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、血管直徑的調(diào)節(jié)、血管收縮調(diào)節(jié)等生物過程防治IMN。

圖2 KEGG信號通路圖和GO富集圖A為KEGG信號通路圖;B為GO富集生物過程柱狀圖;C為GO富集生物過程重點通路圖;D為GO富集生物過程靶點-通路圖。

2.4 分子機制網(wǎng)絡(luò)分析

構(gòu)建中藥-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)發(fā)現(xiàn),膜腎協(xié)定方在防治IMN的過程中通過多靶點、多通路發(fā)揮作用。膜腎協(xié)定方主要通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、磷脂酶D信號通路、乙型肝炎、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、cAMP信號通路、FoxO信號通路發(fā)揮治療IMN的作用。

圖3 膜腎協(xié)定方分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖深綠色正方形代表膜腎協(xié)定方中的藥物,淺綠色代表靶點,藍色三角形代表的關(guān)鍵通路。

3 討 論

IMN歸屬于“水腫”“尿濁”“慢腎風(fēng)”等疾病范疇,發(fā)病多以脾腎虧虛為本,濕熱瘀血為標[4-5]。膜腎協(xié)定方由桂枝、茯苓、防己、黃芪、蒼術(shù)、白術(shù)、柴胡、黃芩、黨參、升麻、三棱、莪術(shù)組成。全方通用,共奏健脾滲濕、活血化瘀之用。本研究通過多數(shù)據(jù)庫整合篩選了膜腎協(xié)定方中治療IMN的34個活性成分。其中,黃芩素可以改善IMN患者高血脂和高血糖狀態(tài)。有研究表明,黃芩素可以降低IMN患者血液膽固醇及低密度脂蛋白的含量,增強糖耐量,減少胰島素抵抗,達到降脂降糖的效果[9]。山奈酚可以降低血管炎癥反應(yīng),預(yù)防血管粥樣硬化的發(fā)生[10-11]。谷甾醇可通過降低組胺所誘導(dǎo)的小鼠毛細血管通透性,抑制核因子-κB通路,提高白細胞介素-10活性,降低PEG2、緩激肽、組胺等炎癥介質(zhì)活性,從而起到緩解IMN患者炎癥反應(yīng)的作用[12-13]。異鼠李素也具有保護腎功能的作用[14]。膜腎協(xié)定方中的34個活性成分主要發(fā)揮了降糖、抗炎、降低毛細血管通透性等藥理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn),益氣健脾燥濕類中藥具有降糖、抗炎的藥理學(xué)作用[15-17]。而活血類、破血類中藥具有調(diào)節(jié)血管通透性的藥理學(xué)作用[18]。膜腎協(xié)定方主治與活性成分的藥理學(xué)作用不謀而和。

本研究發(fā)現(xiàn),MAPK、TNF、IL-6、TGF-β1、AKT1、PIK3CA、JUN等148個靶點是模型中的核心靶點。Baranova等[19]研究發(fā)現(xiàn),NOS通過激活p38MAPK抑制脂多糖信號通路,防治循環(huán)系統(tǒng)中脂多糖增加的慢性腎炎。Lee等[20]臨床實驗表明,AKT與IκB通過PI3K/AKT通路解離后變?yōu)榛钚誀顟B(tài),轉(zhuǎn)位進入細胞核,進而結(jié)合核內(nèi)的κB位點,再進一步調(diào)控下游的靶基因表達,從而參與腎臟炎癥、腎臟纖維化以及細胞凋亡等病理過程[21]。Yao等[22]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1被激活后,會通過Smad信號通路發(fā)揮其生物學(xué)和病理學(xué)活性,Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的膠原合成,并在IMN的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[23]。張倩等[24]研究發(fā)現(xiàn),高糖上調(diào)系膜細胞TGF-β1基因表達激活,使調(diào)控區(qū)去甲基化,參與腎病的發(fā)展。全墨緣等[25]發(fā)現(xiàn),上調(diào)p38MAPK能夠改善適應(yīng)性和固有免疫細胞等多種細胞參與免疫炎性損傷,調(diào)節(jié)IMN的發(fā)展過程。Liu等[26]細胞實驗證明,下調(diào)VEGFA表達能夠抑制TGF-β1/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)腎小管上皮細胞纖維化。因此,膜腎協(xié)定方的148個核心靶點可能通過調(diào)節(jié)纖維化過程、免疫過程、細胞凋亡等過程發(fā)揮防治IMN的作用。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),神經(jīng)活性配體-受體相互作用、信號通路、磷脂酶D信號通路、乙型肝炎、AGE-RAGE信號通路、cAMP信號通路、FoxO信號通路是膜腎協(xié)定方發(fā)揮治療IMN作用的主要通路。其中,通過Hepatitis B通路增加發(fā)生胰島素抵抗的風(fēng)險,導(dǎo)致胰島β細胞凋亡,增加了腎纖維化風(fēng)險[27];通過AGE-RAGE信號通路使肝糖原儲存增加,出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常,增加血漿中IL-6產(chǎn)生,增加IMN復(fù)發(fā)的風(fēng)險[28];通過FoxO信號通路導(dǎo)致氧化應(yīng)激,使NF-κB信號通路受損導(dǎo)致IMN的發(fā)生;通過cAMP信號通路使cAMP表達水平異常促進成纖維細胞的增殖,增加AngII/TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變及膠原的合成,增加細胞外基質(zhì)沉積,增加腎纖維化的風(fēng)險[29]。因此,膜腎協(xié)定方的核心通路可能通過調(diào)節(jié)肝糖原儲存、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、細胞外基質(zhì)的沉積等過程發(fā)揮防治IMN的作用。

綜上所述,膜腎協(xié)定方發(fā)揮治療作用主要體現(xiàn)在以下兩方面:①膜腎協(xié)定方通過Hepatitis B、AGE-RAGE等通路上調(diào)JAK3、MAPK8、MAPK14、MAPK11等靶點的表達,抑制胰島β細胞凋亡,降低了腎纖維化風(fēng)險;②膜腎協(xié)定方通過FoxO信號通路、NF-κB、cAMP信號通路等上調(diào)TGF-β1、PIK3CA、PIK3CB、EGFR的表達,調(diào)節(jié)促纖維化因子、活性氧累積和全身炎癥,降低腎損傷和IMN發(fā)生的可能性。本研究進一步闡明了膜腎協(xié)定方的物質(zhì)基礎(chǔ)及關(guān)鍵靶點群,并系統(tǒng)地揭示了膜腎協(xié)定方治療IMN的網(wǎng)絡(luò)作用機理,為IMN的診療手段提供新策略。