王思懿,胡 穎,劉小玉,荊 欣,馮佩林,朱樂冉,姚雨桐,陳大福,2,郭 睿,2*,徐國鈞*

(1. 福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院),福州 350002;2. 福建農(nóng)林大學蜂療研究所,福州 350002)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡稱意蜂),是一種優(yōu)良的西方蜜蜂Apismellifera亞種,具有優(yōu)越的采集和造脾能力,在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中廣泛使用(曾志將, 2009)。東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae特異性侵染成年蜜蜂的中腸上皮細胞,可引起宿主的細胞凋亡和免疫應(yīng)答抑制,消化系統(tǒng)紊亂,記憶受損和壽命縮短,導(dǎo)致的微孢子蟲病給養(yǎng)蜂生產(chǎn)造成較大損失(Burnham, 2019)。目前,東方蜜蜂微孢子蟲廣泛感染世界各地的飼養(yǎng)蜂群(梁勤和陳大福,2009)。雖然東方蜜蜂微孢子蟲的參考基因組(Pelinetal., 2015)和全長轉(zhuǎn)錄組均已公布,但轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)體系的缺失導(dǎo)致相關(guān)基因功能研究較為滯后。

脂肪酸輔酶A連接酶(fatty acid CoA ligase,FAL)也稱脂酰輔酶A合成酶(acyl-CoA Synthetase,ACS)在真核細胞中廣泛存在,催化長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為?；o酶A,在脂質(zhì)生物合成、能量合成及基因表達調(diào)控等方面起到重要作用(Dongetal., 2012)。Sung(2007)等研究發(fā)現(xiàn)用脂肪酸輔酶A連接酶家族的抑制劑Triacsin C處理后,細胞的生長受到抑制,且細胞凋亡顯著增加。Tenagy(2019)等發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入Triacsin C后,3種馬拉色菌Malasseziaspp.的生長受到抑制且這種抑制與Triacsin C呈劑量依賴關(guān)系。然而,東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL研究迄今仍然缺失,相關(guān)信息匱乏。

前期研究中,筆者團隊測定了東方蜜蜂微孢子蟲侵染意大利蜜蜂工蜂的過程中nce-miR-15338及其靶基因LCFAL2在的表達譜,發(fā)現(xiàn)二者均呈持續(xù)下降的表達趨勢(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究對東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的LCFAL2基因進行表達驗證,進而分析LCFAL 2蛋白的分子特性,并對東方蜜蜂微孢子蟲和其他物種的LCFAL 2進行系統(tǒng)進化分析,以期豐富東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL2的基本信息,并為深入開展LCFAL2的功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 LCFAL 2基因的生物信息學分析

根據(jù)前期預(yù)測出的東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL2序列,利用NCBI網(wǎng)站上(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)的ORF工具對LCFAL 2的氨基酸序列進行預(yù)測。通過Expasy網(wǎng)站(https://www.espasy.org/resources)上的Protparam、ProtScale和SWISS-model等軟件分析LCFAL 2的理化性質(zhì)、親水性和三級結(jié)構(gòu)。采用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等軟件預(yù)測信號肽、磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)域及二級結(jié)構(gòu)。通過PSORTⅡ軟件(Sedaghat-Nejadetal., 2021)進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2 LCFAL 2蛋白的保守基序和結(jié)構(gòu)域預(yù)測

使用MEME軟件(Bailey and Elkan, 1994)預(yù)測東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae、蜜蜂微孢子蟲Nosemaapis、東方赤孢子蟲Hamiltosporidiumtvaerminnensis、腸腦炎微孢子蟲Encephalitozoonintestinalis、兔腦炎微孢子蟲Encephalitozooncuniculi、巨蟹腸孢菌Enterosporacanceri、畢氏腸細胞蟲Enterocytozoonbieneusi、煙粉虱Spraguealophii、管孢屬微孢子蟲Tubulinosemaratisbonensis、褶皺臂尾輪蟲Brachionusplicatilis。LCFAL 2的保守基序,參數(shù)為:結(jié)構(gòu)域最小氨基酸殘基數(shù)為 6 aa,結(jié)構(gòu)域最大氨基酸殘基數(shù)為50 aa,不同結(jié)構(gòu)域的數(shù)量為5,其余參數(shù)為默認設(shè)置。通過NCBI Conserved Domains Search (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd)對LCFAL 2蛋白的結(jié)構(gòu)域,再使用TBtools軟件進行分析。

1.3 LCFAL 2蛋白的系統(tǒng)進化分析

采用Blast工具將東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2氨基酸序列比對到GeneBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)以搜索序列相似性較高的其他物種的LCFAL 2。通過Mega 11.0軟件(Tamuraetal., 2021)對東方蜜蜂微孢子蟲和上述其他物種的LCFAL 2構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,選擇默認參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCFAL 2蛋白的分子特性

LCFAL2共含有1 836個核苷酸,可編碼611個氨基酸(MEKRTNKNKFGEISHTNFLENIEC LQNGSKTLLEVFSSTCQKYENKNFLGTIKDNKLIWQT FSEINIKIQKLSTFLNSILQENAIFGIFSVNRYEWIVSE LAGYMSNCINCPLYSTFGPDAVNLIINETEMTVCCVS GDKAESLLDILLSSKKHFLKDIIIFDDDFNRENEFLDL EINVHYISQIFLETEINLRSNKLDLNSLATICYTSGTSG IPKGVQITHKNFIANISAFFRGQTKNEMYRVSDSEVY LSYLPLAHIMERIVVHVITSVGGSIGFYRGNPKKIESD YLIVRPTFIIAVPRVLNIFKQKIEEGVAERGKLSKFIFN IALKIKMWLQCRGSVKCWPLDSLIFNKISNKFGGRIK ACLCGSAALSHNVLTFLKATMSMRIFQGYGQTETTG ATTLCPLDGDNFDNVGIPYPSCKIKLSPVDGHDKYSG ELLVKGDNVTKGYFKRPELNAELFTEDNWLKTGDIA RFYNGVFKIIGRTKDRFKTGHGEYIEPEKIETLLTGGL IQDIIITTLKGYDKLLALVVCEKEGIQEKEVLDYLIKK GNKLVDDKKMNRYEIPSHIILLKKGFDTFDGGKLLSP TAKKIRVKIEKFFYEDIKRALSKK)。LCFAL 2的分子式為C3145H4985N813O904S23,分子量約為69.39 kDa,脂溶系數(shù)為96.82,等電點為8.79。LCFAL 2中含量最高和最低的氨基酸分別為異亮氨酸和色氨酸(表1);包含71個負電荷氨基酸,其中天冬氨酸和谷氨酸分別有30和41個;82個正電荷氨基酸,其中精氨酸和賴氨酸分別有21個和61個(表1)。

表1 LCFAL 2蛋白的氨基酸組成

LCFAL 2的平均親水系數(shù)為-0.161,親水氨基酸數(shù)量比疏水氨基酸多(圖1-A),說明其可能為親水性蛋白。在LCFAL 2中不存在跨膜螺旋域(圖1-B),LCFAL 2中不存在典型的信號肽,說明其可能為胞內(nèi)蛋白(圖1-C)。另外,LCFAL 2含有64個磷酸化位點,包括27個絲氨酸磷酸化位點,14個酪氨酸磷酸化位點及23個蘇氨酸磷酸化位點(圖1-D)。

圖1 LCFAL 2的親水/疏水性(A)、跨膜螺旋域(B)、信號肽(C)和磷酸化位點(D)

LCFAL 2含有240個(39.28%)α-螺旋,124個(20.29%)延長鏈,48個(7.86%)β-轉(zhuǎn)角,199個(32.57%)無規(guī)則卷曲(圖2-A)。LCFAL 2三級結(jié)構(gòu)的模板為5mst.1.A,LCFAL 2與5mst.1.A之間的同源性為21.44%(圖2-B)。此外,預(yù)測LCFAL 2同時定位于細胞質(zhì)、線粒體和細胞核,占比分別為52.20%、21.70%和17.40%。

圖2 LCFAL 2的二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)

2.2 LCFAL 2蛋白的保守基序與結(jié)構(gòu)域分析

在東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL 2中鑒定到 6個保守基序:motif 1, motif 2, motif 3, motif 4, motif 5和motif 6;類似地,在蜜蜂微孢子蟲、東方赤孢子蟲(TBU15843.1)、腸腦炎微孢子蟲、兔腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、畢氏腸細胞蟲、煙粉虱、管孢屬微孢子蟲和褶皺臂尾輪蟲的LCFAL 2蛋白中也鑒定到上述6個保守基序(圖3),說明LCFAL 2在東方蜜蜂微孢子蟲和其他9個物種中高度保守。東方赤孢子蟲(TBU20354.1)中不含保守基序6。此外,東方蜜蜂微孢子蟲、管孢屬微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、煙粉虱、畢氏腸細胞蟲、東方赤孢子蟲、褶皺臂尾輪蟲的LCFAL 2含有AFD_class_I superfamily結(jié)構(gòu)域;在兔腦炎微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲的LCFAL 2含有FAA1結(jié)構(gòu)域。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲和其他9個物種LCFAL 2的保守基序和結(jié)構(gòu)域

2.3 LCFAL 2蛋白的系統(tǒng)進化分析

搜索結(jié)果顯示,東方蜜蜂微孢子蟲含有1個LCFAL 2,蜜蜂微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、腸細胞蟲、煙粉虱、管孢屬微孢子蟲和褶皺臂尾輪蟲也含有1個LCFAL 2,而東方赤孢子蟲和兔腦炎微孢子蟲均含有2個LCFAL 2(表2)。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示,東方蜜蜂微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、兔腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌和畢氏腸細胞蟲的LCFAL 2聚為一個大支,而東方赤孢子蟲、煙粉虱和管孢屬微孢子蟲的LCFAL 2聚為另一個大支(圖4);東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2(XP_024331795.1)與蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2(EQB61677.1)聚為一支,進化距離最近(圖4)。以上結(jié)果說明東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲的LCFAL 2親緣關(guān)系最近,LCFAL 2在不同微孢子蟲中具有較高的保守性。

圖4 鄰接法構(gòu)建基于LCFAL 2的東方蜜蜂微孢子蟲與其他9個物種的系統(tǒng)進化樹

表2 東方蜜蜂微孢子蟲與其他9個物種的LCFAL 2概覽

3 結(jié)論與討論

目前,東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL2研究缺失。本研究中,生物信息學分析結(jié)果顯示,東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL2含有1 836個核苷酸,編碼611個氨基酸,分子式為C3145H4985N813O904S23,分子量約為69.39 kDa,脂溶系數(shù)為96.82,等電點為8.79,說明該氨基酸為堿性氨基酸;平均親水系數(shù)為-0.161,親水氨基酸數(shù)量比疏水氨基酸多(圖1-A),說明LCFAL 2可能為親水性蛋白;不含跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1-B),說明LCFAL 2可能不是跨膜蛋白;不存在典型的信號肽,說明LCFAL 2可能是胞內(nèi)蛋白(圖1-C);主要定位于細胞質(zhì),進一步說明LCFAL 2可能在細胞質(zhì)中發(fā)揮功能。以上結(jié)果豐富了東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL2的基本信息,為進一步開展相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2中含有6個保守基序(motif 1, motif 2, motif 3, motif 4, motif 5和motif 6),上述6個保守基序同樣存在于蜜蜂微孢子蟲、東方赤孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、兔腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、畢氏腸細胞蟲、煙粉虱、管孢屬微孢子蟲和褶皺臂尾輪蟲的LCFAL 2中(圖3),表明LCFAL 2在上述物種中較為保守。此外,在東方蜜蜂微孢子蟲和蜜蜂微孢子蟲等8個物種中均鑒定到AFD_class_I superfamily結(jié)構(gòu)域,表明LCFAL 2在上述8個物種中具有較高的保守性。AFD_class_I superfamily屬于非核糖體肽合成酶A結(jié)構(gòu)域,負責催化ATP形成(李根,2017)。推測東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2具有催化ATP形成的功能,參與能量合成。

東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲是感染蜜蜂的兩種主要微孢子蟲,互為姐妹種(梁勤和陳大福,2009)。本研究中,系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲的LCFAL 2聚為一支,進化距離最近,表明二者的LCFAL 2親緣關(guān)系最近(圖4),符合客觀事實。研究表明LCFAL 2參與真核細胞的增殖、分化和凋亡(Tomodaetal., 1991;Xuetal., 2011)。推測LCFAL 2在東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲侵染蜜蜂宿主的過程中發(fā)揮功能,值得進一步探究。下一步擬建立東方蜜蜂微孢子蟲侵染意大利蜜蜂工蜂或中華蜜蜂Apisceranacerana工蜂的模型(Paldietal., 2010),并通過飼喂特異性dsRNA或siRNA對處于侵染過程的東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL2進行RNAi,以探究LCFAL2的分子功能。