李良斌,武麗仙,許雅靜,3,劉家莉,趙紅霞*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,廣州 510642;2. 廣東省科學(xué)院動物研究所,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室,廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣州 510260;3. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002)

蜂巢小甲蟲Aethinatumida屬鞘翅目Coleoptera露尾甲科Nitidulidae,是一種世界范圍內(nèi)的入侵性害蟲,于2017年入侵我國廣東省,對當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)蜂業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失(張明明等, 2021)。蜂巢小甲蟲成蟲和幼蟲均以蜂蜜和花粉為食,爭奪蜜蜂幼蟲的食物,嚴(yán)重時會導(dǎo)致蜜蜂發(fā)生逃群現(xiàn)象;同時還會導(dǎo)致蜂蜜發(fā)酵,巢脾發(fā)臭等一系列后果,嚴(yán)重影響蜂群健康和蜂產(chǎn)品品質(zhì)(Neumannetal., 2004)。蜂巢小甲蟲的幼蟲在發(fā)育到13～14日齡左右,就會進入游走期,爬出蜂箱,尋找化蛹場所,待羽化為成蟲后繼續(xù)飛回蜂巢內(nèi)產(chǎn)卵(Neumannetal., 2013)。

昆蟲嗅覺系統(tǒng)在許多生理和行為活動中發(fā)揮著重要作用,如尋找合適的寄主、食物來源、產(chǎn)卵地點和交配伙伴(Breer, 2003)。昆蟲的外周嗅覺系統(tǒng)負(fù)責(zé)識別和轉(zhuǎn)運外部的氣味分子,將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電生理信號;中樞神經(jīng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)傳導(dǎo)電生理信號并引起昆蟲的氣味識別反應(yīng)(Britoetal., 2016)。嗅覺系統(tǒng)是一個極其復(fù)雜的通路,涉及多種蛋白質(zhì),包括氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)、氣味受體(odorant receptors, ORs)和感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)(杜亞麗等, 2020)。

OBP是一類小分子水溶性蛋白,大量存在于嗅覺感受器的淋巴液中,承擔(dān)著識別外界氣味物質(zhì)并將其結(jié)合轉(zhuǎn)運到氣味受體OR上的功能(Fanetal., 2011)。最初,在鱗翅目中,OBPs依據(jù)基因功能和氨基酸序列的同源性分類為普通氣味結(jié)合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs)、信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding protein,PBP)和觸角特異性結(jié)合蛋白(antennal binding proteins,ABPs),但是該方法在其他昆蟲中并不適用;根據(jù)OBPs含有保守半胱氨酸(Cys)的數(shù)量可以分為Classical OBPs,Minus-C OBPs,Plus-C OBPs,Dimer OBPs和Atypical OBPs(Rihanietal., 2021)。昆蟲OBP的數(shù)量也大不相同,隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測序的發(fā)展,先后在桔小實蠅Bactroceradorsalis、飛蝗Locustamigratoria和德國小鐮Blattellagermanica等昆蟲中鑒定出多個OBPs(Guoetal., 2018; Liuetal., 2020; Heetal., 2022)。但是目前關(guān)于蜂巢小甲蟲的OBPs研究還相對欠缺,筆者通過搜索蜂巢小甲蟲的基因組數(shù)據(jù)庫和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,并首次克隆得到一個新的OBP基因,將其命名為AtumOBP4,通過qRT-PCR分析了該基因的表達模式,為深入研究AtumOBP4基因在蜂巢小甲蟲嗅覺識別過程中的功能奠定基礎(chǔ),也為以O(shè)BP為分子靶標(biāo)防治蜂巢小甲蟲提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗用蜂巢小甲蟲由廣東省科學(xué)院動物研究所蜜蜂中心人工飼養(yǎng),成蟲和幼蟲均以蜂蜜、茶花花粉1∶2配比混合后的蜂蜜花粉糊飼喂,飼養(yǎng)條件為溫度28±2℃,相對濕度75%～80%,光周期0 L∶24 D(Wuetal., 2021)。

1.2 主要試劑和儀器

Total RNA提取試劑盒RNAex Pro Reagent、cDNA第一鏈合成試劑盒EvoM-MLV RT Mix Kit With gDNA Clean for qPCR、熒光定量試劑盒SYBR Green Priemix Pro Taq HS qPCR Kit等試劑均購于湖南艾科瑞(AG)生物工程有限公司;膠回收試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit購于OMEGA公司;PCR反應(yīng)試劑2×Es Taq MasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;克隆載體pEASY-T3 Cloning Kit、表達感受態(tài)BL21(DE3)和克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1均購于北京全式金生物有限公司;同源重組試劑盒ClonExpress?II One Step Cloning Kit購于Vazyme公司;內(nèi)切酶Not I和EcoR I購于Takara公司;梯度PCR儀和實時熒光定量PCR儀CFX ConnectTMOptics Module由美國BIO-RAD公司生產(chǎn),紫外凝膠成像分析系統(tǒng)由上海天能科技有限公司生產(chǎn),研磨儀CRINDER GT100由北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn),冷凍離心機Sigma 3K15由Sigma公司生產(chǎn),紫外分光光度計由BIONANO由美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

收集蜂巢小甲蟲卵、幼蟲、蛹和雌雄成蟲;解剖蜂巢小甲蟲羽化后第7天的頭部、表皮、鞘翅、足部、脂肪體、腸道、馬氏管、精巢和卵巢共9個組織部位;另外,收集羽化后不同日齡(1～8 d)蜂巢小甲蟲的頭部。每15個樣本作為一個生物學(xué)重復(fù),共設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。將收集的樣本置于液氮中速凍并研磨,參照RNAex Pro Reagent試劑盒說明書提取總RNA。以1 μg RNA為模板參照EvoM-MLV RT Mix Kit With gDNA Clean for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,-20℃保存。

1.4 AtumOBP4基因的克隆

搜索蜂巢小甲蟲轉(zhuǎn)錄組(Wuetal., 2021)和基因組數(shù)據(jù)庫(Evansetal., 2018)得到蜂巢小甲蟲OBP序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)。以文中1.3部分合成的第7天蜂巢小甲蟲頭部cDNA為模板,克隆蜂巢小甲蟲OBP基因的開放閱讀框序列。PCR反應(yīng)體系(50 μL):PCR Mixture 25 μL,cDNA模板1.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性1 min;98℃變性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證,并將符合預(yù)期大小的目的片段純化,并連接到pEASY-T3載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,37℃培養(yǎng)12 h,菌液PCR驗證后,挑選3管送生工生物測序。

表1 本試驗所用引物

1.5 AtumOBP4基因的序列分析

將克隆測序得到的蜂巢小甲蟲OBP序列在NCBI中用Blastn(http://blast. ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)工具進行核酸序列的同源性分析;利用在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找序列的開放閱讀框,用DNAMAN軟件預(yù)測其編碼的氨基酸序列。運用在線工具NCBI Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析保守結(jié)構(gòu)域;運用在線工具TMHMM-2.0對AtumOBP4進行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測,利用在線網(wǎng)址Swiss-model為模板進行AtumOBP4三維結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用NCBI在線工具Constraint-based Multiple Alignment(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi)進行氨基酸多序列比對,采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootrap為1 000次。

1.6 AtumOBP4的時空表達

以文中1.3部分中得到的cDNA為模板,選取GAPDH作為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 5.0設(shè)計定量引物(表1),委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。使用SYBR Green Priemix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系(20 μL):cDNA模板3 μL,SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL,上下游引物各0.8 μL,ddH2O 5.4 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火及延伸30 s,40個循環(huán);生成溶解曲線的程序為65℃ 5 s,95℃ 5 s。每個反應(yīng)均進行3次生物學(xué)重復(fù)和2次技術(shù)重復(fù)。

1.7 AtumOBP4的原核表達

根據(jù)基因AtumOBP4和表達載體pET-32a(+)的序列,設(shè)計帶有NotⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點的特異性引物(表1)。以文中1.4中測序正確的菌液為模板,使用2×Es Taq MasterMix DNA聚合酶進行擴增,產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后測濃度置于-20℃冰箱備用。將表達載體pET-32a(+)用NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)酶切成功后回收備用。參照ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit說明書將雙酶切的pET-32a(+)載體與回收的目的片段進行同源重組,并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后菌液涂布在含有100 μg/mL氨芐的LB固體培養(yǎng)基平板中,37℃倒置培養(yǎng)16 h。挑取平板中大小適中的菌落到1.5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐100 μg/mL),37℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)2 h。菌液PCR擴增后經(jīng)電泳檢測后,挑取目的片段范圍內(nèi)的菌液送生工生物測序。

將測序正確的菌液擴大培養(yǎng),通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,將提取的pET-32a(+)/AtumOBP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21表達感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化后菌液涂布在含有100 μg/mL氨芐的LB固體培養(yǎng)基平板中,37℃倒置培養(yǎng)16 h。挑取平板中大小適中的菌落到8 mL LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐100 μg/mL),37℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)2 h。以1%的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液接入100 mL的LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐100 μg/mL),37℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.7時,加入IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導(dǎo)表達,25℃ 200 rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12～16 h。收集菌體,超聲波破碎及分離上清及包涵體。使用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況及表達形式。

1.8 數(shù)據(jù)分析

通過Bio-Rad CFX Maestro 1.1軟件對熒光定量的結(jié)果進行分析,采集目的基因和內(nèi)參基因Ct值,用2-△△Ct相對定量法求得基因的相對表達量(Schmittgen, 2001)。使用SPSS 19.0軟件進行Tukey’s(HSD)單因素方差分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示,通過GraphPad Prism 8.0軟件進行圖形分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆及序列分析

克隆獲得了一個新的蜂巢小甲蟲氣味結(jié)合蛋白基因,命名為AtumOBP4(GeBank登錄號: ON813082)(圖1)。基因AtumOBP4開放閱讀框全長465 bp,編碼154個氨基酸,預(yù)測其分子量大小為17.4 kDa,理論等電點為5.07。SignalP-4.1在線預(yù)測該蛋白N末端的前23個氨基酸為信號肽序列(圖2);跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明該蛋白不是跨膜蛋白;NCBI Conserved Domains對蛋白AtumOBP4的保守結(jié)構(gòu)域分析表明它在第27～142位氨基酸具有PBP-GOBP superfamily家族的保守結(jié)構(gòu)域。

圖1 AtumOBP4基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 AtumOBP4核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 氨基酸序列對比及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI中的Blastp對AtumOBP4進行同源性搜索,發(fā)現(xiàn)其與鞘翅目昆蟲的OBP同源性較高,將AtumOBP4與其它9個鞘翅目昆蟲OBPs進行序列對比發(fā)現(xiàn),這些序列都具有6個典型的半胱氨酸殘基,且分布方式為符合Classical-OBP家族 6個保守的半胱氨酸位點結(jié)構(gòu)模型:C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4- X8-14-C5-X8-C6(圖3)。

圖3 AtumOBP4與其他鞘翅目昆蟲OBP的序列比對

將以上序列通過MEAG 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果顯示AtumOBP4與TmolOBP8聚在同一支上,表明蜂巢小甲蟲與黃粉蟲可能有相同的基因起源(圖4)。

圖4 AtumOBP4與其他鞘翅目昆蟲OBP的系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)

2.3 AtumOBP4的時空表達

以成蟲足部的基因AtumOBP4表達量為基準(zhǔn),通過qRT-PCR分析基因AtumOBP4在蜂巢小甲蟲不同組織、不同發(fā)育階段(整蟲)以及羽化后不同日齡頭部的表達情況。結(jié)果顯示在蜂巢小甲蟲的卵期、幼蟲期、蛹期、雄性成蟲和雌性成蟲中,基因AtumOBP4均有表達;在雄性成蟲中的表達量最高,顯著高于卵期、蛹期和雌性成蟲中的表達(P<0.05),雄性成蟲的表達量是雌性成蟲的8.21倍(圖5-A)。AtumOBP4在蜂巢小甲蟲的頭(包含觸角)、翅、足、表皮、脂肪體、腸道、馬氏管、精巢和卵巢中均有表達,但表達量各有差異。頭部(包含觸角)的表達量最高,極顯著高于其他組織(P<0.001),脂肪體的表達量僅次于頭部,但與其它組織并無顯著性差異(圖5-B)。在蜂巢小甲蟲羽化后的第1～7天,AtumOBP4呈總體上升的趨勢,在第7天達到最高,第8天開始下降(圖5-C)。

圖5 AtumOBP4在蜂巢小甲蟲不同發(fā)育階段(A)、成蟲不同組織部位(B)和羽化后成蟲不同日齡頭部(C)的表達分析

2.4 AtumOBP4原核表達

將生工生物測序正確的pET-32a(+)/AtumOBP4的原核表達載體,轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中進行誘導(dǎo)表達。經(jīng)過條件優(yōu)化,在菌液OD600≈0.7時,加入IPTG(終濃度1 mmol/L),25℃,200 r/min誘導(dǎo)12 h后,大量表達,超聲破碎對上清和包涵體進行分離,用SDS-PAGE電泳檢測,目的蛋白主要在包涵體中大量表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示,含有His-tag的重組蛋白分子量約在35 kDa,與預(yù)測的重組蛋白大小一致(圖6)。

圖6 AtumOBP4蛋白誘導(dǎo)表達

3 結(jié)論與討論

氣味結(jié)合蛋白OBPs在昆蟲的嗅覺識別系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用,對于昆蟲覓食、尋找合適的產(chǎn)卵地以及交配等行為具有重要的意義(Leal, 2012)。隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展,越來越多昆蟲的OBPs被鑒定出來,前期研究中筆者所在團隊通過轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)分析鑒定出29個蜂巢小甲蟲OBPs(Wuetal., 2021)。本研究克隆出一個新的蜂巢小甲蟲氣味結(jié)合蛋白基因AtumOBP4,開放閱讀框序列全長465 bp,編碼154個氨基酸,預(yù)測其分子量大小為17.4 kDa,含有6個保守的半胱氨酸位點,從屬于典型的OBPs家族。進化樹結(jié)果表明AtumOBP4與黃粉蟲TmolOBP8的聚在同一分支,表明它們在進化關(guān)系上同源關(guān)系更近,可能發(fā)揮類似的普通氣味結(jié)合蛋白的功能,負(fù)責(zé)識別一般氣味(Liuetal., 2015)。

研究表明,觸角高表達的OBPs往往在昆蟲的嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用(張雪等, 2021)。例如在美洲斑潛蠅Liriomyzasativae觸角特異性高表達的LsatOBP13參與對寄主綠葉植物中大量存在的氣味物質(zhì)的識別過程,在美洲斑潛蠅嗅覺識別、寄主植物定位中發(fā)揮功能(陳東凱等, 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)AtumOBP4在蜂巢小甲蟲頭部(包含觸角)特異性高表達,與上述研究相符,表明AtumOBP4可能是參與蜂巢小甲蟲多種嗅覺識別的重要蛋白。OBPs除了參與嗅覺識別外,還可能在昆蟲的其它組織參與各種生理活動,例如參與卵膜形成、味覺識別和營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)?意味著OBPs也在昆蟲的各種組織部位表達(Costa-da-Silvaetal., 2013; 張方梅等, 2019)。AtumOBP4基因在蜂巢小甲蟲的翅、足、表皮、腸道、脂肪體、馬氏管、精巢和卵巢等組織中均有一定的表達量;在馬氏管、腸道的表達量要略高于其它組織,暗示著AtumOBP4可能在消化系統(tǒng)中發(fā)揮一定的作用,類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在伏蠅Phormiaregina和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera等昆蟲(張帥等, 2012; Ishidaetal., 2013)。本研究還發(fā)現(xiàn)AtumOBP4在蜂巢小甲蟲的不同發(fā)育階段均有表達,幼蟲期的表達量高于卵期和蛹期,可能與蜂巢小甲蟲幼蟲相較于卵和蛹存在更豐富的取食行為與更廣泛的活動范圍有關(guān)。OBP基因在雌雄成蟲中普遍存在偏向表達,如綠豆象Callosobruchuschinensis雄成蟲各組織中CchiOBP1的表達量顯著高于雌成蟲的,推測該基因可能在雌雄之間交配時,或是與寄主互作的過程中發(fā)揮重要作用(王宏民等, 2021);韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga雌性高表達的BodoOBP5在識別寄主揮發(fā)物和性信息素中發(fā)揮重要功能(Yangetal., 2021)。本研究中,雄性成蟲中AtumOBP4的表達量明顯高于雌性成蟲,這可能與蜂巢小甲蟲的交配行為相關(guān),事實上蜂巢小甲蟲不僅存在雌雄交配,還存在嘗試性雄雄交配行為(Neumannetal., 2008; Mustafaetal., 2015)。在羽化后不同天數(shù)頭部表達譜分析表明,AtumOBP4在羽化后的1～7天內(nèi)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,第5～7天呈現(xiàn)穩(wěn)定的較高水平表達,在第7天達到最高,第8天開始降低。蜂巢小甲蟲在羽化后的5～7天性成熟,開始尋找配偶和寄主蜂箱(Neumannetal., 2016)。頭部是昆蟲感覺和取食的中心,在其表面分布著大量的嗅覺感受器(Matsuoetal., 2007)。因此推測在蜂巢小甲蟲羽化后第7天頭部高度表達的AtumOBP4參與了性信息素和蜂巢相關(guān)氣味的嗅覺識別過程。

OBPs作為嗅覺結(jié)合蛋白,最重要的功能是在嗅覺系統(tǒng)中結(jié)合轉(zhuǎn)運氣味和信息素分子;OBPs為球狀結(jié)構(gòu),親水性氨基酸分布于蛋白表面,使它們具有強水溶性,疏水性氨基酸在內(nèi)部形成空腔,用于結(jié)合配基(吳帆等, 2021)。因此進一步研究氣味結(jié)合蛋白的功能需要通過表達蛋白來實現(xiàn),本研究成功的建立了基因AtumOBP4原核表達體系,并成功在包涵體中表達出AtumOBP4蛋白,與Li等(2021)的研究結(jié)果一致,可用于下一步的熒光競爭結(jié)合研究,并通過RNAi技術(shù)來進行功能驗證。