譚 超, 王 洋, 蘇建楠, 趙建軍

據(jù)統(tǒng)計,全球每年新發(fā)腎癌患者數(shù)約為43萬例,死亡18萬例,分別占全部惡性腫瘤的2.2%和1.8%[1]。我國腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)患者約占所有腎癌的90%,其惡性程度高、治療難度大,且目前缺乏評估ccRCC的有效生物標志物[2]。微小RNA(microRNA)在腫瘤組織和外周血中表達均可被檢測,并且靈敏度和準確度較高,有較好的臨床應用價值[3]。有研究表明,miR-630在食管癌組織中顯著降低并與高TNM分期、腫瘤轉移及不良預后有關[4]。但也有研究表明miR-630在喉癌組織中顯著升高,且可下調細胞凋亡[5]。miR-630異常上調可促進肺癌細胞株A549、NCI-H1299、HCC827和NCI-H2170K562中原癌基因的表達[6]。B淋巴細胞瘤-2基因(B cell lymphoma leukemia-2,Bcl2)蛋白作為一種調控細胞凋亡的重要蛋白,在維持細胞分化、發(fā)育及增殖的動態(tài)平衡中起著關鍵作用[7]。caspase-3是細胞凋亡的關鍵蛋白,其能夠直接降解細胞內(nèi)的結構蛋白和功能蛋白,引起細胞凋亡[8]。目前關于miR-630在ccRCC中的臨床意義及其對細胞凋亡的影響仍不清楚,本文就此展開研究,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年7月至2021年7月河北工程大學附屬醫(yī)院收治的ccRCC患者86例,年齡41～74歲,術中取腫瘤組織和癌旁正常組織(距癌灶邊緣>5 cm),并經(jīng)過病理檢查確認,-80 ℃保存?zhèn)錂z。本研究獲河北工程大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批號:2019[K]020),患者知情同意參與。

1.2納入與排除標準 納入標準:(1)經(jīng)穿刺活檢或術后病理學檢查確診為ccRCC;(2)初診,未接受放化療;(3)臨床病理資料完整。排除標準:(1)合并其他類型原發(fā)性惡性腫瘤;(2)腫瘤已發(fā)生轉移;(3)合并其他類型免疫學、感染或者泌尿系統(tǒng)疾病。

1.3主要實驗材料和儀器 人ccRCC細胞系786-O購自美國細胞培養(yǎng)物收藏中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和抗體購自Invitrogen公司。miR-630 mimic、miR-630 inhibitor和miR-630 NC購自GenePharma公司。EntransterTM-R4000購自Engreen公司。RNAspin Mini購自GE Healthcare。BestarTMqPCR購自DBI Bioscience公司。caspase-3、Bcl2一抗以及山羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司。硝酸纖維素膜購自美國EMD Millipore公司。ECL試劑盒購自Thermo Fisher公司。凋亡檢測試劑盒購自Sanjian生物。BD FACSCalibu流式細胞儀購自BD公司。HBS-1101酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司。

1.4細胞分組和轉染 786-O細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設置為37 ℃、5% CO2。本研究設計miR-630 NC組、miR-630 mimic組和miR-630 inhibitor組(分別為miR-630的對照、過表達和抑制組)。根據(jù)組別分別轉染miR-630 NC、miR-630 mimic以及miR-630 inhibitor。將50 pmol(0.67 μg)的miR-630 NC、miR-630 mimic以及miR-630 inhibitor稀釋于25 μl的DMEM中作為試劑A,然后將1 μl的EntransterTM-R4000和24 μl的DMEM混合25 min作為試劑B。將25 μl試劑A和25 μl試劑B充分混勻,靜置15 min后作為轉染復合物使用。將50 μl轉染復合物加入到含0.45 ml完全培養(yǎng)基的786-O細胞中,37 ℃、5% CO2下孵育36 h后收集細胞。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法測定miR-630水平 使用RNeasy Mini提取標本組織或者細胞中的總RNA,然后將其逆轉錄為cDNA,反應條件:37 ℃,15 min;98 ℃,5 min。使用BestarTMRT-qPCR預混液進行RT-qPCR實驗,反應條件:95 ℃,2 min;94 ℃,20 s;58 ℃,20 s;72 ℃,20 s;40個循環(huán),最后在72 ℃下延伸4 min。miR-630引物:上游5′-AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU-3′,下游5′-CUUCCCUGGUACAGAAUACUUU-3′。U6引物:上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR。以U6為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計算miR-630的相對表達水平。

1.6Western blot法檢測caspase-3和Bcl2蛋白表達水平 應用100 μl裂解液體+1 μl蛋白酶抑制劑+1 μl PMSF裂解標本組織或細胞獲得蛋白樣品,離心(4 ℃,12 000 r/min,5 min)后,將上清液收集到另一個1.5 ml的EP管中。使用2.5 μl樣品和22.5 μl超純水通過BCA測量蛋白質濃度。通過8%的SDS-PAGE電泳分離每個樣品中的蛋白質,通過電轉方式(50 V,100～170 mA,3 h)將其轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h進行封閉處理。隨后,將膜與1∶500稀釋的一抗液在4 ℃下孵育過夜。洗膜后將膜與1∶2 000稀釋的二抗液在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑顯影,以GAPDH為內(nèi)參,使用Quantum One軟件分析caspase-3和Bcl2蛋白的相對表達量。

1.7CCK-8法檢測細胞增殖率 取各組100 μl細胞懸液(5×104cells/ml)種植到96孔板中。培養(yǎng)24 h、48 h后,加入10 μl的CCK-8溶液。將96孔板在軌道搖床上輕混搖1 min。繼續(xù)孵育2 h,應用酶標儀于450 nm波長下測量各孔光密度值(OD值)。細胞增殖率(%)=[(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組細胞用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后離心,收集細胞,計數(shù)5×105個細胞重懸于500 μl Binding Buffer中。然后分別加入5 μl的Annexin V-FITC和PI用于標記凋亡細胞,避光孵育15 min。在完成染色后30 min內(nèi)使用流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1miR-630在ccRCC中的表達特點和臨床意義 miR-630在ccRCC組織中的相對表達量顯著高于癌旁正常組織[(3.85±0.46)vs(0.74±0.11);t=24.065,P<0.001]。以ccRCC組織中miR-630的中位數(shù)將ccRCC患者分為miR-630高表達組(>3.68,44例)和miR-630低表達組(≤3.68,42例)。進一步分析結果顯示,miR-630高表達組腫瘤直徑≥4 cm、臨床分期為Ⅲ/Ⅳ以及有淋巴結轉移的人數(shù)比例較miR-630低表達組更大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-630表達水平與性別和年齡未顯示出顯著關聯(lián)(P>0.05)。見表1。

表1 ccRCC組織miR-630表達水平與患者臨床病理特征的關聯(lián)性分析結果[n(%)]

2.2ccRCC組織和癌旁正常組織凋亡相關蛋白表達水平比較 ccRCC組織中caspase-3蛋白表達水平顯著低于癌旁正常組織(t=8.872,P<0.001),Bcl2蛋白表達水平顯著高于癌旁正常組織(t=9.183,P<0.001)。見圖1。

圖1 ccRCC組織和癌旁正常組織凋亡相關蛋白表達水平比較圖(*P<0.05)

2.3ccRCC組織miR-630表達水平與凋亡相關蛋白表達水平的相關性分析結果 Pearson相關性分析結果顯示,miR-630表達水平與caspase-3蛋白表達水平呈負相關(r=-0.489,P=0.011),與Bcl2蛋白表達水平呈正相關(r=0.516,P=0.004)。

2.4miR-630過表達/抑制細胞模型構建結果 miR-630 mimic組的miR-630表達水平顯著高于miR-630 NC組(P<0.05),miR-630 inhibitor組的miR-630表達水平顯著低于miR-630 NC組(P<0.05)。提示miR-630過表達/抑制細胞模型成功構建。見圖2。

注:F=20.182,P<0.001;與miR-630 NC組比較,*P<0.05

2.5miR-630表達對786-O細胞增殖活力的影響 與miR-630 NC組比較,miR-630 mimic組786-O細胞增殖活力顯著提高(P<0.05),而miR-630 inhibitor組細胞增殖活力水平被顯著抑制(P<0.05)。見表2。

表2 三組細胞培養(yǎng)24 h、48 h后的相對增殖率比較

2.6miR-630表達對786-O細胞凋亡率的影響 miR-630 mimic組的細胞凋亡率顯著低于miR-630 NC組(P<0.05),miR-630 inhibitor組的細胞凋亡率顯著高于miR-630 NC組(P<0.05)。三組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=22.245,P<0.001)。見圖3。

注:與miR-630 NC組比較,*P<0.05

2.7miR-630表達對786-O細胞凋亡蛋白表達水平的影響 與miR-630 NC組比較,miR-630 mimic組caspase-3表達水平顯著降低(P<0.05),Bcl2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);miR-630 inhibitor組caspase-3表達水平顯著升高(P<0.05),Bcl2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。三組caspase-3表達水平及Bcl2蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義[F=33.045,P<0.001;F=38.158,P<0.001]。見圖4。

注:與miR-630 NC組比較,*P<0.05

3 討論

3.1ccRCC是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,盡管局部ccRCC可以通過腎臟消融術治療,但晚期或轉移性ccRCC患者的5年生存率仍低于20%[9]。由于ccRCC患者在疾病早期缺乏有效的診斷方法,極大影響臨床醫(yī)師對疾病預后的判斷及治療方法的選擇,因此亟需探索適用于ccRCC早期診斷和轉移檢測的新型生物標志物。

3.2miRNA在轉錄后的表觀遺傳機制中發(fā)揮作用[10]。首先,miRNA在細胞核中被RNA聚合酶Ⅱ轉錄為長度為幾百個核苷酸的序列(pri-miRNA),然后經(jīng)RNA核酶與其輔因子結合切割成70個核苷酸長度的序列(pre-miRNA),成熟的miRNA雙鏈體會被RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Dicer加工[11]。組成miRNA雙鏈體的兩條鏈表示為-3p和-5p。miRNA的作用機制取決于它們與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)互補序列結合的能力,通過降低mRNA的穩(wěn)定性和(或)抑制翻譯來調節(jié)它們的表達,miRNA和靶mRNA之間完全或部分配對可分別導致蛋白質翻譯基因的降解或抑制[12]。miRNA對許多生物過程相關參與蛋白的基因表達產(chǎn)生負向影響,從而調控增殖、凋亡、遷移和分化等生物學過程[13]。目前,大量的研究證據(jù)表明miRNA既可以作為促癌因子也可以作為抑癌因子,且研究認為miRNA是腫瘤發(fā)生的主要標志物之一,并可能成為包括ccRCC在內(nèi)多種腫瘤診斷和預后評估的生物標志物[14]。

3.3miR-630是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關miRNA,但是其在不同類型腫瘤中的作用可能相反[15]。miR-630在一些腫瘤中表現(xiàn)出抑癌因子的作用。Junior等[16]研究顯示,與正常組織相比,原發(fā)性膠質母細胞瘤組織miR-630表達水平降低,并且miR-630過表達與U87細胞增殖和侵襲水平降低有關。Pan等[17]的研究結果顯示,miR-630通過抑制Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信號轉導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路來抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞生長和轉移。也有臨床研究表明miR-630在骨肉瘤組織中表達下調,其與臨床分期及腫瘤遠處轉移有關,并認為miR-630是骨肉瘤患者總存活率的獨立影響指標[18]。但是,也有研究發(fā)現(xiàn)miR-630具有促癌作用。一項臨床研究表明,骨肉瘤組織中miR-630顯著高于癌旁非腫瘤組織,并且高水平的miR-630與患者較差的新輔助化療效果、較短的無進展生存期密切相關[19]。Cui等[20]的研究表明卵巢癌細胞衍生的外泌體中攜帶大量的miR-630,而miR-630則會促進腫瘤相關成纖維細胞活化,進而為腫瘤細胞的轉移和定植提供有利微環(huán)境。本研究結果顯示,ccRCC組織中miR-630表達水平顯著高于癌旁正常組織,進一步根據(jù)miR-630的表達水平中位數(shù)將ccRCC患者分為miR-630高表達組和低表達組。分析結果顯示,miR-630表達水平與性別、年齡無顯著關聯(lián),高水平的miR-630與更大的腫瘤直徑、高臨床分期和淋巴結轉移有關。

3.4ccRCC細胞凋亡水平顯著低于正常腎組織細胞。凋亡抑制是引起ccRCC進展和轉移的主要動力之一[21]。caspase-3是腫瘤細胞凋亡的執(zhí)行蛋白,也是調控ccRCC細胞凋亡的主要功能蛋白[22]。Bcl2是抗凋亡蛋白,具有抑制caspase-3蛋白功能的作用,從而抑制細胞凋亡[23]。本研究結果表明,與癌旁正常組織相比,ccRCC組織中caspase-3表達下調,而Bcl2表達上調,且ccRCC組織中miR-630表達水平與caspase-3表達水平呈負相關,與Bcl2表達水平呈正相關。提示miR-630可能通過抑制凋亡促進ccRCC進展。本研究結果也顯示當miR-630水平升高后,細胞增殖活力升高而凋亡率降低,抑制miR-630表達則可得到相反的結果。有報道顯示miR-630可促進結直腸癌細胞增殖并抑制細胞凋亡[24]。也有研究顯示降低miR-630的表達可增強化療耐藥卵巢癌細胞的凋亡,提高化療敏感性[25]。綜合上述結果,筆者認為高水平的miR-630在ccRCC中起到抗凋亡作用,從而促進ccRCC進展。

綜上所述,miR-630在ccRCC組織中表達上調,并發(fā)揮抑制凋亡的作用,其與ccRCC患者的高臨床分期和淋巴結轉移有關。關于miR-630與ccRCC患者預后的關系值得擴大臨床樣本量,通過前瞻性研究進一步驗證。