繆劍虹 孔怡然 劉堯 深圳市藥品檢驗研究院 （廣東 深圳 518057）

內容提要： 目的：對無菌醫(yī)療器械的無菌檢驗結果開展全過程的回顧性調查與分析，以探討無菌檢驗檢驗結果偏差（OOS）發(fā)生的原因，并規(guī)定了OOS結果調查的具體操作規(guī)程。方法：根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020版）和新版藥品生產質量管理規(guī)范標準的OOS指南，從人、機、料、法、環(huán)、測六要素進行深入分析和探討，找出無菌檢驗過程中可能導致微生物污染的原因。結果：通過OOS結果調查分析，排除了實驗室環(huán)境和檢驗人員操作導致樣本污染的情況，初步分析在試驗樣本中檢出的微生物為產品本身的缺陷，可能是產品終端滅菌不徹底，細菌芽孢未被完全殺滅導致的產品缺陷。結論：OOS調查過程可以幫助實驗室識別導致OOS結果的可能原因，然后采取糾正和預防措施。在微生物實驗室建立完善的OOS結果調查計劃以規(guī)范調查操作流程，是提高微生物實驗室質量管理水平的重要手段。

醫(yī)療器械無菌檢查是無菌提供的醫(yī)療器械質量控制的重要部分之一，也是提升無菌醫(yī)療器械質量控制水平、控制醫(yī)療器械臨床不良反應發(fā)生率的主要措施。無菌醫(yī)療器械如果被微生物污染，有可能引起患者的感染，以至危及患者的生命安全[1]。微生物普遍存在于自然環(huán)境中，檢驗人員的活動、檢驗儀器及產品包裝等都可能把這些微生物引入檢驗環(huán)境中，進而導致假陽性結果。檢驗結果偏差（Out of Specification，OOS）結果是指不符合所依據(jù)的質量標準中規(guī)定的可接受的檢驗結果，其對應的實驗室檢驗結果不滿足有關規(guī)定以及不符合相關標準要求。OOS結果調查是實驗室質量體系關鍵要素之一，《中華人民共和國藥典》（2020版）和現(xiàn)行動態(tài)藥品生產管理規(guī)范法規(guī)對微生物檢測OOS結果的調查作出了更詳細的闡述和應用研究[2]。還規(guī)定實驗室對OOS結果應當依據(jù)書面程序開展全面調查，力求找出導致OOS結果的主要原因并判斷其是否有效，以保證檢測結果的準確性。為保證其意義，OOS結果調查應該是完全的、及時的、不帶有任何偏見的、記錄是完整且經(jīng)得起科學推敲的[3]。

基于微生物檢測結果固有的變異性，無菌檢驗OOS結果調查相較于其他理化檢驗項目，在調查的工作量、專業(yè)性以及復雜程度都有更高的要求。因此，為規(guī)范OOS調查流程，實驗室不僅需要具備受過專業(yè)培訓和豐富檢驗經(jīng)驗的專業(yè)技術人員，還需要建立完善的OOS結果調查程序。對于微生物實驗室OOS結果的調查，需要核實的相關記錄和影響因素非常繁雜，由于其復雜性，OOS結果的調查必須更加嚴謹，并盡量回顧實驗過程中的每一個環(huán)節(jié)。OOS結果調查分為實驗室初步調查、全面OOS結果調查、調查結論等三部分內容[4]。本文將結合實驗室的實際情況對某次無菌檢查發(fā)現(xiàn)的OOS結果進行調查和分析。

1.資料與方法

1.1 一般資料

調查時間為2022年7月25日～2022年8月2日。實驗室檢驗人員系有5年以上微生物檢驗經(jīng)驗的資深檢驗員，取得了微生物檢查和無菌檢查的崗位授權。4批無菌醫(yī)療器械，其中注射器和棉簽為監(jiān)督抽驗樣品，醫(yī)用外科口罩和醫(yī)用防護口罩為評價性抽驗樣品。

儀器設備：恒溫培養(yǎng)箱，低溫培養(yǎng)箱，全自動革蘭氏染色儀，顯微鏡，BD全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)。

1.2 方法

實驗室檢驗人員對4批無菌醫(yī)療器械進行無菌檢查，其中有一批棉簽的檢驗結果呈陽性，用一次性無菌接種環(huán)取上述陽性培養(yǎng)物經(jīng)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基劃線分離，置33°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，挑取單個菌落經(jīng)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基純化，置33°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，最終得到2株細菌，使用BD全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進行微生物鑒定[5]。

2.結果

4批無菌醫(yī)療器械的無菌檢查結果如表1所示：其中，棉簽樣品的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管均在第4天變渾濁。取渾濁的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液劃線胰酪大豆胨瓊脂平板，33°C培養(yǎng)48h，得到2株不同菌落形態(tài)的菌株[6]。

革蘭氏染色鏡檢結果均為革蘭氏陽性芽孢桿菌，經(jīng)BD全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定，全自動生化鑒定結果分別為環(huán)狀芽孢桿菌（Baci.circulans）、短小芽孢桿菌（Baci.pumilis）。

3.討論

3.1 OOS結果的調查和分析

一旦OOS結果被確定，實驗室應客觀地和及時地進行評估，不應該對OOS結果的原因進行預想的假定，應該迅速評估數(shù)據(jù)以確定結果是否屬于實驗室錯誤，或該結果是否顯示是產品缺陷的問題，在調查的過程中，每一步的調查都應做充分的記錄。下面將結合微生物實驗室的實際情況，按照《中華人民共和國藥典》（2020版）和現(xiàn)行藥品生產質量管理規(guī)范標準的要求，對此次醫(yī)療器械的無菌檢驗過程中涉及的各方面要素進行回顧和檢查[7-10]。

3.1.1 相關人員資質

試驗人員具備專業(yè)的微生物檢驗能力，有無菌檢驗的崗位授權，熟悉無菌檢驗的操作流程和監(jiān)控要點，持續(xù)參加微生物相關專業(yè)的內外部培訓，定期參與微生物相關的能力驗證。潔凈室清潔人員接受過專業(yè)的潔凈室清潔培訓，并取得相關崗位授權。

3.1.2 試驗樣品、器具和培養(yǎng)基

樣品內外包裝完整無損，外觀無異常，樣品在無菌實驗前均進行了表面消毒。實驗用培養(yǎng)基的無菌實驗結果均符合規(guī)定，實驗用器具經(jīng)過嚴格的滅菌處理，上述器具和試劑用于同日檢查的其他檢品，同時檢測的其他3批檢品無菌檢查結果均符合要求，未發(fā)現(xiàn)實驗室污染的情況。

3.1.3 設施環(huán)境

無菌檢查室定期安排專業(yè)人員進行清潔和消毒，潔凈區(qū)室定期做環(huán)境監(jiān)測，檢測當天使用的超凈工作臺的沉降菌以及手套和操作服的表面微生物，未收集到相關環(huán)境微生物，在目前為止，環(huán)境監(jiān)測收集到的微生物中，未檢測出環(huán)狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。

3.1.4 儀器設備

試驗使用的儀器設備在性能確認有效周期內，并處于正常使用狀態(tài)，滅菌參數(shù)設置和培養(yǎng)箱溫度設置正確，滅菌效果核查正常，上述設備同時用于同日檢查的其他檢品，未發(fā)現(xiàn)污染的情況。

3.1.5 培養(yǎng)基試劑耗材

無菌檢查使用的培養(yǎng)基均通過培養(yǎng)基適用性檢查，培養(yǎng)基試劑耗材均處于有效期內，外觀形狀無異常，保存條件符合要求。

3.1.6 標準物質

檢查當天試驗所用的標準物質名稱、批號是否正確，標準物質可溯源，外觀形狀無異常，儲存條件符合要求，標準物質溶液配制正確且在使用有效期內。

3.1.7 檢驗操作過程

供試品取樣均勻且有代表性，取樣量已滿足標準要求，供試品溶液配制正確，當天檢測所用的容量儀器均檢定合格并在有效期內，已按要求進行空白試驗且空白試驗符合要求。

3.1.8 污染微生物分析

試驗樣品中檢出的2株菌株分別為環(huán)狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌，在日常環(huán)境監(jiān)測的過程中從未在實驗室環(huán)境中及檢測人員的手套和操作服上檢測到這兩種菌，因此，排除污染微生物是由實驗室環(huán)境或檢測人員操作帶入污染的可能。

3.2 分析與小結

通過以上OOS結果調查分析，未發(fā)現(xiàn)明顯的實驗室缺陷。經(jīng)實驗室初步分析導致無菌檢查結果不合格的原因可能是產品終端滅菌不徹底，細菌芽孢未被完全殺滅而導致的產品質量缺陷。芽孢桿菌，細菌的一科，能形成芽孢（內生孢子）的桿菌，它們對外界有害因子抵抗力強，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處。芽孢抗逆性很強，如果滅菌不徹底，沒有被殺滅的芽孢會再次萌發(fā)，從而造成滅菌失敗[11]。

通過對上述OOS結果的調查和分析，初步建立了微生物實驗室OOS結果調查的分析方案，分別從如下多個角度加以說明：

3.2.1 人員

人員包括檢驗人員和實驗室清潔人員，檢驗人員是否熟悉相關檢測方法、程序、檢測目的和結果評價方法，是否持續(xù)接受微生物相關專業(yè)的培訓，且能夠獨立從事該項無菌檢查試驗。實驗室清潔人員是否經(jīng)過相關的培訓和授權，檢查實驗室清潔消毒記錄是否做到定期的清潔與消毒。

3.2.2 培養(yǎng)基/試劑/耗材

檢查培養(yǎng)基是否按照標準程序完成驗收，并查看培養(yǎng)基的配制、滅菌和儲存情況，確保培養(yǎng)基的配制和滅菌有效，培養(yǎng)基和浸提介質的陰性對照應符合規(guī)定。所使用的器具是否經(jīng)過消毒滅菌，一次性使用耗材是否經(jīng)過質量驗收，確保其滿足實驗的標準要求。

3.2.3 樣品

樣品名稱，樣品編號及批號是否正確，樣品外觀有無異常，內外包裝是否完整無損，樣品存儲是否符合要求，如有同時檢測的其他樣品的無菌檢查情況。

3.2.4 設施設備

潔凈區(qū)是否定期清潔消毒，定期做環(huán)境監(jiān)控，檢查實驗當天潔凈室的溫濕度和壓差是否在標準規(guī)定范圍內，是否按規(guī)定檢測當天的表面微生物和工作臺沉降細菌。儀器的計量或校準是否在周期內，核查滅菌設備滅菌效果，檢查滅菌參數(shù)和培養(yǎng)溫度是否設置正確，檢查涉及的儀器設備的日常維護和保養(yǎng)記錄。

3.2.5 檢驗用標準

檢驗用標準是否使用正確，檢驗方法是否經(jīng)過確認/驗證。

3.2.6 檢驗檢測過程

檢驗操作過程中供試品的取樣是否均勻、有代表性，供試品取樣量是否滿足標準的要求，供試品溶液是否配制正確，其過濾性和穩(wěn)定性是否滿足要求；是否已按要求進行空白試驗，檢驗過程中所用的容量儀器確保檢定合格并在有效期內；檢驗人員是否嚴格按照規(guī)定的標準操作規(guī)程進行實驗。

3.2.7 其他

此外，對檢測過程中培養(yǎng)出的微生物進行菌種鑒定是無菌檢查實驗OOS調查的關鍵步驟，決定最后是否能夠找到根本原因[12-15]。實驗室應建立潔凈區(qū)環(huán)境微生物信息庫，環(huán)境菌的收集包括定期環(huán)境監(jiān)測檢測到的空氣微生物、設施設備的表面微生物及每次實驗過程收集到的無菌操作服和無菌手套的表面微生物。當檢測出現(xiàn)陽性結果時，可將陽性檢出菌與環(huán)境微生物信息庫對比分析，以判斷檢出菌是否為實驗室環(huán)境中帶入導致的污染。

由于微生物分布的不均勻性，以及微生物的數(shù)量會因生長和環(huán)境等因素發(fā)生變化，微生物檢測通常不允許進行復試，因此，實驗室發(fā)生OOS結果時，及時有效地對OOS結果進行調查和分析，盡可能地找出導致不合格結果的真正原因，這是實驗室質量管理體系中非常關鍵的環(huán)節(jié)[16,17]。需要注意的是，由于不同單位的技術水平和資源的局限，以及人類對微生物掌握的局限，不是每次的OOS結果調查都可以發(fā)現(xiàn)其根本原因，但通過OOS結果調查的過程能夠幫助實驗室找出導致OOS結果發(fā)生的可能原因，進而采取糾正預防措施。