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        壯醫(yī)經(jīng)筋推拿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛機(jī)制研究

        2023-11-09 03:42:22梁英業(yè)王天翊盧棟明唐宏亮蘇夢(mèng)潔何育風(fēng)
        中國臨床新醫(yī)學(xué) 2023年10期
        關(guān)鍵詞:血清水平手術(shù)

        梁英業(yè), 王天翊, 盧棟明, 唐宏亮, 陳 立, 蘇夢(mèng)潔, 何育風(fēng)

        神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷和功能紊亂而造成的疼痛綜合征,是慢性疼痛的主要原因之一。有研究顯示,NPP的人群患病率為3.3%~8.2%[1],而在50歲以上人群中達(dá)8.9%[2]。壯醫(yī)經(jīng)筋推拿療法作為治療疼痛的特色民族療法,以“松筋解結(jié)”為基本原則,以“查灶術(shù)”和“松筋術(shù)”為特色,在治療疼痛方面具有良好的療效[3-5],但其起效機(jī)制尚不明確。鑒此,本研究以細(xì)胞焦亡為切入點(diǎn),從NPP經(jīng)典炎癥通路闡明推拿鎮(zhèn)痛的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠45只,體重220~250 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大鼠單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,室溫20~25 ℃,濕度35%~45%,自由飲用自來水,飼用普通清潔鼠飼料,每日更換籠具與墊料。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組、正常組、壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組、假推拿組和假手術(shù)組,每組9只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查并批準(zhǔn)(No.DW20220621-129)。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 總RNA提取試劑Life TRIzol Reagent RNA(美國Life Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄酶GoScriptTMReverse Transcriptase[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd],實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)混合試劑GoTaq? RT-qPCR Master Mix[Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd],乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒(微板法,南京建成生物技術(shù)研究所),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

        1.1.3 儀器設(shè)備 YI-875型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠),低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司,型號(hào):Sigma 3-18KS),酶標(biāo)儀(美國伯樂公司,型號(hào):Elx800),ND1000分光光度計(jì)(美國賽默飛公司,型號(hào):ND-ONE-W),RT-qPCR儀(瑞士Roche公司,型號(hào):Roche Light Cycler 96),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模擬推拿儀器(專利號(hào):ZL201420473452.7),觸覺測(cè)量套件纖維絲(Von Frey纖維絲,美國IITC公司),熱板痛覺測(cè)試儀(美國IITC公司)。

        1.2實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation,SNL)大鼠模型建造[6]對(duì)模型組、壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組、假推拿組實(shí)施造模手術(shù),建造SNL大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h予以禁食,按每100 g體重給予0.4 ml 10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉,以角膜反射消失為麻醉成功。將大鼠俯臥位固定于手術(shù)板上,定位兩側(cè)髂后上嵴,并以此為中心用電動(dòng)剃刀在上、下3 cm范圍剃毛備皮,常規(guī)消毒。在左側(cè)髂后上棘與脊柱之間,做一平行于脊柱方向的縱行切口,長(zhǎng)度約2 cm。將皮膚、筋膜、肌肉鈍性分離,暴露L4-6脊椎左側(cè)的橫突,用咬骨鉗夾斷橫突與椎體之間的連接,可看到2條并行的脊神經(jīng),鈍性分離內(nèi)側(cè)脊神經(jīng),用5-0的可吸收性羊腸線雙層結(jié)扎,此過程要盡量避免牽拉該神經(jīng)。最后用生理鹽水清洗手術(shù)創(chuàng)口,逐層縫合傷口。術(shù)后觀察到大鼠足跖部有明顯的外翻、跛行,行走時(shí)避免患肢著地等異常行為,以及大鼠在熱痛測(cè)量板上出現(xiàn)舔食患肢、甩足行為,可在無任何刺激的情況下發(fā)生自發(fā)性的抬足反射,則提示SNL大鼠造模成功。假手術(shù)組在手術(shù)過程中僅暴露脊神經(jīng)幾分鐘,但不予結(jié)扎;正常組不進(jìn)行任何手術(shù)處理。

        1.2.2 干預(yù)方法 (1)壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組:壯醫(yī)認(rèn)為在疼痛周圍會(huì)形成筋結(jié),治療要松筋解結(jié)。鑒此,研究者使用布袋束縛大鼠后應(yīng)用按摩推拿手法模擬儀依次刺激脊神經(jīng)結(jié)扎節(jié)段對(duì)應(yīng)的體表部位(即環(huán)跳穴),以及所結(jié)扎神經(jīng)支配區(qū)域(以1 cm為間隔)。腰椎間盤突出癥疼痛部位往往是腰部及下肢,再選擇2個(gè)治療點(diǎn)(即陽陵泉穴、懸鐘穴)。推拿手法為臨床常用的松筋解結(jié)手法(點(diǎn)法、撥法、揉法),刺激力量為4 N。按摩推拿手法模擬儀的按摩頭選用直徑為10 mm的圓形光滑接觸面頭,每法、每處干預(yù)1 min。每只大鼠每日予3處、3法,總計(jì)9 min,連續(xù)干預(yù)14 d。(2)假推拿組:使用布袋束縛大鼠并輕輕撫摸其雙后肢,每天予以9 min干預(yù),連續(xù)干預(yù)14 d。(3)正常組、假手術(shù)組和模型組不進(jìn)行干預(yù),連續(xù)觀察14 d。

        1.2.3 大鼠機(jī)械縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical thresholds,PWMT)測(cè)定[7]于術(shù)前,以及術(shù)后1 d、3 d和14 d測(cè)定各組大鼠PWMT。在室溫25 ℃的環(huán)境下,將大鼠置于四周粘上紅紙、底層為鐵絲網(wǎng)的籠子內(nèi)。待大鼠適應(yīng)15 min后,采用VonFrey纖維絲依次加大力度刺激手術(shù)側(cè)后肢足底中部,每次持續(xù)刺激時(shí)間為3~4 s。檢測(cè)3次,每次間隔5 min。記錄纖維絲顯示的大鼠最小PWMT,取3次測(cè)定的平均值。

        1.2.4 大鼠熱刺激回縮潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)測(cè)定[8]于術(shù)前,以及術(shù)后1 d、3 d和14 d測(cè)定各組大鼠的PWTL。環(huán)境溫度為25 ℃,熱板痛覺測(cè)試儀調(diào)至(55.0±0.2)℃。將大鼠放置于測(cè)試儀的封閉且透明玻璃盒內(nèi),啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。當(dāng)觀察到大鼠出現(xiàn)快速抬足、頻繁舔足等現(xiàn)象時(shí)停止計(jì)時(shí)并記錄。連續(xù)測(cè)定3次,每次間隔5 min。取平均值作為PWTL,即大鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)時(shí)間。

        1.2.5 組織標(biāo)本取材 各組大鼠在術(shù)后14 d完成上述行為學(xué)觀察后,按照每100 g體重給予0.4 ml的水合氯醛(10%)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉,采血后將其斷頭處死,用鍘刀將大鼠胸段及以上和L6以下切斷,僅保留腰段(L2-6),并迅速取出L4-6脊髓背角組織。經(jīng)液氮冷卻后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)錂z。

        1.2.6 大鼠背根神經(jīng)節(jié)caspase-1表達(dá)水平檢測(cè) 通過TRIzol法提取各組大鼠L4-6脊髓背角的一部分組織中的總RNA,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用NanoDrop儀器測(cè)定RNA濃度和純度。采用GoScriptTMReverse Transcriptase試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR,反應(yīng)總體積為20 μl:Nuclease-Free Water 7.2 μl;上、下游引物各0.4 μl;GoTaq? RT-qPCR Master Mix 10 μl;cDNA 2 μl。反應(yīng)條件為兩步擴(kuò)增法:第一步為預(yù)變性95 ℃10 min;第二步為變性擴(kuò)增95 ℃15 s,退火溫度為60 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。所用引物序列見表1,由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用2-ΔΔCt法計(jì)算caspase-1的相對(duì)表達(dá)水平。

        1.2.7 血清白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-18表達(dá)水平檢測(cè) 采集各組大鼠腹主動(dòng)脈血后,在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min,收集上層血清。應(yīng)用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清IL-18的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

        1.2.8 血清中LDH水平檢測(cè) 采集各組大鼠腹主動(dòng)脈血后,在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min,收集上層血清。嚴(yán)格按照LDH檢測(cè)試劑盒(微板法)的說明書步驟進(jìn)行血清LDH水平測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

        2 結(jié)果

        2.1五組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PWMT比較 術(shù)前,五組大鼠PWMT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1 d、3 d,與正常組比較,其余四組的PWMT顯著降低(P<0.05);術(shù)后14 d,模型組和假推拿組的PWMT顯著低于正常組,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組的PWMT顯著高于模型組和假推拿組(P<0.05)。見表2。

        表2 五組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PWMT比較

        2.2五組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PWTL比較 術(shù)前,五組大鼠的PWTL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1 d、3 d,與正常組比較,其余各組的PWTL均顯著降低(P<0.05)。術(shù)后3 d,模型組和假推拿組的PWTL均較假手術(shù)組、壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組顯著降低(P<0.05),而壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組和假手術(shù)組的PWTL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后14 d,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組的PWTL高于模型組、假推拿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

        表3 五組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PWTL比較

        2.3五組大鼠干預(yù)14 d后脊髓背角caspase-1表達(dá)水平比較 壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組、假推拿組和模型組中脊髓背角中caspase-1的表達(dá)水平較正常組顯著升高(P<0.05)。與模型組和假推拿組相比,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組caspase-1的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。正常組與假手術(shù)組caspase-1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

        注:與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組比較,cP<0.05

        2.4五組大鼠干預(yù)14 d后血清IL-18水平比較 模型組的血清IL-18水平較正常組顯著升高(P<0.05)。與模型組、假推拿組相比,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組血清IL-18的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),正常組與假手術(shù)組血清IL-18水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

        注:與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組比較,cP<0.05;與假推拿組比較,dP<0.05

        2.5五組大鼠干預(yù)14 d后血清LDH表達(dá)水平比較 模型組血清LDH水平較正常組顯著增高(P<0.05)。與模型組、假推拿組相比,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組大鼠血清LDH水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖3。

        注:與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組比較,cP<0.05;與假推拿組比較,dP<0.05

        3 討論

        3.1NPP的主要特征包括自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏。組織在發(fā)生損傷時(shí),受損區(qū)域的細(xì)胞會(huì)釋放出炎癥介質(zhì),傷害性刺激也可以導(dǎo)致神經(jīng)源性的炎癥反應(yīng),神經(jīng)炎癥是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的共同病理特征[9]。在炎性疼痛的產(chǎn)生和維持過程中,促炎因子起到了敏化疼痛的作用。近期研究表明,在造成NPP的脊髓機(jī)制中,神經(jīng)損傷時(shí),通過特異性受體介導(dǎo)而被激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表型結(jié)構(gòu)及功能均發(fā)生變化,并釋放大量腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、神經(jīng)活性物質(zhì)、IL等促炎細(xì)胞因子。在外周及中樞敏化的途徑中,神經(jīng)損傷導(dǎo)致肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞滲出、交感神經(jīng)興奮以及血管擴(kuò)張,使外周和中樞產(chǎn)生組胺、緩激肽、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、IL、TNF等促炎細(xì)胞因子[10]。它們可以通過炎性介質(zhì)調(diào)控細(xì)胞膜表面不同離子通道的活性,并促進(jìn)中樞敏化,導(dǎo)致痛覺過敏、異常性疼痛。

        3.2近年來,國內(nèi)學(xué)者已從細(xì)胞自噬、干擾素、蛋白酶抑制劑、miRNA等多個(gè)層面研究了炎癥的調(diào)控機(jī)制[11-13]。但由于炎癥的發(fā)生機(jī)制及調(diào)控的復(fù)雜性,現(xiàn)有的研究不足以解決臨床問題。近期有研究表明,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí),細(xì)胞膜水解破裂會(huì)釋放其細(xì)胞內(nèi)容物和促炎因子,包括IL-18等,產(chǎn)生炎性疼痛[14]。細(xì)胞焦亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式,其與細(xì)胞凋亡的區(qū)別在于它不依賴于細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3,而是由caspase-1介導(dǎo)促炎形式的程序性細(xì)胞死亡,其特征在于快速的質(zhì)膜破裂[15],釋放細(xì)胞內(nèi)容物,誘發(fā)級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)[16]。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡存在兩條途徑(細(xì)胞受到的刺激不同,所誘發(fā)的途徑也不同):介導(dǎo)caspase-1活化的經(jīng)典通路和促進(jìn)caspase-11活化的非經(jīng)典通路。caspase-1具有活化IL-18和IL-1β的功能[17]。在細(xì)胞焦亡的經(jīng)典炎癥通路中,caspase-1是以活性的酶原形式存在,在與多蛋白復(fù)合物炎性小體結(jié)合并被激活后,裂解成具有活性的caspase-1。隨后,caspase-1裂解GSDMD。GSDMD是由gasdermin家族的GSDMD基因編碼的胞漿蛋白,在不同細(xì)胞和組織中被廣泛表達(dá),在免疫相關(guān)疾病中具有重要的作用[18],是caspase-1和caspase-4/5/11的通用底物[19]。在caspase-1裂解GSDMD后,釋放N-末端結(jié)構(gòu)域,與質(zhì)膜的內(nèi)部小葉結(jié)合并寡聚形成直徑12~14 nm的膜孔[20]。這些膜孔是胞內(nèi)物質(zhì)(包括炎性因子、LDH等)流出的重要途徑。當(dāng)這些膜孔的數(shù)量顯著增多時(shí),導(dǎo)致細(xì)胞顯著腫脹并伴隨膜破裂,胞內(nèi)物質(zhì)流出。流出的IL-18前體裂解并誘導(dǎo)其他炎性因子、黏附分子等的合成和釋放,放大局部和全身炎癥。

        3.3壯醫(yī)經(jīng)筋的理論認(rèn)為人體受到外界環(huán)境邪毒入侵或體內(nèi)致病因素的作用,導(dǎo)致“三道兩路”(即氣道、谷道、水道以及龍路、火路)通道功能障礙,使得人體肌筋系統(tǒng)發(fā)生病變,“三氣”(即人體上、中、下三部之氣)不能同步而導(dǎo)致全身性的連鎖反應(yīng),使得單純型或復(fù)合型的肌肉筋結(jié)出現(xiàn)急慢性損傷,表現(xiàn)為疼痛、有形的病理改變,以及功能異常導(dǎo)致的酸脹、僵硬、活動(dòng)受限等經(jīng)筋“病灶”癥候群[21]。鑒此,壯醫(yī)提出“因結(jié)致痛”,而在經(jīng)筋病的治療上注重“經(jīng)筋病灶”的探查與松解,從而形成了一套獨(dú)特的壯醫(yī)經(jīng)筋療法。壯醫(yī)經(jīng)筋療法以解除病痛消除經(jīng)筋病灶為目的,采用獨(dú)特的理筋手法、針具刺筋、經(jīng)絡(luò)拔罐等治療方式,臨床運(yùn)用廣泛,療效顯著。本研究通過按摩推拿手法模擬儀采用臨床常用松筋解結(jié)手法松解SNL大鼠的筋結(jié),檢測(cè)大鼠的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)及大鼠脊髓背角組織的細(xì)胞焦亡相關(guān)指標(biāo)改變情況。結(jié)果顯示,推拿干預(yù)后第1天、第3天,模型組、壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組、假推拿組的PWMT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示短時(shí)間的推拿干預(yù)對(duì)SNL模型大鼠的PWMT影響并不顯著。在推拿干預(yù)后第14天,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組PWMT顯著高于模型組和假推拿組;而在推拿干預(yù)后第3天,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組的PWTL即顯著高于模型組和假推拿組(P<0.05)。提示短時(shí)間的推拿干預(yù)即可有效緩解SNL模型大鼠的PWTL,其療效反應(yīng)較PWMT更為敏感。在推拿干預(yù)后第14天,模型組caspase-1、IL-18及LDH水平較正常組、假手術(shù)組顯著增高(P<0.05)。與模型組、假推拿組相比,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿組caspase-1、IL-18及LDH的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。由此筆者推測(cè):(1)脊神經(jīng)損傷刺激因素促使脊髓部位caspase-1蛋白表達(dá)升高,進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生焦亡、破裂,胞內(nèi)物質(zhì)炎性因子IL-18以及細(xì)胞焦亡標(biāo)志物L(fēng)DH流出,故術(shù)后第14天模型組caspase-1及血清IL-18、LDH水平較正常組顯著增高。(2)假推拿作為一種安慰對(duì)照,可以使大鼠情緒得到安撫,疼痛狀態(tài)有所緩解,生物因子水平得到輕微改善,但效果遠(yuǎn)不如推拿組。(3)壯醫(yī)經(jīng)筋推拿能夠下調(diào)SNL模型大鼠脊髓背角組織caspase-1蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞焦亡,抑制IL-18、LDH分泌,從而達(dá)到抑炎鎮(zhèn)痛的目的。

        綜上所述,壯醫(yī)經(jīng)筋推拿可減輕NPP大鼠的痛覺過敏反應(yīng),其可能通過抑制caspase-1的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞焦亡,進(jìn)而阻礙炎癥因子IL-18、LDH的分泌,達(dá)到抑制炎癥鎮(zhèn)痛效果,從分子水平進(jìn)一步闡釋了壯醫(yī)經(jīng)筋推拿的鎮(zhèn)痛機(jī)制。但本研究對(duì)于何種因素誘導(dǎo)caspase-1的表達(dá)和激活,以及上游分子事件尚未能詳細(xì)闡明,后續(xù)還需深入研究。

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