張夢(mèng)偉, 趙忠?guī)? 楊林, 王明, 楊雪飛, 王倩

1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院德州醫(yī)院心臟康復(fù)醫(yī)學(xué)科,山東德州 253000;2.德州市立醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,山東德州 253000

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)由心肌組織持續(xù)嚴(yán)重缺血引起的急性壞死,是全球主要的致命性疾病之一[1-2]。盡管過去十年來(lái)治療策略有所改進(jìn),但AMI仍具有高致死率及多種并發(fā)癥[3]。因此,尋找診斷、治療急性心肌梗死的新方法迫在眉睫。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不具備編碼蛋白功能的RNA,其長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,心肌缺血再灌注損傷中,lncRNA起著重要作用[5-6]。其中SNHG6作為一種新型lncRNA[7-8],在急性心肌梗死中的作用尚未被闡明,本研究旨在通過構(gòu)建AMI小鼠模型,深入探究lncRNA SNHG6在急性心肌梗死中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

雄性C57/BL6小鼠購(gòu)自賽業(yè)生物公司;CD31抗體、Col1α1抗體、Nppa抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗、TGFBR1抗體、GAPDH抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;所有引物合成購(gòu)于擎科生物公司;ECL化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于Bio-Rad公司;H9C2細(xì)胞購(gòu)于普拉特澤生物公司;DAB顯色液購(gòu)于邁新生物公司;蘇木精染色液、麗春紅酸性復(fù)紅液、天狼星紅染色液、RIPA裂解液和PBS緩沖液均購(gòu)于賽維爾生物公司。

1.2 AMI小鼠模型的構(gòu)建及分組

雄性C57/BL6小鼠36只,4～8周,體質(zhì)量(18.42±2.53)g,隨機(jī)選取30只造模成功的AMI小鼠,均分為AMI組、AMI+SNHG6組、AMI+miR-101-3p組、AMI+SNHG6+miR-101-3p組、AMI+miR-101-3p+TGFBR1組,另選6只小鼠為假手術(shù)組。30只造模小鼠用2%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉,胸骨左緣第2～4肋開胸,識(shí)別前降支走行范圍,7/0滑線結(jié)扎左前降支,結(jié)扎區(qū)域顏色變?yōu)樯n白,并且心電圖提示心肌梗死表現(xiàn)時(shí)則認(rèn)定AMI小鼠造模成功。假手術(shù)組開胸但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈,其他步驟同造模小鼠。AMI造模結(jié)束后,AMI+SNHG6組、AMI+miR-101-3p組、AMI+SNHG6+miR-101-3p組、AMI+miR-101-3p+TGFBR1組小鼠尾靜脈分別注射SNHG6、miR-101-3p、SNHG6+miR-101-3p、miR-101-3p+TGFBR1質(zhì)粒,每周2次,連續(xù)4周,假手術(shù)組、AMI組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3 AMI小鼠模型心臟功能檢測(cè)

末次處理24 h后,取各組6只小鼠麻醉,采用心臟彩超檢查各組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

1.4 RNA提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

TRIzol提取小鼠組織總RNA,紫外分光光度法測(cè)定RNA含量,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,并以cDNA為模板按照說明書進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。SNHG6引物序列F為5′-TTGAGGTGAAGGTGTATG-3′,R為5′-GGTAACGAAGCAGAAGTA-3′;TGFBR1引物序列F為5′-ACGGCGTTACAGTGTTTCTG-3′,R為5′-GCACATACAAACGGCCTATCTC-3′;GAPDH引物序列F為5′-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3′,R為5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′;miR-101-3p引物序列F為5′-ACGGGCGAGCTACAGTACTGTG-3′,R為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′;U6引物序列F為5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,R為5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR反應(yīng)條件95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán)。分別以GAPDH、U6為SNHG6、miR-101-3p的內(nèi)參計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 馬松染色

心功能檢測(cè)后將小鼠麻醉處死,迅速取出心臟,切取小鼠心肌組織,石蠟切片脫蠟至水,用蘇木精染液染核10 min,充分水洗后用鹽酸酒精分化,再蒸餾水洗。用麗春紅酸性復(fù)紅液10 min。1%磷鉬酸水溶液分化5 min,甩掉磷鉬酸后直接用苯胺藍(lán)染5 min,再依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.6 天狼星紅染色

小鼠心肌組織石蠟切片脫蠟水化,天狼星紅染色液染色10 min,稍微沖洗后用蘇木精染色液染色8 min,流水沖洗10 min。常規(guī)梯度乙醇進(jìn)行脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.7 免疫組化染色

石蠟切片脫蠟入水,微波加熱法修復(fù)抗原,94 ℃,10～15 min,加入5%正常羊血清封閉,室溫孵育15 min;隨后添加一抗CD31抗體(1∶100)、Col1α1抗體(1∶100)、Nppa抗體(1∶100),4 ℃孵化過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗(1∶200),37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37 ℃孵育30 min。DAB顯色后,蘇木精復(fù)染2 min,脫水,封片,正置顯微鏡觀察切片。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

37 ℃、5%CO2條件下用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染前24 h將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔板,隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(NC組)、SNHG6組、miR-101-3p組,通過LipofectamineTM2000介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SNHG6、miR-101-3p至SNHG6組、miR-101-3p組,陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒。

1.9 Western blotting

采用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,遵照BCA法測(cè)定蛋白水平,加入緩沖液后變性蛋白。每泳道加入50 μg蛋白,用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h,分別加入TGFBR1(1∶500)及兔抗GAPDH抗體(1∶1 000)的抗體稀釋液中4 ℃過夜,TBST洗3次,每次10 min,再放入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔的二抗中室溫孵育1 h,TBST洗3次,ECL液暗室發(fā)光顯影,采集圖像并分析。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)建SNHG6/TGFBR1的野生型(wild type,wt)和突變型(mutant,mut)質(zhì)粒。分別提取SNHG6/TGFBR1-wt和SNHG6/TGFBR1-mut質(zhì)粒,與miR-101-3p mimic共同轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS清洗,加入20 μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,然后上機(jī)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用one-way ANOVA。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清SNHG6和miR-101-3p表達(dá)水平的比較

AMI小鼠較假手術(shù)小鼠血清SNHG6表達(dá)水平顯著升高[(1.67±0.12)比(1.00±0.09),P<0.05],而miR-101-3p表達(dá)水平降低[(0.47±0.04)比(1.00±0.11),P<0.05]。

2.2 各組小鼠LVEF比較

與AMI組小鼠比較,AMI+SNHG6組小鼠LVEF降低(P<0.05),AMI+miR-101-3p組小鼠LVEF升高(P<0.05);與AMI+SNHG6組比較,AMI+SNHG6+miR-101-3p組LVEF升高(P<0.05);與AMI+miR-101-3p組比較,AMI+miR-101-3p+TGFBR1組LVEF降低(P<0.05;圖1)。

圖1 各組小鼠LVEF比較a為P<0.05,與假手術(shù)組比較;b為P<0.05,與AMI組比較;c為P<0.05,與AMI+SNHG6組比較;d為P<0.05,與AMI+miR-101-3p組比較。

2.3 各組小鼠心肌纖維化程度比較

與假手術(shù)組比較,AMI組小鼠心肌纖維化加重,CD31抗體、Col1α1抗體及Nppa抗體陽(yáng)性信號(hào)增加;與AMI組比較,AMI+SNHG6組纖維化程度加重及以上抗體陽(yáng)性信號(hào)增加,AMI+miR-101-3p組纖維化程度減輕及以上抗體陽(yáng)性信號(hào)減少;與AMI+SNHG6組比較,AMI+SNHG6+miR-101-3p組心肌纖維化程度減輕及以上抗體陽(yáng)性信號(hào)減少;與AMI+miR-101-3p組比較,AMI+miR-101-3p+TGFBR1組小鼠心肌纖維化程度加重及以上抗體陽(yáng)性信號(hào)增加(圖2)。

2.4 SNHG6抑制miR-101-3p上調(diào)TGFBR1表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示,與NC組比較,SNHG6組TGFBR1蛋白表達(dá)明顯升高,miR-101-3p組TGFBR1蛋白表達(dá)降低(P<0.05;圖3)。

圖3 SNHG6抑制miR-101-3p上調(diào)TGFBR1表達(dá)a為P<0.05,與NC組比較。

2.5 預(yù)測(cè)并驗(yàn)證SNHG6/miR-101-3p/TGFBR1調(diào)控關(guān)系

TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,SNHG6的3′-UTR存在miR-101-3p的結(jié)合位點(diǎn),而miR-101-3p與TGFBR1也具有潛在的靶向結(jié)合關(guān)系(圖4A)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,miR-101-3p組SNHG6-wt、TGFBR1-wt質(zhì)粒熒光素酶活性較NC組明顯降低(P<0.05),但對(duì)SNHG6-mut、TGFBR1-mut熒光素酶活性均無(wú)明顯影響(P>0.05;圖4B)。

圖4 SNHG6靶向調(diào)控miR-101-3p/TGFBR1軸A為生物信息軟件預(yù)測(cè)SNHG6/miR-101-3p/TGFBR1結(jié)合點(diǎn)位;B為雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。a為P<0.05,與NC組比較。

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,急性心肌梗死診斷和治療均有了明顯提升[9],但其仍是中國(guó)病例死亡、殘疾的主要原因之一[10]。研究發(fā)現(xiàn),急性心肌梗死發(fā)病機(jī)制主要為心室重構(gòu),因此如何減緩急性心肌梗死后心室重構(gòu)成為了近十年研究的熱點(diǎn)[11]。

近年來(lái),lncRNA在心血管領(lǐng)域中的作用引起了廣泛的關(guān)注,SNHG6在慢性心血管疾病中發(fā)揮重要作用,SNHG6在動(dòng)脈粥樣硬化中通過miR-135 a-5p/Rock調(diào)節(jié)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷[12];但SNHG6在AMI中的確切機(jī)制尚不清楚。本研究首先構(gòu)建了AMI小鼠模型,發(fā)現(xiàn)AMI小鼠較假手術(shù)小鼠血清中SNHG6表達(dá)顯著增加,提示SNHG6可能參與AMI的發(fā)生發(fā)展。

lncRNA影響內(nèi)源性微RNA(microRNA,miRNA)的表觀遺傳修飾,進(jìn)而影響miRNA的靶基因發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)功能[13-15]。因此為了探究lncRNA SNHG6在AMI中的作用機(jī)制,本文預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-101-3p是SNHG6的靶向miRNA,TGFBR1是miR-101-3p的靶基因;提示SNHG6可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),與miR-101-3p結(jié)合,減弱miR-101-3p對(duì)TGFBR1的調(diào)控作用。

本文結(jié)果顯示,與AMI組小鼠比較,AMI+SNHG6組小鼠LVEF下降,而加入miR-101-3p后,回補(bǔ)了SNHG6對(duì)LVEF的表達(dá)水平;同時(shí)AMI+SNHG6組AMI小鼠中Nppa抗體的表達(dá)水平明顯升高,提示SNHG6可促進(jìn)AMI小鼠LVEF進(jìn)一步降低,從而促進(jìn)心肌梗死的發(fā)展,而過表達(dá)miR-101-3p可使AMI小鼠心肌梗死好轉(zhuǎn)、心功能提升。隨后采用馬松和天狼星紅染色及免疫組化實(shí)驗(yàn),也驗(yàn)證了這一結(jié)果。本研究結(jié)果顯示,miR-101-3p顯著抑制AMI組小鼠心肌纖維化,而TGFBR1逆轉(zhuǎn)了miR-101-3p的抑制效果,提示在AMI小鼠模型中,SNHG6可競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-101-3p上調(diào)TGFBR1表達(dá),從而促進(jìn)小鼠心肌纖維化程度加重。

綜上,本研究闡述了SNHG6作為ceRNA,競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-101-3p上調(diào)TGFBR1導(dǎo)致AMI小鼠左心室心肌纖維化增加,心肌梗死程度加重,SNHG6未來(lái)可能會(huì)成為AMI診斷及治療的新靶點(diǎn)。