王禹生,田小利,肖 陽,張 杰,梁 寬,黃浩賢,鄧小娟*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物功能基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省蠶桑工程技術(shù)研究中心,廣州 510642;2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣州 510610)

昆蟲具有極強(qiáng)的適應(yīng)性,是地球上種類最多、分布最廣的類群,這主要是因?yàn)樗鼈兙哂袕?qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)。當(dāng)微生物突破昆蟲的第一道防線——物理屏障時(shí),被宿主模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別并激活宿主的先天免疫(Luetal., 2020)。先天免疫系統(tǒng)由細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分組成,細(xì)胞免疫由血細(xì)胞執(zhí)行的吞噬、包囊和凝結(jié)等組成,而體液免疫包括黑化作用、合成和分泌抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)與溶菌酶等(Lemaitre &Hoffmann, 2007;Yangetal., 2021)。細(xì)胞免疫和體液免疫發(fā)揮各自不同的作用,并協(xié)同工作以清除外來的病原物(Haineetal., 2008)。AMPs是一類重要的抗菌效應(yīng)分子,受病原誘導(dǎo)并能在昆蟲持續(xù)存在達(dá)數(shù)周之久(Makarovaetal., 2016)。微生物誘導(dǎo)AMPs的產(chǎn)生主要通過進(jìn)化保守的Toll、IMD和JAK/Stat等信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控(Yangetal., 2021),1990s Toll受體在果蠅Drosophilamelanogaster中激活抗感染免疫功能的闡明(Lemaitreetal.,1996)促進(jìn)了哺乳動(dòng)物Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的發(fā)現(xiàn),并極大地推動(dòng)了先天免疫分子機(jī)制的研究(Vijay, 2018)。

除了病原微生物的感染,AMPs的表達(dá)也受到非感染因素的誘導(dǎo),如營養(yǎng)剝奪(Uncklessetal., 2015)、激素(Reynoldsetal., 2020)和DNA損傷(Karpacetal., 2011)等。饑餓信號(hào)能降低果蠅ILS水平激活絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt,進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子FoxO被激活進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),啟動(dòng)AMPs基因的表達(dá)(Beckeretal., 2010; Zhangetal., 2018)。類固醇激素20-羥基蛻皮酮(20E)作為昆蟲發(fā)育和變態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子,也調(diào)控AMPs基因的表達(dá)(Flatetal., 2008; Hanetal., 2017),現(xiàn)有的研究表明20E可以通過調(diào)控肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP)進(jìn)而調(diào)節(jié)AMPs的表達(dá)(Rusetal., 2013; Wangetal., 2014; Hanetal., 2017),也可以通過20E信號(hào)通路中關(guān)鍵因子BR-C調(diào)控AMPs的表達(dá)(Maietal., 2017)。

隨著家蠶基因組計(jì)劃的完成,在家蠶基因組中發(fā)現(xiàn)和鑒定了Attacins、Cecropins、Moricins, Gloverins、Enbocins、Lebocins和Defensins 7個(gè)AMPs家族的37條基因序列,部分序列的抗菌功能得到鑒定(Chengetal., 2006; Yangetal., 2011)?；诳咕V、抗菌活性和微生物對AMPs基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性,推測BmCecB6、BmcecD和Bmmor在清除微生物感染的免疫過程中起重要作用(Yangetal., 2011)。20E對家蠶AMPs表達(dá)的影響及其分子機(jī)制的研究較少,Tian等(2010)發(fā)現(xiàn)20E抑制家蠶Moricin和Cecropin等AMPs基因的轉(zhuǎn)錄水平。本研究對20E調(diào)控家蠶抗菌肽BmCecB6的表達(dá)進(jìn)行研究,并對BmCecB6的啟動(dòng)子進(jìn)行截短和雙熒光素酶啟動(dòng)子活性分析,以期為進(jìn)一步揭示昆蟲的發(fā)育與免疫之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶幼蟲:品種為大造,五齡幼蟲在25℃±1℃以新鮮桑葉飼養(yǎng)。家蠶細(xì)胞卵巢細(xì)胞系Bm-12用含有10%(v/v)胎牛血清(Gibco)和90%(v/v)TNM-FH培養(yǎng)基(Sigma Aldrich,USA),在27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

pGL3-Basic螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒載體和pRL-Null海腎熒光素酶質(zhì)粒載體(美國Promega公司)由華南師范大學(xué)昆蟲研究所李勝研究員提供,pRL-Null插入Actin5報(bào)告基因構(gòu)建成pRL-Null-Actin5海腎熒光素酶重組內(nèi)參質(zhì)粒用于檢測細(xì)胞中的本底熒光值。

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物公司。

Phospho-Drosophila Akt (Ser505)和Akt抗體為Cell signaling technology公司產(chǎn)品,Tubulin 單克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所。

蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)為美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品。Trizol Reagents總RNA抽提試劑盒,限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄用試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)、T4 DNA ligase、Primer-STAR DNA聚合酶均購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SsoFast EvaGreen Supermix為美國Bio-Rad產(chǎn)品。Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒為德國Qiagen公司產(chǎn)品。Dual-Luciferase Report Assay System試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.120E處理方法

20E注射家蠶幼蟲:取家蠶5齡第3天幼蟲,以微量注射器從腹部最后一對足處注射5 μL 20E工作液(相當(dāng)于5 μg/頭),3、6、9和12 h后收集脂肪體。為了探討不同劑量的20E對AMPs表達(dá)的影響,設(shè)置0.05、0.5、5和10 μg/頭的處理組,注射6 h后進(jìn)行樣品收集和預(yù)處理,并以注射等體積的20%乙醇為對照。將5頭家蠶的脂肪體作為一個(gè)樣品,每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)樣品。

20E處理離體培養(yǎng)的家蠶脂肪體組織:取家蠶5齡第3天幼蟲,以75%酒精進(jìn)行體表消毒、晾干,用解剖剪剖開體腔后從腹部刮取脂肪體,于無菌的昆蟲生理鹽水中漂洗后轉(zhuǎn)移至含有Grace昆蟲培養(yǎng)基(Antibiotic-Antimycotic)的6孔板中進(jìn)行無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)3 h后加入20E使終濃度為5 μg/mL,處理4、8和12 h后收集脂肪體備用,以加入等體積的20%酒精處理作為對照。

20E處理Bm-12細(xì)胞:在對數(shù)生長期的Bm-12細(xì)胞中分別加入20E,使終濃度為0.01、0.1、1和10 μg/mL,處理4、8和12 h后收集細(xì)胞備用,以加入等體積的20%酒精作為對照。

1.2.2qRT-PCR對AMPs基因的表達(dá)定量

為檢測AMPs基因的表達(dá)水平,取家蠶五齡幼蟲脂肪體和Bm-12細(xì)胞,根據(jù)MIQE指南的標(biāo)準(zhǔn)(Bustinetal., 2010)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。首先按TRIzol Reagent RNA(Invitrogen)提取試劑使用說明書提取總RNA,總RNA經(jīng)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在CFX96定量PCR儀(Bio-rad)檢測AMPs、胰島素受體InR和20E受體初級(jí)轉(zhuǎn)錄因子E75a的轉(zhuǎn)錄活性,參考Zhang等(2018)設(shè)計(jì)定量引物,序列見表1。采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Bio-rad),反應(yīng)體系為:SsoFast EvaGreen Supermix (2×)10 μL,引物(10 μmol/L)各0.2 μL,cDNA 0.1 μL(相當(dāng)于10 ng 總RNA),加ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性1 min;(95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 45 s)循環(huán)40次;溶解曲線在65～95℃每隔0.5℃采集1次,每次采集5 s。以rp49(核糖體蛋白,ribosome protein,rp49)作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔct法(Livak &Schmittgen, 2001)計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3BmCecB6啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增

取家蠶脂肪體,利用Tissue DNA Kit (OMEGA,USA)抽提基因組DNA,根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫Silkbase 3.0獲得的BmCecB6啟動(dòng)子序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增不同長度的啟動(dòng)子序列引物。上游引物序列見表2,下游引物BmCecB6_R:5′-GAAGATCTGTTCACTCGTACACGGCTCAAAC-3′,下劃線序列分別為BglII酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系:TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)0.25 μL,10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL,上下游引物(20 μmol/L)各1 μL,基因組模板DNA 2.5 ng,加ddH2O補(bǔ)充到50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃ 4 min→(94℃ 1 min→58℃ 30 s→72℃ 1.2 min)×30 cycles→72℃ 10 min→4℃ ∞。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析獲得與預(yù)期大小相符的條帶,按AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的條帶的回收與純化。

表2 擴(kuò)增截短的BmCecB6啟動(dòng)子引物序列

1.2.4構(gòu)建BmCecB6不同長度啟動(dòng)子的pGL3-Basic重組載體

使用限制性內(nèi)切酶MluI和BglII對pGL3-Basic啟動(dòng)子載體和BmCecB6啟動(dòng)子序列(野生型,wt)進(jìn)行雙酶切,分別回收大片段后于16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)amp篩選和PCR鑒定,將陽性克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序確認(rèn),構(gòu)建成功的重組載體命名為pGL3-BmCec6_wt。

1.2.5構(gòu)建缺失FoxO結(jié)合位點(diǎn)的BmCecB6啟動(dòng)子的pGL3-Basic重組載體

BmCecB6啟動(dòng)子上游1 623 bp區(qū)域存在5個(gè)可能的FoxO結(jié)合位點(diǎn)(TXTTTAY;X-N,Y-C/T),采用重疊PCR方法按1～5的順序依次進(jìn)行FoxO結(jié)合位點(diǎn)的缺失突變(Zhangetal., 2018),引物序列見表3。由于第2、3、4三個(gè)位點(diǎn)緊密相鄰,可將3個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行缺失突變,經(jīng)過3輪定點(diǎn)突變后,即可獲得缺失FoxO結(jié)合位點(diǎn)的BmCecB6_△FoxO1-5上游序列。按1.2.4的方法將缺失FoxO結(jié)合位點(diǎn)的BmCecB6啟動(dòng)子序列插入pGL3.0-Basic,構(gòu)建成功的載體命名為pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5。

表3 BmCecB6啟動(dòng)子序列缺失FoxO結(jié)合位點(diǎn)的重疊PCR引物序列

1.2.6啟動(dòng)子活性分析

利用Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒分別將重組質(zhì)粒pGL3-BmCecB6_wt和pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-Null-Actin5共轉(zhuǎn)染Bm-12細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,用20E(1 μg/mL)處理細(xì)胞8 h,室溫1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞,棄上清。用0.1 mol/L PBS清洗細(xì)胞,收集到的細(xì)胞按雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒檢測雙熒光值,計(jì)算螢火蟲熒光素酶(Fluc luciferase, Fluc)與海腎熒光素酶(renilla luciferase,Rluc)比值。

1.2.7免疫印跡檢測

用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白,上樣進(jìn)行12% SDS-PAGE,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉30 min后,用p-Akt抗體Phospho-Drosophila Akt (Ser505)、總Akt抗體、Tubulin抗體室溫孵育過夜,TBST清洗3次后用二抗室溫孵育2 h,再用TBST清洗3次,最后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.8數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中采用3個(gè)獨(dú)立的家蠶脂肪體樣本或3個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)液,每次實(shí)驗(yàn)分析中的每個(gè)樣品采用3～5個(gè)重復(fù)。使用GraphPad Prism 8.0軟件t-檢驗(yàn)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,星號(hào)表示差異顯著(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)。

2 結(jié)果與分析

2.1 20E上調(diào)家蠶BmCecB6的表達(dá)

20E調(diào)控家蠶蛻皮的信號(hào)通路中,E75是20E的初級(jí)應(yīng)答基因,E75家族中E75a對20E響應(yīng)較為明顯(Lietal., 2016)。為測試家蠶對20E的應(yīng)答,取5齡第3天的幼蟲按5 μg/頭的劑量注射20E,通過qRT-PCR檢測對20E處理后的幼蟲脂肪體中BmE75a基因的轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)果如圖1所示。20E注射后,家蠶幼蟲脂肪體中BmE75a在3 h、6 h轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)顯著,9 h和12 h轉(zhuǎn)錄活性降低,與對照沒有顯著差異(圖1-a)。為檢測AMPs基因?qū)?0E的應(yīng)答,本研究檢測了20E處理的AMPs轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果表明BmCecB6(BmCecropinB6)在20E誘導(dǎo)6 h有明顯的上調(diào),而家蠶BmdefB(BmDefensinB)和Bmmor(BmMoricin)的表達(dá)在20E處理后沒有顯著的變化(圖1-b),因此選擇BmCecB6作為后續(xù)檢測應(yīng)答20E的抗菌肽靶基因。

圖1 注射20 E后家蠶幼蟲脂肪體中 E75a和AMPs的轉(zhuǎn)錄水平

為了確定20E的最佳處理劑量,本研究測試了每頭幼蟲注射不同劑量的20E對BmE75a和BmCecB6的誘導(dǎo)效果,結(jié)果表明低濃度的20E(0.05 μg/頭和0.5 μg/頭)處理后,BmE75a和BmCecB6的轉(zhuǎn)錄活性均沒有明顯的變化;5 μg/頭20E能顯著上調(diào)BmE75a和BmCecB6的表達(dá)(見圖2)。高劑量的20E(10 μg/頭)注射后48 h左右,家蠶出現(xiàn)體節(jié)發(fā)黑、口吐黃色液體的現(xiàn)象,有少部分家蠶死亡?？梢?0 μg/頭的劑量嚴(yán)重影響了家蠶的生理和發(fā)育。因此,處理5齡幼蟲20E的合適劑量為5 μg/頭。

圖2 注射不同劑量的20E后家蠶幼蟲中脂肪體中E75a和BmCecB6的轉(zhuǎn)錄水平

20E處理促進(jìn)家蠶5齡幼蟲脂肪體中的抗菌肽BmCecB6的表達(dá)上調(diào),那么20E是否同樣能上調(diào)游離培養(yǎng)的脂肪體和Bm-12細(xì)胞中BmCecB6基因的表達(dá)?qRT-PCR結(jié)果顯示20E也能上調(diào)離體培養(yǎng)的脂肪體和Bm-12細(xì)胞中BmCecB6的轉(zhuǎn)錄水平(圖3)。

圖3 20E誘導(dǎo)家蠶游離培養(yǎng)的脂肪體和Bm-12細(xì)胞中BmCecB6的表達(dá)

為探索20E處理Bm-12細(xì)胞的最佳處理濃度,本研究設(shè)置了4個(gè)不同濃度的20E(0.01、0.1、1和10 μg/mL細(xì)胞培養(yǎng)液)處理Bm-12細(xì)胞,8 h后收集細(xì)胞檢測BmCecB6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性,結(jié)果顯示:0.01 μg/mL 20E處理的Bm-12細(xì)胞中,BmCecB6

的表達(dá)無明顯變化;0.1、1、10 μg/mL的20E均顯著上調(diào)BmCecB6的轉(zhuǎn)錄活性,以1 μg/mL和10 μg/mL誘導(dǎo)的效果最為明顯(圖4)。雖然1 μg/mL與10 μg/mL的20E處理細(xì)胞后BmCecB6的表達(dá)上調(diào)明顯且無明顯差異,但鑒于高濃度的20E對Bm-12細(xì)胞正常生長有一定的影響,后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用的20E處理濃度為1 μg /mL。與紅頭麗蠅Calliphoravicina脂肪體細(xì)胞中報(bào)道的結(jié)果(Gordyaetal., 2016)不同,Bm-12細(xì)胞中沒有出現(xiàn)高濃度20E抑制免疫應(yīng)答的現(xiàn)象。

圖4 不同濃度的20E處理家蠶Bm-12細(xì)胞誘導(dǎo)BmCecB6的轉(zhuǎn)錄活性

2.2 截短型BmCecB6啟動(dòng)子活性分析

為探討20E誘導(dǎo)AMPs表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制,使用在線軟件MatInspector (http://www. genomatix.de/products/index.html)對BmCecB6啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)BmCecB6的1.6 kb啟動(dòng)子區(qū)存在NF-κB、FoxO和EcR、BR-C、E74A等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在啟動(dòng)子中的位置,將1 623、1 003、630、448和170 bp共5個(gè)不同長度的啟動(dòng)子序列,通過雙熒光素酶活性分析測定不同長度的啟動(dòng)子對20E的響應(yīng)情況,結(jié)果如圖6所示。圖6顯示-1 003～-1、-630～-1和-448～-1啟動(dòng)子活性和野生型啟動(dòng)子無明顯差異,而20E對-170～-1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性明顯下降,說明BmCecB6對20E的應(yīng)答元件在-448～-170啟動(dòng)子區(qū)域。該區(qū)域存在1個(gè)NF-κB、3個(gè)FoxO、2個(gè)BR-C和1個(gè)E74A位點(diǎn)。

圖5 BmCecB6啟動(dòng)子區(qū)域潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的預(yù)測分析

圖6 不同長度的BmCecB6啟動(dòng)子活性分析

2.3 FoxO不是直接調(diào)控BmCecB6的轉(zhuǎn)錄因子

BmCecB6在-448～-170啟動(dòng)子區(qū)域存在對20E的可能應(yīng)答元件NF-κB、FoxO、BR-C和E74A位點(diǎn),其中NF-κB為昆蟲體液免疫通路(Toll和Imd信號(hào)通路)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,參與微生物感染誘導(dǎo)的免疫機(jī)制(Lemaitre &Hoffmann, 2007);FoxO為類胰島素信號(hào)(ILS)中的重要轉(zhuǎn)錄因子,近年來發(fā)現(xiàn)FoxO也參與饑餓誘導(dǎo)的免疫(Beckeretal., 2010; Zhang &Palli, 2018);BR-C和E74A是響應(yīng)20E信號(hào)的初次級(jí)轉(zhuǎn)錄因子,在家蠶中已經(jīng)證明BR-C調(diào)控20E誘導(dǎo)變態(tài)發(fā)育期中腸抗菌肽lebocin的表達(dá)(Maietal., 2017)。為了驗(yàn)證FoxO是否參與20E誘導(dǎo)的BmCecB6表達(dá)調(diào)控,首先通過qRT-PCR檢測FoxO的靶標(biāo)基因胰島素受體(BmInR)的表達(dá)是否上調(diào)來判斷20E處理后是否激活家蠶轉(zhuǎn)錄因子FoxO,qRT-PCR結(jié)果如圖7所示,顯示20E處理后的家蠶幼蟲脂肪體、離體培養(yǎng)脂肪體和Bm-12細(xì)胞中BmInR的表達(dá)上調(diào),暗示了20E處理減弱類胰島素信號(hào)通路(ILS)水平,激活的轉(zhuǎn)錄因子FoxO入核調(diào)控靶標(biāo)基因BmInR的表達(dá)。對Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果顯示20E處理導(dǎo)致Akt磷酸化水平下降(圖8),證實(shí)了上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。20E處理導(dǎo)致ILS水平下降,FoxO去磷酸化而被激活入核,與Hossain等(2013)報(bào)道的結(jié)果相符。

圖7 20E處理導(dǎo)致BmInR表達(dá)上調(diào)

圖8 20E處理導(dǎo)致Bm-12細(xì)胞中Akt磷酸化水平降低

為了進(jìn)一步FoxO的激活是否參與20E誘導(dǎo)的BmCecB6表達(dá)調(diào)控,將BmCecB6啟動(dòng)子區(qū)(1.6 kb)的FoxO位點(diǎn)利用重疊PCR的方法進(jìn)行缺失(Deletion)突變后,測序正確后插入pGL3 Basic載體,構(gòu)建成缺失FoxO位點(diǎn)的pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5重組載體。采用雙熒光素酶活性分析缺失FoxO位點(diǎn)對BmCecB6應(yīng)答20E活性的影響,將pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5和野生型啟動(dòng)子重組載體pGL3-BmCecB6_wt轉(zhuǎn)染Bm-12細(xì)胞,檢測雙熒光素活性,結(jié)果顯示缺失FoxO位點(diǎn)對啟動(dòng)子活性沒有明顯的影響(圖9),可見BmCecB6啟動(dòng)子對20E的應(yīng)答活性不是通過FoxO結(jié)合到BmCecB6啟動(dòng)子區(qū)的順式元件直接起作用的。

圖9 缺失FoxO結(jié)合位點(diǎn)對BmCecB6啟動(dòng)子活性的影響

3 結(jié)論與討論

在昆蟲中,20E與JH協(xié)同作用,調(diào)節(jié)蛻皮、變態(tài)和發(fā)育繁殖(Riddifordetal., 2003; Zhuetal., 2021)。越來越多的證據(jù)表明20E還參與昆蟲先天免疫過程,如吞噬和AMPs的產(chǎn)生(Dimarcqetal., 1997; Flattetal., 2008; Zhang &Palli, 2009; Rusetal., 2013; Nunesetal., 2021)。哺乳動(dòng)物中的研究也表明類固醇激素及其受體對先天免疫和炎癥反應(yīng)起著重要的調(diào)節(jié)作用(Benagianoetal., 2019)。果蠅幼蟲中微生物感染誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗菌肽diptericin,只有在3齡幼蟲后期20E滴度達(dá)到足夠的量時(shí)才會(huì)發(fā)生(Meister &Richards, 1996);感染前以20E預(yù)處理果蠅S2細(xì)胞可以提高AMPs基因的轉(zhuǎn)錄水平(Flattetal., 2008);本研究也證實(shí)了20E的處理可以激活家蠶BmCecB6的表達(dá)。Wang等(2014)發(fā)現(xiàn),棉鈴蟲Helicoverpaarmigera在化蛹前的游走期,隨著20E滴度增高,脂肪體中抗菌肽Attacin、Gloverin、Cecropin和溶菌酶Lysozyme等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)。20E激活飛蝗AMPs基因表達(dá)的同時(shí),也能激活體液免疫的其他成分,比如酚氧化酶系統(tǒng)(Hanetal., 2017; Hanetal., 2020)。

20E對昆蟲免疫系統(tǒng)的影響,除了調(diào)節(jié)體液免疫,其滴度升高同時(shí)可以激活細(xì)胞免疫(Reganetal., 2013)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Ahmedetal., 1999;Reynoldsetal., 2020)、昔古比天蠶Hyalophoracecropia(Roxstr?m-Lindquistetal., 2005)、印度谷螟Plodiainterpunctella(Ayeetal., 2008)和煙草天蛾Manducasexta(Zouetal., 2005)等昆蟲中均報(bào)道了20E的免疫激活作用。值得注意的是,一方面20E促進(jìn)昆蟲的免疫反應(yīng),提高昆蟲對病原微生物的抵抗能力;另一方面,微生物感染昆蟲后可以通過 3-脫氫蛻皮激素-3β-還原酶(3DE-3β-reductase)促進(jìn)20E滴度升高,同時(shí)促進(jìn)免疫反應(yīng)(Sunetal., 2016),表明昆蟲的免疫與20E的激素水平存在相互作用的關(guān)系。

20E激活并增強(qiáng)昆蟲的體液免疫作用,是與其生理發(fā)育相適應(yīng)的。在完全變態(tài)昆蟲由幼蟲—蛹的變態(tài)發(fā)育過程中,20E結(jié)合到由脫皮激素受體(EcR)和超氣門蛋白(USP)組成的異源二聚體上,并激活包括廣泛復(fù)合體(BR-C)和E74在內(nèi)的初、次級(jí)轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Baehrecke, 2000),最終導(dǎo)致幼蟲組織的降解和蛹組織的再生。新舊組織的替換和更新過程中,昆蟲容易受到微生物的感染,此時(shí)體內(nèi)20E水平的升高激活的免疫反應(yīng)對變態(tài)發(fā)育期的蟲體起到重要的保護(hù)作用。然后,也有些研究顯示20E具有免疫抑制的作用:Gordya等(2016)發(fā)現(xiàn)在紅頭麗蠅脂肪體細(xì)胞中,低濃度的蛻皮激素能夠提高其免疫力,誘導(dǎo)AMPs的表達(dá),而高濃度的蛻皮激素會(huì)抑制其免疫反應(yīng);20E處理可以抑制家蠶某些AMPs基因轉(zhuǎn)錄水平(Tianetal., 2010);Beckstead等(2005)報(bào)道20E以EcR依賴性的方式抑制抗菌肽defensin,cecropinC,attacinA,drosocin和drosomycin的表達(dá),這或許表明激素對免疫的調(diào)節(jié)作用是劑量依賴性的。這種復(fù)雜性暗示了昆蟲體內(nèi)存在多種不同的調(diào)控機(jī)制,20E調(diào)控體液免疫的關(guān)鍵基因,這些基因的作用途徑總結(jié)起來可以分為3類:(1) 依賴于Toll和IMD等先天免疫通路;(2) 依賴于胰島素(Insulin)信號(hào)途徑;(3) 依賴于20E信號(hào)通路因子BR-C等的直接調(diào)控(王遠(yuǎn)等,2019)。Rus等(2013)提出果蠅通過兩個(gè)不同的機(jī)制調(diào)控AMPs的表達(dá),一種機(jī)制是20E通過調(diào)控早期蛻皮激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子(BR-C, Eip93F, Eip74EF, Eip78C和HR46)以及2個(gè)果蠅GATA因子(Serpent和Pannier),進(jìn)而調(diào)控PGRP-LC ,通過IMD通路調(diào)控AMPs的表達(dá);另一種是不依賴PGRP-LC而是通過BR-C、Serpent和Pannier影響一部分AMPs的表達(dá),兩條通路之間存在交叉重疊。該模型解釋了在果蠅的先天性免疫中20E可以通過影響IMD信號(hào)途徑進(jìn)而調(diào)控AMPs表達(dá)的機(jī)制。

昆蟲體液免疫主要由脂肪體(相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的肝臟)中合成AMPs,分泌到血淋巴后通過開放的體液循環(huán)系統(tǒng)將其運(yùn)送到其他組織器官,發(fā)揮系統(tǒng)性免疫作用(Lemaitre &Hoffmann, 2007; Eleftherianosetal.,2021)。20E對先天免疫的調(diào)節(jié),既作用于昆蟲的系統(tǒng)免疫(Systemic immunity),也調(diào)節(jié)局部免疫(Local immunity),即通過某些局部器官或組織如中腸、表皮、馬氏管、氣管中合成的AMPs產(chǎn)生的局部免疫反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn):化蛹期的果蠅抗真菌基因drosomycin(drs)及其家族同系物成員drosomycin-like2和drosomycin-like5的表達(dá)顯著增加,蛻皮激素信號(hào)調(diào)控脂肪體drosomycin和中腸drosomycin-like2的表達(dá)(Nunesetal., 2021)。果蠅胚胎氣管上皮中抗菌肽drosocin的表達(dá)同樣需要20E信號(hào)(Tanetal., 2014)。家蠶由幼蟲向蛹發(fā)育的變態(tài)期中腸中的模式識(shí)別受體(PRR)和AMPs基因表達(dá)上調(diào)(Xuetal., 2012),Mai等(2017)的研究揭示中腸抗菌肽lebocin的表達(dá)上調(diào)受到BmBR-C Z4和BmEts的調(diào)控。

本研究表明20E誘導(dǎo)家蠶脂肪體抗菌肽BmCeB6的表達(dá),調(diào)控BmCeB6表達(dá)的順式元件存在于5′上游啟動(dòng)子區(qū)-448～-170之間,該啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)存在的BR-C和E74A等結(jié)合位點(diǎn)是潛在的調(diào)控因子。下一步將通過對該啟動(dòng)子區(qū)域做更精細(xì)的截短和雙熒光素酶活性分析,同時(shí)結(jié)合EMSA等方法獲得BmCecB6應(yīng)答20E的調(diào)控元件。