和夢(mèng)穎,黎爾彤,田方圓,汪 潔,金小寶,劉文彬

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510006)

Vip是蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis營(yíng)養(yǎng)期產(chǎn)生的一類殺蟲蛋白(Guptaetal., 2021)。目前已發(fā)現(xiàn)4大類Vip蛋白,分別是Vip1、Vip2、Vip3和Vip4蛋白。Vip1和Vip2蛋白可用于鞘翅目昆蟲的防治,Vip4蛋白的功能尚不清楚,而Vip3蛋白研究最為廣泛,可用于鱗翅目昆蟲等的防治。在鱗翅目昆蟲中,Vip3Aa在中腸被蛋白酶水解去除N端蛋白形成毒性蛋白,毒性蛋白與昆蟲的刷狀緣膜囊泡(Brush border membrane vesicle, BBMV)結(jié)合,導(dǎo)致BBMV形成空洞,最終引發(fā)昆蟲的死亡(Zhangetal., 2018),但其確切分子機(jī)制尚不清楚。

Vip3Aa蛋白可誘導(dǎo)真菌細(xì)胞和鱗翅目昆蟲細(xì)胞的凋亡。有研究者對(duì)甜菜夜蛾Spodopterafrugiperda幼蟲取食Vip3Aa蛋白的多個(gè)基因進(jìn)行Q-PCR后發(fā)現(xiàn),Vip3Aa可誘導(dǎo)甜菜夜蛾幼蟲Caspase-1、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-6和JAK-STAT等凋亡相關(guān)基因的上調(diào),并且通過(guò)TUNL染色觀察到中腸出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的存在,推測(cè)Vip3Aa作用可能與凋亡相關(guān)(Hernández-Martínezetal., 2017)。Hou等(2020)的研究中發(fā)現(xiàn)Vip3Aa蛋白可誘導(dǎo)甜菜夜蛾Sf9細(xì)胞的凋亡,其中溶酶體在其中扮演了重要作用。Park等(2021)發(fā)現(xiàn)Vip3Aa蛋白可通過(guò)促進(jìn)線粒體活性氧的生成和與核酸的結(jié)合誘導(dǎo)白念珠菌Candidaalbicans細(xì)胞的凋亡。

前期研究發(fā)現(xiàn)Vip3Aa蛋白可破壞美洲大蠊Periplanetaamericana的中腸上皮結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致其死亡,且發(fā)現(xiàn)美洲大蠊BBMV缺乏Vip3Aa蛋白受體,Vip3Aa蛋白并不會(huì)與美洲大蠊BBMV結(jié)合,因此也表明Vip3Aa蛋白殺美洲大蠊機(jī)制有別于殺鱗翅目昆蟲機(jī)制(Liuetal., 2020)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果代表了基因組的實(shí)時(shí)表達(dá)情況,通過(guò)對(duì)不同狀態(tài)差異基因(DEGs)的挖掘,可為探索相關(guān)機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ),如王登杰(2015)采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較了煙粉虱Bemisiatabaci是否感染球孢白僵菌Beauveriabassiana的差異基因,上述基因富集在76個(gè)主要通路,為深入研究煙粉虱對(duì)球孢白僵菌感染的免疫反應(yīng)提供了基礎(chǔ),姚知含等(2015)的研究中采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了沙蔥螢葉甲Galerucadaurica對(duì)蛻皮激素的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)蛻皮激素可通過(guò)核黃素代謝、溶酶體和泛酸與乙酰輔酶A合成通路調(diào)控沙蔥螢葉甲的生殖滯育。昆蟲的腸道是保護(hù)宿主的第一道屏障(Terraetal., 2018),前期研究發(fā)現(xiàn)Vip3Aa蛋白的主要損傷部位在中腸,因此本研究比較了美洲大蠊取食Vip3Aa蛋白的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,初步探討Vip3Aa殺美洲大蠊的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

美洲大蠊由廣東省疾病預(yù)防控制中心陰偉雄高級(jí)技工饋贈(zèng)。美洲大蠊飼養(yǎng)于本研究所昆蟲室,飼養(yǎng)溫度20～30℃,相對(duì)濕度65%～75%,飼料為鼠糧。

1.2 主要試劑和儀器

PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒購(gòu)于日本Takara公司;Trizol購(gòu)于美國(guó)英濰捷基公司;DEPC購(gòu)于美國(guó)Sigma-aldrich公司;RNAStore樣本保存液購(gòu)于天跟生化科技有限公司。TGrinder電動(dòng)組織勻漿機(jī)、TGem Plus全波長(zhǎng)分光光度計(jì)(天根生化科技有限公司);CFD-3120熒光定量PCR(美國(guó)伯樂(lè)公司);LKB-5型超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司)。

1.3 給藥與取樣

取6頭美洲大蠊成蟲,隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組,每組3頭。分組后,美洲大蠊均投放于適量溶液的培養(yǎng)皿,對(duì)照組為PBS溶液,給藥組為0.031 mg/ml Vip3Aa蛋白PBS溶液,給藥后24 h,冰浴麻醉美洲大蠊,用手術(shù)剪小心分離中腸,并將其保存于RNAStore樣本保存液。

1.4 中腸總mRNA的提取、cDNA合成和測(cè)序

將中腸組織置入DEPC預(yù)處理的研缽,加入適量液氮,研磨粉碎,加入50～100 mg/mL Trizol充分裂解樣品。12 000 rpm離心5 min取上清,加入1/5 Trizol體積氯仿,混合均勻后25℃放置15 min,12 000 rpm離心5 min取上清,加入1/2 Trizol體積異丙醇,混合均勻后25℃放置15 min,12 000 rpm離心 5 min取沉淀,加入Trizol等體積的75%乙醇,8 000 rpm離心5 min后獲得RNA沉淀,并將其溶解于ddH20。全波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280。所得mRNA送北京百邁客生物科技有限公司測(cè)序、分析。

1.5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析流程

IIIumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得raw data通過(guò)過(guò)濾低質(zhì)量、接頭污染、N堿基>5%的數(shù)據(jù)獲得Clean Data。HISAT2軟件獲取reads在參考基因組上的定位信息。StringTie軟件對(duì)比對(duì)上的reads進(jìn)行組裝,挖掘新基因。BLAST軟件對(duì)新基因信息進(jìn)行比對(duì),KOBAS 2.0預(yù)測(cè)氨基酸序列,HMMER軟件對(duì)新基因進(jìn)行注釋(孫濤等, 2021)。FPKM方法計(jì)算基因表達(dá)量,FPKM=109C/NL。以Fold Change≥2且FDR<0.01為標(biāo)準(zhǔn),篩選差異基因,所得差異基因進(jìn)行Gene Ontology功能注釋和KEGG通路富集分析(李媛媛和趙金紅, 2021)。

1.6 Real Time-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

分別選取GST8、ACHE、aminopeptidase、chymotrypsin和β-actin基因,依據(jù)基因序列,使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物。以1.4所獲得mRNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果,以β-actin作為內(nèi)參基因計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,使用對(duì)照組表達(dá)值進(jìn)行歸一化處理。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.7 TEM觀察Vip3Aa對(duì)美洲大蠊中腸超微結(jié)構(gòu)的影響

手術(shù)剪分離1.3所得中腸組織,樣品大小為1 mm×3 mm×3 mm。2.5%戊二醛固定2 h。0.1 M PBS沖洗3次(15 min/次)。置入1%餓酸固定液約3 h。0.1 M PBS沖洗3次(15 min/次)。組織依次經(jīng)過(guò)50%乙醇(15 min)、70%乙醇(15 min)、90%乙醇(15 min)、90%乙醇:90%丙酮(1∶1)(15 min)、90%丙酮(15 min)、100%丙酮(15 min)、100%丙酮(15 min)、100%丙酮(15 min)4℃脫水。常規(guī)滲透、包埋、聚合。超薄切片機(jī)(瑞典LKB-1)超薄切片,厚度50～60 nm,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。HT7700透射電鏡(日本日立公司)80 KV下觀察。

1.8 Hoechst染色觀察Vip3Aa對(duì)美洲大蠊中腸細(xì)胞凋亡的影響

手術(shù)剪分離1.3所得中腸組織,常規(guī)冷凍切片,切片厚度5 μm。PBS浸泡去除OCT包埋劑,切片滴加0.5 mL Hoechst 33258,輕微震蕩孵育5 min。使用移液器小心吸去Hoechst 33258,PBS溶液洗兩遍,每次3 min。封片,熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)和質(zhì)量評(píng)估

6個(gè)樣本的原始Reads,經(jīng)過(guò)過(guò)濾共獲得44.60 Gb Clean Data,單個(gè)樣品Clean Data為7.17～8.15 Gb,G+C含量為42.78%～45.23%,Q30堿基比例為93.32%～94.29%(表2)。

表2 本研究測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 新基因挖掘

分別通過(guò)同源蛋白簇分析數(shù)據(jù)庫(kù)(Clusters of Orthologous Groups of proteins,COG)、基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)、基因非監(jiān)督直系同源基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups Database, eggNOG)和非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Non-RedundantProtein Sequence, Nr)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,共獲得23 470條美洲大蠊基因,300<=length<1 000基因9 908個(gè),length>=1 000基因12 519。發(fā)掘新基因5 757個(gè),其中4 027個(gè)得到功能注釋(表3)。

表3 新基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 美洲大蠊取食Vip3Aa蛋白中腸差異表達(dá)分析

Fold Change≥2、FDR<0.01為截?cái)嘀?以取食PBS溶液為對(duì)照組,取食Vip3Aa蛋白后共篩選到2 302個(gè)差異基因,其中1 539個(gè)上調(diào),763個(gè)下調(diào)(圖1)。

圖1 差異基因火山圖

2.4 差異表達(dá)基因GO功能注釋和KEGG富集分析

2.4.1差異表達(dá)基因GO功能注釋

對(duì)2 302個(gè)差異基因進(jìn)行GO基因功能注釋,由GO富集顯示得到生物學(xué)功能條目2 218個(gè)(P<0.05),其中,生物過(guò)程(Biological process,BP)為1 313條,細(xì)胞組成(Cellular component,CC)為303條,分子功能(Molecular function,MF)為602條。富集程度最高的前5條生物過(guò)程為代謝過(guò)程(Metabolic process)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)、單生物過(guò)程(Single-organism process)、生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)、定位(Localization);富集程度最高的前5條細(xì)胞組成為膜(Membrane)、細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞部分(Cell part)、膜部分(Membrane part)、細(xì)胞器(Organelle);富集程度最高的前5條分子功能為催化活性(Catalytic activity)、結(jié)合(Binding)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(Transporter activity)、結(jié)構(gòu)分子活性(Structural molecule activity)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(Signal transducer activity)(見(jiàn)圖2)。

圖2 差異表達(dá)基因GO注釋分類

2.4.2差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

KEGG通路富集(P<0.05)結(jié)果顯示Vip3Aa活性主要涉及調(diào)控溶酶體(Lysosme)、其他多糖降解(Other glycan degradation)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)、昆蟲激素合成(insect hormone biosythesis)、鞘糖脂生物合成(Glycospinggolipid biosynthesis)、藥物代謝(Drug metabolism)、凋亡(Apoptosis)等信號(hào)通路(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

2.4 部分基因的qRT-PCR驗(yàn)證

分別選取GST8、ACHE、aminopeptidase和chymotrypsin基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,以β-actin為內(nèi)參基因。取食Vip3Aa后,GST8、ACHE、aminopeptidase和chymotrypsin基因均顯著上調(diào)(t=3.15,P<0.01;t=4.95,P<0.01;t=2.21,P<0.05;t=2.48,P<0.05),與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致(圖4)。

圖4 qRT-PCR 檢測(cè)GST8、ACHE、aminopeptidase和chymotrypsin基因

2.5 Vip3Aa對(duì)中腸溶酶體和凋亡的影響

2.5.1Vip3Aa對(duì)中腸凋亡和溶酶體相關(guān)基因影響

檢索溶酶體和凋亡相關(guān)基因比較結(jié)果:溶酶體相關(guān)差異表達(dá)基因50個(gè),其中有42個(gè)上調(diào),8個(gè)下調(diào)。凋亡相關(guān)差異表達(dá)基因21個(gè),其中有17個(gè)上調(diào),4個(gè)下調(diào)(表4,表5)。

表4 部分溶酶體基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異倍數(shù)

表5 部分凋亡轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序差異倍數(shù)

2.5.2透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM)觀察Vip3Aa對(duì)美洲大蠊中腸超微結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組無(wú)可見(jiàn)溶酶體,線粒體線粒體呈橢球形,結(jié)構(gòu)完整,輪廓清晰(藍(lán)色箭頭)。Vip3Aa處理后,線粒體腫脹、空泡、破裂,出現(xiàn)大量次級(jí)溶酶體(紅色箭頭),提示Vip3Aa可以導(dǎo)致中腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷,激活溶酶體(圖5)。

圖5 Vip3Aa對(duì)美洲大蠊中腸超微結(jié)構(gòu)的影響

2.5.3Hoechst 33342染色檢測(cè)Vip3Aa對(duì)中腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

正常中腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻藍(lán)色熒光,Vip3Aa處理后,可見(jiàn)部分細(xì)胞的細(xì)胞核凝集、固縮、熒光強(qiáng)度增加(紅色箭頭標(biāo)注),表現(xiàn)凋亡特征(圖6)。

圖6 Vip3Aa給藥后對(duì)中腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

3 結(jié)論和討論

美洲大蠊是“四害”之一,也是最常見(jiàn)的家居害蟲。美洲大蠊生活環(huán)境惡劣,可攜帶大量病原菌,其可通過(guò)爬行和取食等方式機(jī)械傳播病菌(Salgado, 2021)?；瘜W(xué)殺蟲劑的長(zhǎng)期使用,導(dǎo)致了美洲大蠊的耐藥性、再猖獗,殺蟲劑的殘毒也對(duì)人類的身體安全造成一定損害,應(yīng)限制化學(xué)殺蟲劑的使用(Rahimianetal., 2019)。生物防治以其安全、高選擇性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是一種有潛力的防治方法,如黑胸大蠊Periplanetafuliginosa濃核病毒即被研發(fā)用于美洲大蠊的防治(Hanetal., 2013)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌產(chǎn)生的Vip3Aa蛋白具殺美洲大蠊作用,但其作用機(jī)制不明(Liuetal., 2020)。Vip3Aa蛋白主要損傷中腸,因此本文選取中腸進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。中腸是產(chǎn)生各類消化酶的主要部位,因此分別選取了4個(gè)消化酶基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,證明所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。Vip3Aa蛋白處理后,共獲得了2 302個(gè)差異DEGS,其中上調(diào)基因1 539個(gè),下調(diào)基因763個(gè)。為揭示Vip3Aa蛋白殺美洲大蠊作用的分子生理機(jī)制,本研究對(duì)篩選到的差異基因進(jìn)行了功能富集。Vip3Aa活性主要涉及調(diào)控溶酶體、其他多糖降解、淀粉和蔗糖代謝、糖胺聚糖降解、昆蟲激素合成、鞘糖脂生物合成、藥物代謝、凋亡等信號(hào)通路。溶酶體是一種膜性細(xì)胞器,通過(guò)多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,溶酶體-線粒體途徑中Cathepsins直接或間接導(dǎo)致線粒體通透性改變, 使線粒體促凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(Nagata, 2018)。

溶酶體誘導(dǎo)的凋亡是多種殺蟲劑的作用機(jī)理,如Ningshen等(2017)將殺蟲晶體蛋白(Crystal, Cry)蛋白注射入飛楊阿夜蛾Achaeajanata幼蟲腹腔后,可見(jiàn)溶酶體激活引起組織溶解。印楝素可誘導(dǎo)溶酶體釋放組織蛋白酶,引起中腸細(xì)胞凋亡,抑制橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis幼蟲的生長(zhǎng)(Zhaoetal., 2019)。本研究差異基因中包含溶酶體相關(guān)差異基因50個(gè),凋亡相關(guān)差異基因21個(gè),因此推測(cè)溶酶體可能參與Vip3Aa誘導(dǎo)的美洲大蠊中腸細(xì)胞凋亡。后續(xù)研究中分別采用透射電鏡和Hoechst 33342染色觀察了中腸組織變化。Vip3Aa處理后,可見(jiàn)大量次級(jí)溶酶體出現(xiàn),部分線粒體腫脹破裂,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡形態(tài)改變,進(jìn)一步證實(shí),Vip3Aa蛋白可能通過(guò)上皮細(xì)胞溶酶體-線粒體損傷介導(dǎo)凋亡通路的激活發(fā)揮殺美洲大蠊作用。

綜上所述,本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序了比較Vip3Aa蛋白處理中腸的基因表達(dá)差異,并通過(guò)差異基因功能富集和病理學(xué)觀察初步證實(shí)Vip3Aa蛋白可能通過(guò)上皮細(xì)胞溶酶體-線粒體損傷介導(dǎo)凋亡通路的激活發(fā)揮殺美洲大蠊作用,本研究有助于深入了解Vip3Aa蛋白的殺美洲大蠊作用,為將Vip3Aa蛋白用于美洲大蠊的生物防治提供理論依據(jù)。下一步的研究中,我們將在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平就Vip3Aa激活溶酶體的機(jī)制進(jìn)行深入研究。