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        丹參酮ⅡA抑制STAT3通路調節(jié)食管癌EC109細胞的周期與凋亡*

        2023-11-09 08:36:14陳星周哲旭尚藝婉劉洋劉婭茹胡嘯博樊李妍陳玉龍
        中醫(yī)學報 2023年11期
        關鍵詞:低濃度丹參酮高濃度

        陳星,周哲旭,尚藝婉,劉洋,劉婭茹,胡嘯博,樊李妍,陳玉龍

        河南中醫(yī)藥大學/河南省中醫(yī)方證信號傳導重點實驗室,河南 鄭州 450046

        食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一,在全球癌癥相關死亡原因中排第六位,我國食管癌的發(fā)病率與病死率較高[1-2]。目前,針對食管癌患者的主要治療手段是放化療及聯(lián)合手術,但由于大多數(shù)患者在晚期確診,導致其5年生存率極低[3-4]。多項研究表明,信號傳導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號通路參與了食管癌的發(fā)生和發(fā)展,促進腫瘤細胞的增殖、遷移、抗凋亡、抗耐藥等,嚴重影響其預后,已成為食管癌治療的潛在靶點[5-9]。丹參酮ⅡA作為中藥丹參的有效成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗纖維化、抗動脈粥樣硬化、抗癌等作用[10-11]。研究證實,丹參酮 ⅡA 可以通過抑制上皮間質轉化促進食管癌EC9706和KYSE70細胞凋亡,抑制其侵襲、遷移[12]。同時,丹參酮ⅡA可以通過下調p-STAT3抑制人胃癌細胞的增殖[13]。前期預實驗發(fā)現(xiàn),不同濃度的丹參酮ⅡA能夠有效抑制STAT3、p-STAT3的表達,并且隨濃度梯度抑制食管癌Ec109細胞的增殖。但是丹參酮ⅡA能否通過抑制STAT3通路促進食管癌細胞周期阻滯進而促進其凋亡尚未見報道?;诖?本實驗擬從丹參酮ⅡA抑制食管癌細胞Ec109增殖的基礎上,探討其能否通過抑制STAT3信號通路發(fā)揮其抗腫瘤作用,為食管癌的臨床治療提供新的思路與靶點。

        1 材料

        1.1 動物與細胞人食管癌Ec109細胞,由本實驗室傳代凍存。70只4周齡SPF級BALB/c雌鼠,體質量11~15 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號:NO.110011220106561335,實驗動物許可證號:SCXK(京)2021-0006。動物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學動物實驗中心(23±2) ℃的SPF動物房中,動物實驗經河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準,倫理編號:ZWLL202003215。

        1.2 藥物與試劑STAT3抑制劑stattic(Selleckchem公司,批號:S7024);丹參酮ⅡA(質量分數(shù)≥98%,成都曼斯特公司,批號:568-72-9);RPMI Medium1640培養(yǎng)基(美國Gibico公司,批號:2357161);胰蛋白酶-EDTA消化液、胰蛋白酶不含EDTA消化液、四甲基偶氮唑鹽(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、高效RIPA裂解液、PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑混合物(北京索萊寶科技有限公司,批號:T1300、T1350、M8180、D8370、R0010、P0100、P1260);胎牛血清(Hyclone公司,貨號:RB39736);STAT3鼠抗人抗體、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)鼠抗人抗體、c-Myc兔單克隆抗體、CyclinB1抗體、α-tublin兔單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗(美國CST公司,貨號:9145S、9508S、18583S、4138S、2125S、7056S、7074S);p-STAT3兔抗人抗體、caspase-3兔抗人抗體(英國Abcam公司,貨號:ab76315、ab32351);細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司,貨號:A20533、A10642);Trizol試劑(美國invitrogen公司,批號:390202);逆轉錄試劑盒(東洋紡公司,批號:117000);2×SYBRGreen(ABclonal公司,批號:9620031031C)。

        1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:170R);超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司,型號:37997);倒置顯微鏡(德國Leica公司,型號:DFC450C);酶標儀(美國Bio-Tek公司,型號:ELx-800);離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:LABOFUGE 400);垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司,型號:PowerPac Basic);垂直濕轉膜儀(美國Bio-Rad公司,型號:Criterion Blotter);低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:X1R);凝膠成像掃描儀(美國Bio-Rad公司,型號:ChemiDoc XRS+);流式細胞儀(美國BD公司,型號:FACSVantageSE);冷凍型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號:Scientz-48L);電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司,型號:XB120A);實時熒光定量 PCR 儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:QuantStudio 6)。

        2 方法

        2.1 細胞培養(yǎng)食管癌Ec109細胞置于5%CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中用含10%血清的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每2~3天傳代一次,取對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗。

        2.2 藥物配置采用電子天平稱取適量stattic、丹參酮ⅡA粉末,用DMSO分別配置成20 mmol·L-1、10 g·L-1工作液,-20 ℃避光保存1個月,用于后續(xù)實驗。

        2.3 MTT法檢測丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞增殖的影響取對數(shù)生長期的Ec109細胞,用含EDTA的胰酶消化重懸計數(shù),每孔1×104個細胞接種于96孔板,每孔200 μL,置于5%CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分別設置空白組、丹參酮ⅡA組、stattic組。丹參酮ⅡA的濃度分別為0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1,stattic的濃度分別為0 μmol·L-1、3 μmol·L-1、6 μmol·L-1、12 μmol·L-1、15 μmol·L-1、24 μmol·L-1,聯(lián)合用藥分析時又分為空白組、丹參酮ⅡA 2 mg·L-1組、丹參酮ⅡA 8 mg·L-1組、stattic 7 μmol·L-1組、丹參酮ⅡA 2 mg·L-1+static 7 μmol·L-1組、丹參酮ⅡA 8 mg·L-1+static 7 μmol·L-1組,每組均設置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,將5 g·L-1MTT與1640培養(yǎng)基以19比例進行配置后,每孔加入100 μL,4 h后,每孔加入150 μL DMSO,采用酶標儀測定490 nm波長下各孔吸光值(optical density,OD),計算各組藥物抑制率。

        藥物抑制率=(空白組OD值-用藥組OD值)/空白組OD值×100%

        2.4 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡取對數(shù)生長期的Ec109細胞,以3×106個/孔接種于6孔板,分為空白組、丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組、stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組,加藥48 h后,使用不含EDTA的胰酶消化,收集各孔細胞,1 500 r·min-1離心5 min,1 mL PBS洗滌一次,按照說明書進行檢測。細胞周期檢測時,每組加入1 mL Staining solution與10 μL Permeabilization solution,混勻,避光孵育 30 min,上機檢測。細胞凋亡檢測時,每組加入 500 μL 使用無菌去離子水稀釋的1×Binding Buffer、5 μL AnnexinV-FITC與10 μL PI,混勻,避光孵育5 min,上機檢測。

        2.5 動物分組、造模與干預從70只4周齡SPF級BALB/c雌鼠中隨機抽取10只作為空白組,其余每只小鼠均與右脅部皮下注射2×106個對數(shù)生長期的Ec109細胞,1周后觀察皮下移植瘤體積,當移植瘤直徑約5 mm時造模成功。將造模成功的小鼠隨機分為模型組、丹參酮ⅡA低濃度組(20 mg·kg-1)、丹參酮ⅡA高濃度組(40 mg·kg-1)、stattic組(25 mg·kg-1)、stattic(25 mg·kg-1)+丹參酮ⅡA高濃度(40 mg·kg-1)組、順鉑組(1 mg·kg-1),腹腔注射給藥,每2天進行1次,連續(xù)35 d,末次給藥24 h后麻醉處死,稱量瘤體大小與質量。

        2.6 繪制體質量增長、瘤體生長圖給藥期間每 7 d 測量一次瘤體大小與小鼠體質量,考察藥物對小鼠腫瘤生長的抑制作用,瘤體大小按照V=a×b2×0.52計算,其中a為瘤體長,b為瘤體寬。

        2.7 ELISA法檢測移植瘤裸鼠血清白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平末次給藥24 h后,摘眼球采血,離心后取血清,按照ELISA試劑盒說明書的操作要求檢測各組小鼠血清中IL-6的水平。

        2.8 免疫印跡法檢測細胞周期、凋亡相關蛋白表達水平細胞分組同2.4,加藥培養(yǎng)48 h后,以RIPA裂解液:蛋白磷酸酶抑制劑:PMSF=10011的比例配制細胞裂解液混合物,每孔加入130 μL進行細胞裂解;動物分組同2.5,按照1 mg組織加入 4 μL 裂解液比例,采用低溫高速組織破碎儀進行組織破碎。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度,98 ℃變性8 min,取20 μg蛋白上樣,用10%SDS-PAGE凝膠電泳,200 mA轉膜60 min,5%脫脂牛奶室溫封閉4 h,加一抗(STAT3、c-Myc、CyclinB1、Caspase-9、α-tublin的稀釋比例為11 000,p-STAT3的稀釋比例為110 000,Caspase-3的稀釋比例為15 000)4 ℃孵育過夜,TBST漂洗3次,加二抗(稀釋比例為11 000)室溫孵育1 h,漂洗3次,配制ECL發(fā)光顯影液,顯影拍照。以α-微管蛋白(α-tubulin)為內參,使用ImageLab分析每組條帶的光密度值,以目的條帶光密度值/內參條帶光密度值計算各組蛋白相對表達量。

        2.9 PCR法檢測細胞周期、凋亡相關基因mRNA的表達細胞分組同2.4,動物分組同2.5,TRIZOL法提取各組總RNA,按照說明書進行逆轉錄,采用SYBR Green染料法以10 μL體系(cDNA+無菌無酶水7 μL,5×RT Buffer 2 μL,Enzyme mix 0.5 μL,Primer mix 0.5 μL)對cDNA進行擴增,β-actin為內參,用2-△△Ct計算各個樣品中目的mRNA相對表達量。引物序列由GENEWIZ公司設計合成。見表1。

        表1 引物序列

        3 結果

        3.1 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞增殖的影響與空白組比較,不同濃度丹參酮ⅡA對Ec109細胞的增殖均有明顯的抑制作用(P<0.01),且抑制率隨丹參酮ⅡA濃度的升高而升高,選取2 mg·L-1、8 mg·L-1分別為后續(xù)實驗中丹參酮的低、高濃度劑量。與空白組比較,當stattic濃度≥6 μmol·L-1時,對Ec109細胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.01),且抑制率隨stattic濃度的升高而升高,選取7 μmol·L-1為后續(xù)實驗聯(lián)合用藥中的stattic濃度。與空白組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組、stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組對Ec109細胞的增殖均有明顯抑制作用(P<0.01),但與單獨用藥組比較,聯(lián)合用藥組對Ec109細胞增殖的抑制作用無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

        表2 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞增殖的影響

        3.2 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞周期的影響與空白組比較,丹參酮ⅡA高濃度組G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.01),G2/M期細胞比例顯著升高(P<0.01);stattic組G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.01),S期細胞比例顯著升高(P<0.01);stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.01),S期細胞比例顯著升高(P<0.05),G2/M期細胞比例顯著升高(P<0.05)。與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組G2/M期細胞比例顯著升高(P<0.05)。見表3、圖1。

        注:A:空白組;B:丹參酮ⅡA低濃度組;C:丹參酮ⅡA高濃度組;D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA低濃度組;F:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖1 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞周期的影響

        表3 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞周期的影響

        3.3 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡的影響與空白組比較,丹參酮ⅡA高濃度組早期凋亡、晚期凋亡細胞比例及總凋亡率均顯著升高(P<0.01);stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組早期凋亡細胞比例及總凋亡率顯著升高(P<0.01)。見表4、圖2。

        注:A:空白組;B:丹參酮ⅡA低濃度組;C:丹參酮ⅡA高濃度組;D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA低濃度組;F:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖2 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡的影響

        表4 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡的影響

        3.4 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡、周期相關蛋白表達的影響與空白組比較,各給藥組p-STAT3、STAT3、CyclinB1蛋白相對表達量均顯著降低(P<0.05);stattic組、stattic+丹參酮ⅡA低濃度組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組c-Myc蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見表5、圖3。

        注:A:空白組;B:丹參酮ⅡA低濃度組;C:丹參酮ⅡA高濃度組;D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA低濃度組;F:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖3 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡、周期相關蛋白的影響

        表5 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡、周期相關蛋白表達的影響

        3.5 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡、周期相關基因mRNA表達的影響與空白組比較,各給藥組c-MycmRNA、CyclinB1mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05);丹參酮ⅡA低濃度組Caspase-9mRNA相對表達量明顯升高(P<0.01);丹參酮ⅡA高濃度組STAT3mRNA相對表達量明顯降低(P<0.01),Caspase-3mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05);stattic組STAT3mRNA相對表達量明顯降低(P<0.01),Caspase-9mRNA相對表達量明顯升高(P<0.01);stattic+丹參酮 ⅡA 低濃度組和stattic+丹參酮ⅡA高濃度組STAT3mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05),Caspase-3mRNA、Caspase-9mRNA相對表達量明顯升高(P<0.01)。與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組c-MycmRNA相對表達量明顯降低(P<0.05)。見表6。

        表6 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對Ec109細胞凋亡、周期相關基因mRNA表達的影響

        3.6 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對小鼠體質量及瘤體大小的影響隨著用藥時間的延長,模型組與各藥組小鼠的體質量均會降低。末次體質量比較發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組、stattic組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組小鼠體質量顯著下降(P<0.01);與模型組比較,stattic組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組小鼠體質量顯著下降(P<0.01);與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組小鼠體質量明顯升高(P<0.01)。見圖4。與模型組比較,各給藥組均可顯著抑制移植瘤的生長(P<0.01)。見圖5、圖6。

        注:KB:空白組;M:模型組;L:丹參酮ⅡA低濃度組;H:丹參酮ⅡA高濃度組;S:stattic組;S+H:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組;SHUN:順鉑組。圖4 各實驗組小鼠體質量變化

        注:M:模型組;L:丹參酮ⅡA低濃度組;H:丹參酮ⅡA高濃度組;S:stattic組;S+H:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組;SHUN:順鉑組;與模型組比較,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1。圖5 各組小鼠移植瘤瘤體大小比較

        注:M:模型組;L:丹參酮ⅡA低濃度組;H:丹參酮ⅡA高濃度組;S:stattic組;S+H:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組;SHUN:順鉑組。圖6 各實驗組末次測量瘤體大小示意圖

        3.7 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對小鼠血清中IL-6水平的影響與空白組比較,模型組IL-6表達水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,除丹參酮ⅡA低濃度外,其余各用藥組IL-6表達水平顯著降低(P<0.05)。見表7。

        表7 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對小鼠血清中IL-6水平的影響

        3.8 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對移植瘤細胞周期、凋亡相關蛋白表達的影響與模型組比較,各給藥組STAT3、c-Myc蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);丹參酮ⅡA低濃度組Caspase-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.01);丹參酮ⅡA高濃度組、stattic組p-STAT3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);stattic+丹參酮ⅡA高濃度組p-STAT3蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。與stattic組比較,stattic+丹參酮ⅡA高濃度組Caspase-9蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。見表8、圖7。

        注:A:模型組 B:丹參酮ⅡA低濃度組 C:丹參酮ⅡA高濃度組 D:stattic組;E:stattic+丹參酮ⅡA高濃度組。圖7 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對移植瘤細胞周期、凋亡相關蛋白表達的影響

        表8 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對移植瘤周期、凋亡相關蛋白表達的影響

        3.9 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對移植瘤細胞周期、凋亡相關基因mRNA表達的影響與模型組比較,各給藥組STAT3mRNA、c-MycmRNA表達水平顯著降低(P<0.05),Caspase-3mRNA表達水平明顯升高(P<0.05);除stattic組,其余各組CyclinB1mRNA表達水平明顯降低(P<0.05);除丹參酮ⅡA低濃度組外,其余各給藥組Caspase-9mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。與stattic組比較,聯(lián)合用藥組Caspase-3mRNA、Caspase-9mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),其余均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表9。

        表9 丹參酮ⅡA、stattic及聯(lián)合用藥對移植瘤周期、凋亡相關基因mRNA表達的影響

        4 討論

        食管癌的發(fā)生和轉移是一個復雜的、多步驟的過程[14],其潛在機制尚不清楚。然而,已知食管癌的發(fā)展與過度增殖、細胞凋亡減少和運動能力增強有關。STATs主要由轉錄激活因子和信號轉導因子組成,在調控細胞增殖和分化、調控細胞凋亡和血管生成等多種細胞功能中起著重要作用[15]。STAT3作為這個家族的一員,與惡性轉化和腫瘤發(fā)生密切相關,盡管STAT3在甲狀腺腫瘤發(fā)生中起著抑制作用,但在許多人類癌癥如乳腺癌、胃癌和結腸癌等多種惡性腫瘤中表達異常活躍[16-19],尤其是食管癌[20-21],STAT3可以上調抗凋亡蛋白的表達、調節(jié)細胞周期相關基因的表達,促進腫瘤細胞的生存和增殖[22-23]。Myc為STAT3的下游靶標,研究證實STAT3可通過調控c-Myc來抑制腫瘤細胞增殖,促進其凋亡[24]。有研究表明,下調STAT3基因表達能夠抑制Bcl-2抗凋亡蛋白、原癌蛋白 c-Myc 的表達,促進食管癌TE-1細胞凋亡,抑制細胞周期蛋白CyclinB1表達使TE-1細胞產生G2/M期阻滯[25]。同時JAK/STAT3 抑制劑可以通過誘導 PARP、Caspase-3、Caspase-9等的裂解導致結腸癌細胞的凋亡[26]。

        中藥丹參具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效。丹參酮ⅡA是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的菲醌類衍生物,可以通過多種機制有效抑制多種腫瘤細胞的增殖,調控其周期,促進腫瘤細胞凋亡[27]。有研究表明,丹參酮ⅡA可通過上調腫瘤細胞內活性氧的表達促進凋亡蛋白Caspase-3的表達和自噬發(fā)生[28],并且可通過p53、細胞周期蛋白 B1/ 細胞分裂周期基因2和Caspase-3介導的信號傳導通路抑制人鼻咽癌細胞的增殖,誘導其凋亡[29]。此外,丹參酮ⅡA也可以通過抑制β-arrestin1 表達,從而抑制c-Myc和Cyclin D1的表達,進而抑制結直腸癌細胞的轉移[30]。

        本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA對食管癌Ec109細胞的生長有顯著的抑制作用,并隨著濃度的升高而升高,且對于Ec109細胞中p-STAT3、STAT3有顯著抑制作用,并呈劑量-時間相關性。基于此,本課題組提出假設,丹參酮ⅡA通過抑制STAT3而發(fā)揮其抗腫瘤作用。實驗選取IC30(2 mg·L-1)、IC50(8 mg·L-1)作為丹參酮ⅡA的低、高濃度,并聯(lián)合STAT3抑制劑stattic探討丹參酮ⅡA與stattic聯(lián)合使用后能否繼續(xù)發(fā)揮其抑癌作用。MTT結果表明,與stattic比較,stattic聯(lián)合丹參酮ⅡA低、高濃度對細胞的抑制率無明顯差別。細胞凋亡檢測結果顯示,隨著丹參酮ⅡA濃度的升高,凋亡率也隨之增加,與stattic比較,當stattic與丹參酮ⅡA低、高濃度組聯(lián)用時,凋亡率無明顯差異,表明當抑制STAT3時,丹參酮ⅡA沒有發(fā)揮其促進腫瘤細胞凋亡的作用。根據細胞周期結果發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA將Ec109細胞周期明顯阻滯在G2期,提示丹參酮ⅡA可能是通過誘導Ec109細胞發(fā)生G2/M期阻滯引起細胞凋亡,而stattic則可能是通過誘導G2/M、S期阻滯引起細胞凋亡;與stattic比較,stattic與丹參酮ⅡA聯(lián)用后,細胞凋亡無顯著差異。通過Western Blot實驗檢測給藥后Ec109細胞周期、凋亡相關蛋白水平的變化,結果顯示,與模型組比較,丹參酮ⅡA低、高濃度組及stattic組均可以抑制p-STAT3、STAT3、c-Myc及Cyclin B1的蛋白表達,促進凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達,stattic與丹參酮ⅡA聯(lián)用后,與stattic比較,相關蛋白表達水平均無統(tǒng)計學差異。PCR結果顯示,丹參酮ⅡA、stattic均能顯著抑制STAT3mRNA、c-MycmRNA、CyclinB1mRNA的表達。丹參酮ⅡA低濃度對Caspase-3mRNA的表達有輕微抑制作用,無統(tǒng)計學差異;而高濃度則顯著上調Caspase-3mRNA的表達,這與前面細胞凋亡結果相符合;丹參酮ⅡA低濃度雖然對于STAT3、c-Myc及Cyclin B1的表達有抑制作用,但差異較小,甚至STAT3mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異,因此,丹參酮ⅡA低濃度對于凋亡基因Caspase-3作用不明顯。而研究發(fā)現(xiàn),Caspase-9mRNA表達水平雖然升高,但并沒有隨著藥物濃度的增加而增加,推測其可能無劑量依賴性。

        基于上述體外實驗結果,為了更好地證明丹參酮ⅡA是通過抑制STAT3通路誘導細胞發(fā)生G2期阻滯,促進腫瘤細胞凋亡,課題組進行了體內驗證。將腫瘤鼠分為空白組、模型組、丹參酮ⅡA低濃度組(20 mg·kg-1)、丹參酮ⅡA高濃度組(40 mg·kg-1)、stattic組(25 mg·kg-1)、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組、順鉑組(1 mg·kg-1)。結果表明,用藥組裸鼠體質量明顯輕于空白組,甚至stattic組、stattic+丹參酮ⅡA高濃度組體質量顯著下降,單用stattic組裸鼠狀態(tài)明顯急躁、消瘦,甚至出現(xiàn)死亡,而丹參酮ⅡA組與順鉑組則無明顯差異,甚至丹參酮ⅡA可以減緩小鼠體質量的下降。stattic與丹參酮ⅡA聯(lián)用后,裸鼠極度消瘦、急躁狀態(tài)有所緩解。對于移植瘤的治療效果,以順鉑最佳,其次是丹參酮ⅡA高濃度組,丹參酮ⅡA低濃度組、stattic與聯(lián)合用藥組次之,且三者無明顯差異。IL-6免疫細胞調節(jié)因子與炎癥、造血,甚至多種腫瘤的進展和細胞凋亡密切相關[31]。小鼠血清IL-6水平測定結果顯示,模型組顯著促進了小鼠IL-6因子的分泌,而丹參酮ⅡA低、高濃度組和stattic組都顯著降低 IL-6 的水平,聯(lián)合用藥組與stattic組比無顯著差異。由于順鉑治療效果佳,移植瘤體積較小,后期蛋白驗證結果可能存在誤差,因此,只針對順鉑組作血清IL-6水平分析,不進行蛋白與mRNA檢測。與模型組比較,丹參酮ⅡA低、高濃度組均可抑制STAT3、p-STAT3、c-Myc、Cyclin B1蛋白及mRNA的表達,促進Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA的表達。聯(lián)合用藥組與stattic組比較,除Caspase-3、Caspase-9的mRNA及蛋白有明顯降低外,其余均無顯著差異,考慮可能兩藥物之間存在拮抗作用,刺激相關因子產生競爭性抑制所致。

        綜上所述,丹參酮ⅡA可能通過抑制STAT3通路誘導食管癌細胞Ec109發(fā)生G2期阻滯,抑制腫瘤細胞的增殖,促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤組織的生長。但STAT3調控機制較為復雜,涉及多個信號軸,丹參酮ⅡA抑制STAT3通路以及細胞周期阻滯及凋亡的發(fā)生機制都有待進一步深入研究。

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