李 杰,王 強(qiáng),2,王 淵,劉雋陽(yáng),郭 婕,李 華,牛文民,張安仁

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽(yáng) 712046;2.陜西省針?biāo)幗Y(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 咸陽(yáng) 712046;3.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院,上海 200434)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是由各種血管因素發(fā)生病理變化引起的腦組織損害,臨床常表現(xiàn)為認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等功能障礙,給患者的日常生活、工作帶來(lái)極大不便[1]。本團(tuán)隊(duì)在多年的研究中發(fā)現(xiàn),嗅三針對(duì)癡呆的癥狀有較好改善作用,而其作用機(jī)制需進(jìn)一步闡明,故開展本次研究工作。本次以VD模型大鼠為研究對(duì)象,從VD早期出現(xiàn)的氧化應(yīng)激著手,圍繞VD早期出現(xiàn)的抗氧化kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)/核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ,Nrf2) /抗氧化反應(yīng)元件(AU-rich element,ARE)信號(hào)通路展開研究,探索嗅三針治療VD的分子機(jī)制,為治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑與儀器:戊巴比妥鈉(批號(hào)57432),伊紅、蘇木(批號(hào)c0109、c0107),二甲苯(批號(hào)534056),中性樹膠(批號(hào)YSQN41)。RIPA裂解液、蛋白Marker、Bradford蛋白濃度試劑盒(上海碧云天公司),PVDF膜(Immobilon-PSQ公司),Nrf2抗體(批號(hào)AF0639),HO-1抗體(批號(hào)AF5383),NQO1抗體(批號(hào)DF6437),山羊抗兔(批號(hào)GB21303),ML385(批號(hào)S8790)。華佗針、韓式電針儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司),顯微鏡、全能型成像分析系統(tǒng)、PH計(jì)(BIO-RAD公司),灰度分析軟件(Alpha Innotech公司),冰凍切片機(jī)(HM525 NX UV公司),正置熒光顯微鏡(Thermo Scientific公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選擇雄性SD大鼠,平均體重(200±20)g,購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房。飼養(yǎng)房間室內(nèi)溫度22～24 ℃,濕度為60%～70%,光暗周期為12 h,設(shè)置自動(dòng)亮燈時(shí)間段為08:00～20:00、滅燈20:00～8:00,通風(fēng)系統(tǒng)保持良好。待大鼠到達(dá)實(shí)驗(yàn)室,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。定期喂養(yǎng),及時(shí)更換墊料,操作中輕柔抓取和觸摸,使大鼠能夠較早適應(yīng)抓取操作。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè),剔除不合格大鼠,將符合條件的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、嗅三針組、抑制劑組,每組15只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法:大鼠術(shù)前禁食12 h,禁水4 h,根據(jù)體重選用適量的2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。待麻醉后,固定大鼠,消毒,沿頸部中線切開皮膚,用鑷子撕開皮下組織,運(yùn)用玻璃分針分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈、周圍神經(jīng),暴露雙頸總動(dòng)脈。用玻璃分針挑起頸總動(dòng)脈,分離附著的神經(jīng)及膜組織,兩端結(jié)扎,從結(jié)扎處中間剪斷頸總動(dòng)脈,另一側(cè)運(yùn)用同樣操作方法,0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口,用頭孢青霉素沖洗處理,縫合皮膚[2]。VD主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能降低,將認(rèn)知學(xué)習(xí)、空間記憶、空間識(shí)別作為檢測(cè)指標(biāo),采用Morris水迷宮測(cè)試方法,記錄大鼠逃避潛伏期,并與假手術(shù)組做比較,計(jì)算其差值占該鼠逃避潛伏期的比例,比值大于20%為癡呆[3-4]。

1.2.2 針刺干預(yù)方法:針刺干預(yù)采用的是嗅三針帶電治療,簡(jiǎn)稱為“嗅三針”。嗅三針的穴位為雙側(cè)迎香、印堂,根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]大鼠穴位定位圖譜,迎香穴位于大鼠鼻孔外側(cè)上端,有毛與無(wú)毛交界處,印堂穴位于大鼠兩眼眶上緣中點(diǎn)連線與正中線交點(diǎn)。電針方法:迎香穴向內(nèi)上方斜刺2～3 mm,印堂向鼻根平刺2～3 mm;正極接印堂,負(fù)極接一側(cè)迎香,刺激10 min,負(fù)極換接另一側(cè)迎香,刺激10 min。刺激參數(shù):疏密波,頻率為2/15 Hz,強(qiáng)度為1 mA,1次/d,5 d為1個(gè)療程,休息2 d,共4個(gè)療程。運(yùn)用特制的大鼠固定袋、固定架固定實(shí)驗(yàn)大鼠,假手術(shù)組大鼠在相同時(shí)間采用相同程度的捉抓刺激,運(yùn)用固定架固定20 min。

1.2.3 ML385配置及應(yīng)用方法:ML385為Nrf2的靶向抑制劑,配置時(shí)稱取ML385粉末,將其溶解在純DMSO中配制成原液(即母液),母液濃度為40 mg/ml,適當(dāng)加入PBS稀釋成5%溶液,在37 ℃水浴鍋中加熱至完全溶解。按照體積比加入其他溶劑,具體配方為:5%母液、40%的PEG300、5%的Tween80、50%的PBS;配置工作液濃度2 mg/ml。將配置好的ML385腹腔注射于大鼠,用量30 mg/(kg·d)。

1.2.4 各組干預(yù)方法:假手術(shù)組大鼠打開皮膚,暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,縫合;模型組大鼠采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)制備VD模型;嗅三針組大鼠在VD造模基礎(chǔ)上,加嗅三針帶電治療,具體見1.2.2;抑制劑組大鼠在VD造?；A(chǔ)上,加抑制劑ML385,具體用法見1.2.3。

1.2.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠行為學(xué):定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d,正式測(cè)試前1天的測(cè)試為大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練,使大鼠熟悉水迷宮房間環(huán)境,大鼠在水迷宮中游泳探索尋找水下隱匿目標(biāo)平臺(tái),以水池周圍的空間環(huán)境,池壁上不同形狀、顏色標(biāo)識(shí)物作為參照對(duì)象,對(duì)迷宮水下目標(biāo)平臺(tái)空間位置做一對(duì)比識(shí)別記憶,大鼠下水后,快速找到目標(biāo)平臺(tái),記錄找到并登上目標(biāo)平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期。以大鼠逃避潛伏期評(píng)價(jià)不同組別大鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力。

1.2.6 HE染色大鼠海馬CA1區(qū)組織:各組大鼠干預(yù)療程完成后,取材,固定,包埋,切片,經(jīng)過脫蠟,染色,脫水,封片,拍照,顯微鏡下觀察并拍照采集圖像。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)大鼠海馬組織HO-1、NQO1蛋白表達(dá):組織總蛋白提取、測(cè)定和變性,電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫反應(yīng),化學(xué)發(fā)光。

1.2.8 免疫熒光法檢測(cè)海馬CA1區(qū)Nrf2活化情況:將組織切片,脫蠟,抗原修復(fù),封閉,加抗體,DAPI復(fù)染,淬滅,顯微鏡下觀察并拍照采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)比較 假手術(shù)組大鼠狀況良好,反應(yīng)靈敏,毛發(fā)整齊潤(rùn)滑,進(jìn)食、進(jìn)水均正常。模型組、抑制劑組大鼠造模完成后3 d內(nèi)狀況較差,反應(yīng)遲鈍,行動(dòng)緩慢,毛發(fā)無(wú)光澤,進(jìn)食、進(jìn)水較少,3 d后狀態(tài)逐漸恢復(fù),行動(dòng)逐漸敏捷。嗅三針組大鼠造模完成后3 d內(nèi)狀況較差,似于模型組,15 d后與抑制劑組、模型組大鼠比較,精神狀態(tài)明顯較好。

2.2 各組大鼠定位航行、空間探索軌跡比較 見圖1、2。各組大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期、空間探索軌跡不同。模型組、抑制劑組大鼠尋找目標(biāo)平臺(tái)游泳的距離大于假手術(shù)組、嗅三針組;空間探索試驗(yàn)結(jié)果中,假手術(shù)組、嗅三針組穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù)、平臺(tái)區(qū)游泳距離明顯多于模型組、抑制劑組。

圖2 各組大鼠空間探索軌跡比較

2.3 各組大鼠海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)比較 見圖3。顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞,假手術(shù)組CA1區(qū)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列整齊,輪廓清晰;模型組細(xì)胞排列紊亂,間隙增大,壞死數(shù)量增多,核固縮增多;與模型組比較,嗅三針組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰,排列較整齊,核仁清晰;與嗅三針組比較,抑制劑組細(xì)胞排列不齊,數(shù)目減少,分布不均,核固縮增多,邊界不清晰。

2.4 各組大鼠 Nrf2蛋白表達(dá)比較 見圖4。顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)情況,假手術(shù)組有少量表達(dá),模型組、抑制劑組有部分陽(yáng)性表達(dá),嗅三針組有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)各組圖像進(jìn)行對(duì)比分析,與假手術(shù)組比較,模型組海馬CA1區(qū)Nrf2蛋白增加;與模型組相比,嗅三針組Nrf2蛋白增加;與抑制劑組相比,嗅三針組Nrf2蛋白表達(dá)增加。

2.5 各組大鼠海馬組織HO-1、NQO1蛋白表達(dá)比較 見表1(圖5)。假手術(shù)組大鼠海馬組織HO-1、NQO1有一定的表達(dá),而模型組表達(dá)高于假手術(shù)組,這是機(jī)體自我保護(hù)作用。嗅三針組大鼠海馬組織HO-1、NQO1表達(dá)高于模型組、抑制劑組,這是在針刺干預(yù)下保護(hù)機(jī)制的增強(qiáng)表現(xiàn)。

表1 各組大鼠HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖5 各組大鼠海馬組織HO-1、NQO1蛋白電泳圖

3 討 論

《素問·四氣調(diào)神論篇》:“是故圣人不治已病治未病,不治已亂治未亂,此之謂也”,明確提出了要把疾病控制在萌芽階段,阻止或延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程,即治未病理念[6-7]。本團(tuán)隊(duì)學(xué)術(shù)帶頭人牛文民、劉智斌教授多年來(lái)致力于癡呆研究,基于治未病的“既病防變”理論,運(yùn)用針灸干預(yù)癡呆早期出現(xiàn)的主要癥狀,以嗅覺功能障礙為切入點(diǎn),最終延緩癡呆的發(fā)病進(jìn)程,并命名該治療方法為“嗅三針”療法[8-9]。

“嗅三針”由兩側(cè)迎香、印堂組成,印堂在鼻根部,迎香在鼻翼兩側(cè),二穴均能治療鼻部疾病?！鹅`樞·脈度》:“肺氣通于鼻,肺和則鼻能知臭香矣?！薄夺t(yī)林改錯(cuò)·腦髓說(shuō)》曰:“靈機(jī)記性在腦者,因飲食生氣血,長(zhǎng)肌肉,精汁之清者化而為髓,由脊骨上行。入腦,名曰腦髓……鼻通于腦,所聞香臭歸于腦。腦受風(fēng)熱,腦汁從鼻流出,涕濁氣臭,名曰腦漏……鼻微知香臭”[10]?！侗静菥V目·辛夷條》有云:“鼻氣通于天。天者,頭也、肺也?！庇纱丝梢钥闯?古人對(duì)于鼻和腦部結(jié)構(gòu)功能的認(rèn)識(shí)和理解,腦功能的正常與否,能夠影響鼻識(shí)別香臭之氣。同時(shí),鼻能將所接觸的信息感知、感傳于腦,鼻與腦的這種特殊關(guān)系,為從嗅覺治療腦部疾病提供一定理論依據(jù)。

運(yùn)用嗅三針治療癡呆早期出現(xiàn)的嗅覺功能減退,或是嗅覺障礙,發(fā)現(xiàn)其對(duì)癡呆出現(xiàn)的認(rèn)知障礙也有較好改善作用[11-12]。迎香屬手陽(yáng)明大腸經(jīng)與足陽(yáng)明胃經(jīng)交會(huì)穴,刺之可宣通陽(yáng)明而達(dá)到開鼻竅之功。印堂為督脈穴,《素問》曰:“督脈者……上額交顛上,入絡(luò)腦”。督脈為“陽(yáng)脈之?！?連接腦之陽(yáng)、全身之陽(yáng),刺之可調(diào)理督脈而達(dá)到醒腦之效。嗅三針既能治療鼻部嗅覺功能障礙,又對(duì)認(rèn)知障礙有改善作用。因此,將該針法凝煉為“感知一體,嗅腦同治”,總結(jié)其機(jī)制為“通督宣陽(yáng),開竅醒神”,二穴功能主治與嗅覺系統(tǒng)密切相關(guān),形成嗅三針的理論依據(jù)[13-15]。

慢性低灌注導(dǎo)致的腦組織損傷是VD發(fā)病的主要病因,腦在低灌注缺血缺氧過程中,氧化應(yīng)激反應(yīng)是其最早出現(xiàn)的核心事件之一[16-17]。腦缺血缺氧時(shí)產(chǎn)生的毒性物質(zhì),對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器均產(chǎn)生破壞作用,增加了氧化應(yīng)激反應(yīng)程度,誘導(dǎo)線粒體穩(wěn)態(tài)失衡,最終引起海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡,引起學(xué)習(xí)、辨識(shí)、記憶等認(rèn)知功能障礙[18-19]。氧化應(yīng)激與VD發(fā)病過程密切相關(guān),Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活,活化Nrf2積聚游離入核,啟動(dòng)抗氧化反應(yīng),調(diào)節(jié)下游抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá),調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng),介導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[19]。Nrf2能夠調(diào)動(dòng)下游HO-1、NQO1等抗氧化酶活性,促進(jìn)多種抗氧化還原酶表達(dá),實(shí)現(xiàn)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。本研究中,嗅三針改善了VD大鼠海馬CA1區(qū)病理組織形態(tài),而運(yùn)用Nrf2抑制劑后,該作用明顯減弱,與模型組比較,嗅三針明顯提高了Nrf2表達(dá)量,其下游HO-1、NQO1蛋白表達(dá)明顯增多,Nrf2抑制劑組Nrf2的陽(yáng)性細(xì)胞率減少,其下游HO-1、NQO1蛋白表達(dá)明顯減少?？梢?Nrf2的激活在嗅三針治療中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述,治療VD早期出現(xiàn)嗅覺障礙的嗅三針能夠改善大鼠認(rèn)知功能障礙,通過激活Nrf2,調(diào)節(jié)下游HO-1、NQO1等蛋白表達(dá),對(duì)抗VD大鼠出現(xiàn)的氧化應(yīng)激,改善其認(rèn)知功能狀態(tài),這可能是嗅三針治療VD的重要機(jī)制。