譚 超, 王 洋, 蘇建楠, 趙建軍

據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年新發(fā)腎癌患者數(shù)約為43萬(wàn)例,死亡18萬(wàn)例,分別占全部惡性腫瘤的2.2%和1.8%[1]。我國(guó)腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)患者約占所有腎癌的90%,其惡性程度高、治療難度大,且目前缺乏評(píng)估ccRCC的有效生物標(biāo)志物[2]。微小RNA(microRNA)在腫瘤組織和外周血中表達(dá)均可被檢測(cè),并且靈敏度和準(zhǔn)確度較高,有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值[3]。有研究表明,miR-630在食管癌組織中顯著降低并與高TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)[4]。但也有研究表明miR-630在喉癌組織中顯著升高,且可下調(diào)細(xì)胞凋亡[5]。miR-630異常上調(diào)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H1299、HCC827和NCI-H2170K562中原癌基因的表達(dá)[6]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B cell lymphoma leukemia-2,Bcl2)蛋白作為一種調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要蛋白,在維持細(xì)胞分化、發(fā)育及增殖的動(dòng)態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用[7]。caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白,其能夠直接降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,引起細(xì)胞凋亡[8]。目前關(guān)于miR-630在ccRCC中的臨床意義及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響仍不清楚,本文就此展開研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年7月至2021年7月河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院收治的ccRCC患者86例,年齡41～74歲,術(shù)中取腫瘤組織和癌旁正常組織(距癌灶邊緣>5 cm),并經(jīng)過(guò)病理檢查確認(rèn),-80 ℃保存?zhèn)錂z。本研究獲河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):2019[K]020),患者知情同意參與。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)穿刺活檢或術(shù)后病理學(xué)檢查確診為ccRCC;(2)初診,未接受放化療;(3)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他類型原發(fā)性惡性腫瘤;(2)腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移;(3)合并其他類型免疫學(xué)、感染或者泌尿系統(tǒng)疾病。

1.3主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器 人ccRCC細(xì)胞系786-O購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和抗體購(gòu)自Invitrogen公司。miR-630 mimic、miR-630 inhibitor和miR-630 NC購(gòu)自GenePharma公司。EntransterTM-R4000購(gòu)自Engreen公司。RNAspin Mini購(gòu)自GE Healthcare。BestarTMqPCR購(gòu)自DBI Bioscience公司。caspase-3、Bcl2一抗以及山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。硝酸纖維素膜購(gòu)自美國(guó)EMD Millipore公司。ECL試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司。凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sanjian生物。BD FACSCalibu流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司。HBS-1101酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 786-O細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。本研究設(shè)計(jì)miR-630 NC組、miR-630 mimic組和miR-630 inhibitor組(分別為miR-630的對(duì)照、過(guò)表達(dá)和抑制組)。根據(jù)組別分別轉(zhuǎn)染miR-630 NC、miR-630 mimic以及miR-630 inhibitor。將50 pmol(0.67 μg)的miR-630 NC、miR-630 mimic以及miR-630 inhibitor稀釋于25 μl的DMEM中作為試劑A,然后將1 μl的EntransterTM-R4000和24 μl的DMEM混合25 min作為試劑B。將25 μl試劑A和25 μl試劑B充分混勻,靜置15 min后作為轉(zhuǎn)染復(fù)合物使用。將50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含0.45 ml完全培養(yǎng)基的786-O細(xì)胞中,37 ℃、5% CO2下孵育36 h后收集細(xì)胞。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法測(cè)定miR-630水平 使用RNeasy Mini提取標(biāo)本組織或者細(xì)胞中的總RNA,然后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件:37 ℃,15 min;98 ℃,5 min。使用BestarTMRT-qPCR預(yù)混液進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn),反應(yīng)條件:95 ℃,2 min;94 ℃,20 s;58 ℃,20 s;72 ℃,20 s;40個(gè)循環(huán),最后在72 ℃下延伸4 min。miR-630引物:上游5′-AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU-3′,下游5′-CUUCCCUGGUACAGAAUACUUU-3′。U6引物:上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR。以U6為內(nèi)參,通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算miR-630的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6Western blot法檢測(cè)caspase-3和Bcl2蛋白表達(dá)水平 應(yīng)用100 μl裂解液體+1 μl蛋白酶抑制劑+1 μl PMSF裂解標(biāo)本組織或細(xì)胞獲得蛋白樣品,離心(4 ℃,12 000 r/min,5 min)后,將上清液收集到另一個(gè)1.5 ml的EP管中。使用2.5 μl樣品和22.5 μl超純水通過(guò)BCA測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)8%的SDS-PAGE電泳分離每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì),通過(guò)電轉(zhuǎn)方式(50 V,100～170 mA,3 h)將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h進(jìn)行封閉處理。隨后,將膜與1∶500稀釋的一抗液在4 ℃下孵育過(guò)夜。洗膜后將膜與1∶2 000稀釋的二抗液在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑顯影,以GAPDH為內(nèi)參,使用Quantum One軟件分析caspase-3和Bcl2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取各組100 μl細(xì)胞懸液(5×104cells/ml)種植到96孔板中。培養(yǎng)24 h、48 h后,加入10 μl的CCK-8溶液。將96孔板在軌道搖床上輕混搖1 min。繼續(xù)孵育2 h,應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔光密度值(OD值)。細(xì)胞增殖率(%)=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后離心,收集細(xì)胞,計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞重懸于500 μl Binding Buffer中。然后分別加入5 μl的Annexin V-FITC和PI用于標(biāo)記凋亡細(xì)胞,避光孵育15 min。在完成染色后30 min內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1miR-630在ccRCC中的表達(dá)特點(diǎn)和臨床意義 miR-630在ccRCC組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織[(3.85±0.46)vs(0.74±0.11);t=24.065,P<0.001]。以ccRCC組織中miR-630的中位數(shù)將ccRCC患者分為miR-630高表達(dá)組(>3.68,44例)和miR-630低表達(dá)組(≤3.68,42例)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示,miR-630高表達(dá)組腫瘤直徑≥4 cm、臨床分期為Ⅲ/Ⅳ以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的人數(shù)比例較miR-630低表達(dá)組更大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-630表達(dá)水平與性別和年齡未顯示出顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表1。

表1 ccRCC組織miR-630表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[n(%)]

2.2ccRCC組織和癌旁正常組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 ccRCC組織中caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織(t=8.872,P<0.001),Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(t=9.183,P<0.001)。見圖1。

圖1 ccRCC組織和癌旁正常組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較圖(*P<0.05)

2.3ccRCC組織miR-630表達(dá)水平與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miR-630表達(dá)水平與caspase-3蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.489,P=0.011),與Bcl2蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.516,P=0.004)。

2.4miR-630過(guò)表達(dá)/抑制細(xì)胞模型構(gòu)建結(jié)果 miR-630 mimic組的miR-630表達(dá)水平顯著高于miR-630 NC組(P<0.05),miR-630 inhibitor組的miR-630表達(dá)水平顯著低于miR-630 NC組(P<0.05)。提示miR-630過(guò)表達(dá)/抑制細(xì)胞模型成功構(gòu)建。見圖2。

注:F=20.182,P<0.001;與miR-630 NC組比較,*P<0.05

2.5miR-630表達(dá)對(duì)786-O細(xì)胞增殖活力的影響 與miR-630 NC組比較,miR-630 mimic組786-O細(xì)胞增殖活力顯著提高(P<0.05),而miR-630 inhibitor組細(xì)胞增殖活力水平被顯著抑制(P<0.05)。見表2。

表2 三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h后的相對(duì)增殖率比較

2.6miR-630表達(dá)對(duì)786-O細(xì)胞凋亡率的影響 miR-630 mimic組的細(xì)胞凋亡率顯著低于miR-630 NC組(P<0.05),miR-630 inhibitor組的細(xì)胞凋亡率顯著高于miR-630 NC組(P<0.05)。三組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.245,P<0.001)。見圖3。

注:與miR-630 NC組比較,*P<0.05

2.7miR-630表達(dá)對(duì)786-O細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平的影響 與miR-630 NC組比較,miR-630 mimic組caspase-3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);miR-630 inhibitor組caspase-3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。三組caspase-3表達(dá)水平及Bcl2蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F=33.045,P<0.001;F=38.158,P<0.001]。見圖4。

注:與miR-630 NC組比較,*P<0.05

3 討論

3.1ccRCC是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,盡管局部ccRCC可以通過(guò)腎臟消融術(shù)治療,但晚期或轉(zhuǎn)移性ccRCC患者的5年生存率仍低于20%[9]。由于ccRCC患者在疾病早期缺乏有效的診斷方法,極大影響臨床醫(yī)師對(duì)疾病預(yù)后的判斷及治療方法的選擇,因此亟需探索適用于ccRCC早期診斷和轉(zhuǎn)移檢測(cè)的新型生物標(biāo)志物。

3.2miRNA在轉(zhuǎn)錄后的表觀遺傳機(jī)制中發(fā)揮作用[10]。首先,miRNA在細(xì)胞核中被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的序列(pri-miRNA),然后經(jīng)RNA核酶與其輔因子結(jié)合切割成70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的序列(pre-miRNA),成熟的miRNA雙鏈體會(huì)被RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Dicer加工[11]。組成miRNA雙鏈體的兩條鏈表示為-3p和-5p。miRNA的作用機(jī)制取決于它們與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)互補(bǔ)序列結(jié)合的能力,通過(guò)降低mRNA的穩(wěn)定性和(或)抑制翻譯來(lái)調(diào)節(jié)它們的表達(dá),miRNA和靶mRNA之間完全或部分配對(duì)可分別導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯基因的降解或抑制[12]。miRNA對(duì)許多生物過(guò)程相關(guān)參與蛋白的基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)向影響,從而調(diào)控增殖、凋亡、遷移和分化等生物學(xué)過(guò)程[13]。目前,大量的研究證據(jù)表明miRNA既可以作為促癌因子也可以作為抑癌因子,且研究認(rèn)為miRNA是腫瘤發(fā)生的主要標(biāo)志物之一,并可能成為包括ccRCC在內(nèi)多種腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物[14]。

3.3miR-630是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA,但是其在不同類型腫瘤中的作用可能相反[15]。miR-630在一些腫瘤中表現(xiàn)出抑癌因子的作用。Junior等[16]研究顯示,與正常組織相比,原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織miR-630表達(dá)水平降低,并且miR-630過(guò)表達(dá)與U87細(xì)胞增殖和侵襲水平降低有關(guān)。Pan等[17]的研究結(jié)果顯示,miR-630通過(guò)抑制Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路來(lái)抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。也有臨床研究表明miR-630在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào),其與臨床分期及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),并認(rèn)為miR-630是骨肉瘤患者總存活率的獨(dú)立影響指標(biāo)[18]。但是,也有研究發(fā)現(xiàn)miR-630具有促癌作用。一項(xiàng)臨床研究表明,骨肉瘤組織中miR-630顯著高于癌旁非腫瘤組織,并且高水平的miR-630與患者較差的新輔助化療效果、較短的無(wú)進(jìn)展生存期密切相關(guān)[19]。Cui等[20]的研究表明卵巢癌細(xì)胞衍生的外泌體中攜帶大量的miR-630,而miR-630則會(huì)促進(jìn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞活化,進(jìn)而為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和定植提供有利微環(huán)境。本研究結(jié)果顯示,ccRCC組織中miR-630表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,進(jìn)一步根據(jù)miR-630的表達(dá)水平中位數(shù)將ccRCC患者分為miR-630高表達(dá)組和低表達(dá)組。分析結(jié)果顯示,miR-630表達(dá)水平與性別、年齡無(wú)顯著關(guān)聯(lián),高水平的miR-630與更大的腫瘤直徑、高臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3.4ccRCC細(xì)胞凋亡水平顯著低于正常腎組織細(xì)胞。凋亡抑制是引起ccRCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的主要?jiǎng)恿χ籟21]。caspase-3是腫瘤細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白,也是調(diào)控ccRCC細(xì)胞凋亡的主要功能蛋白[22]。Bcl2是抗凋亡蛋白,具有抑制caspase-3蛋白功能的作用,從而抑制細(xì)胞凋亡[23]。本研究結(jié)果表明,與癌旁正常組織相比,ccRCC組織中caspase-3表達(dá)下調(diào),而Bcl2表達(dá)上調(diào),且ccRCC組織中miR-630表達(dá)水平與caspase-3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),與Bcl2表達(dá)水平呈正相關(guān)。提示miR-630可能通過(guò)抑制凋亡促進(jìn)ccRCC進(jìn)展。本研究結(jié)果也顯示當(dāng)miR-630水平升高后,細(xì)胞增殖活力升高而凋亡率降低,抑制miR-630表達(dá)則可得到相反的結(jié)果。有報(bào)道顯示miR-630可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[24]。也有研究顯示降低miR-630的表達(dá)可增強(qiáng)化療耐藥卵巢癌細(xì)胞的凋亡,提高化療敏感性[25]。綜合上述結(jié)果,筆者認(rèn)為高水平的miR-630在ccRCC中起到抗凋亡作用,從而促進(jìn)ccRCC進(jìn)展。

綜上所述,miR-630在ccRCC組織中表達(dá)上調(diào),并發(fā)揮抑制凋亡的作用,其與ccRCC患者的高臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。關(guān)于miR-630與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系值得擴(kuò)大臨床樣本量,通過(guò)前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。