趙小云,李心儀,周春祥

(南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210046)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病,多表現(xiàn)為記憶力衰減、認(rèn)知及語言功能障礙、性格及行為學(xué)改變等[1]。越來越多的證據(jù)表明,神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞,不僅在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元可塑性和再生中也起著重要作用,也是免疫防御的第一道防線。當(dāng)產(chǎn)生炎癥刺激性損傷時,小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型被激活來修復(fù)損傷,一旦這個過程無效,就會轉(zhuǎn)變?yōu)镸1表型,對神經(jīng)元造成損害[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞從抗炎表型轉(zhuǎn)換到促炎表型,啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵是增加IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子分泌[3]。中醫(yī)藥治療AD歷史悠久,具有獨特優(yōu)勢,具有多層次、多靶點的獨特優(yōu)勢,有良好的抗炎抗氧化功能且毒性明顯小于化學(xué)藥物[4]。近年研究發(fā)現(xiàn),多種中藥制劑及成分通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,或逆轉(zhuǎn)其被激活表型,達(dá)到改善神經(jīng)炎癥目的,產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[5-8]。本科研團(tuán)隊前期研究證實,苓桂術(shù)甘湯可顯著抑制由Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α過度表達(dá),發(fā)揮良好的抗炎作用,且其他研究也表明多種方劑具有保護(hù)神經(jīng)作用[6-10]?；诖?本次將重點觀察在苓桂術(shù)甘湯干預(yù)下,小膠質(zhì)細(xì)胞由M2向M1極化過程。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株:BV2細(xì)胞株(貨號Q0397,中喬新舟生物科技有限公司)。

1.1.2 SD大鼠:SPF級成年雄性SD大鼠共12只,體重220～250 g購自于杭州醫(yī)學(xué)院,許可證號[SCXK(蘇)2017-0001]、動物合格證號(201909302)。動物使用經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),倫理號(202004A031)。SD大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物房屏障環(huán)境中,實驗操作符合《實驗動物管理條例》要求,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.1.3 主要藥品及試劑:不完全DMEM低糖培養(yǎng)液含雙抗(貨號KGM31600-500);胎牛血清(批號AB-FBS0500);CCK-8試劑盒(批號C0038);抗熒光淬滅封片液含DAPI(批號P0131-25ml);LPS(貨號L8880-100mg);二甲基亞砜DMSO(批號D8371);鹽酸米諾環(huán)素(批號IM0450-50mg);一氧化氮(NO)測定試劑盒(批號A012-1-2);Goat Anti-Mouse IgG H&L/Alexa Fluor 594 antibody(批號bs-0296G-AF594);Goat Anti-rabbit IgG H&L/Alexa Fluor 488 antibody(批號bs-0295G-AF488);CD206 Polyclonal Antibody(批號18704-1-AP);COX2/Cyclooxygenase 2/PTGS2 Monoclonal Antibody(批號66351-1-Ig );24孔板圓形細(xì)胞爬片(批號WHB-24-CS)。

1.1.4 主要儀器:細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號MSO-20AIC)、超凈工作臺(型號SW-CJ-JF)、倒置顯微鏡(型號Ts 100-F)、熒光顯微鏡(型號Axio Scope A1)、醫(yī)用低溫離心機(型號Sorvall ST 16R)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(型號RE52-99)、小動物麻醉機(型號R74661-016)、全自動酶標(biāo)儀(型號ELX800)。

1.2 實驗方法

1.2.1 苓桂術(shù)甘湯含藥血清制備:茯苓40 g,桂枝30 g,白術(shù)、炙甘草各20 g,購自于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。將220 g中藥生藥放入調(diào)溫電熱器大燒瓶中,加入1100 ml超純水,大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煮30 min后倒出藥液,用同樣方法重復(fù)1次,將兩次藥液混合后,放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)將其濃縮至220 ml,使藥物終濃度為1 g/ml。將成年雄性SD大鼠12只隨機分為兩組,即空白組、苓桂術(shù)甘湯組,每組6只。兩組劑量選擇依據(jù)《傷寒論》[11]原文、2020年版《中華人民共和國藥典:一部》[12]、《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》規(guī)定劑量進(jìn)行換算,確定大鼠等效劑量是1.2 g/kg,苓桂術(shù)甘湯組大鼠以等效劑量4倍灌胃,空白組大鼠用等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。兩組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,再灌胃給藥,灌胃前稱取大鼠體重并標(biāo)記,各給藥組2次/d,連續(xù)灌胃7 d。第8天在灌胃1.5 h后進(jìn)行腹主動脈取血,用異氟烷吸入法麻醉SD大鼠,收集其腹主動脈血液,全血靜置3 h后于離心機4 ℃下,3500 r/min、10 min,取上清血清,于水浴鍋56 ℃水浴滅活30 min,0.22 μm孔過濾膜過濾2次,-80 ℃保存?zhèn)溆?。兩組對比來看,血清未對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.2.2 LPS溶液制備:稱取LPS粉末1 mg,加入1 ml的PBS溶液,配置成濃度為1 G/L的LPS母液,用一次性濾菌器過濾后放于EP管中,于-20 ℃保存。使用前用PBS進(jìn)行稀釋,使其終濃度為1 μg/ml。

1.2.3 鹽酸米諾環(huán)素溶液制備:稱取鹽酸米諾環(huán)素粉末,用經(jīng)過高壓滅菌0.1 mol /L的PBS(pH7.4) 緩沖液溶解,使其最終濃度為100 μmol/L。

1.2.4 分組與模型制備:將培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組、模型組、米諾環(huán)素組、苓桂術(shù)甘湯組。除對照組外,其余各組均加入濃度為1 μg/ml的LPS,制成細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型。

1.2.5 給藥方法:取生長狀態(tài)良好的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,以每孔4×104個/ml 細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板中,實驗分組同上,每組5個復(fù)孔,每孔加入100 μl的全培,培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。吸出原有培養(yǎng)液,每孔加入100 μl的PBS緩沖液清洗兩遍,每孔加入100 μl單培,米諾環(huán)素組加入25 μl米諾環(huán)素,苓桂術(shù)甘湯組加入預(yù)實驗篩選出25 μl苓桂術(shù)甘湯含藥血清(1.2.1所得)預(yù)保護(hù)12 h,除對照組外,每組加入濃度為1 μg/ml的LPS 10 μl,對照組不做任何處理,培養(yǎng)24 h。

1.2.6 顯微鏡下觀察BV2細(xì)胞形態(tài):取生長狀態(tài)良好的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,以4×104/孔接種于96孔板中,分為對照組、模型組、苓桂術(shù)甘湯組,每組設(shè)4個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后,苓桂術(shù)甘湯組加入25 μl苓桂術(shù)甘湯含藥血清預(yù)保護(hù)12 h,除對照組外,每組加入濃度為 1 μg/ml 的 LPS 10 μl,培養(yǎng)24 h后觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.7 硝酸還原酶法檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平:實驗分組與藥物干預(yù)方法同上,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,按照NO檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,于波長550 nm、光徑0.5 cm處測定各管吸光度值。

1.2.8 ELISA法檢測BV2細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、IL-10 含量:實驗分組與藥物干預(yù)方法同上,收集各組細(xì)胞的細(xì)胞上清液,按照TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作,使用酶標(biāo)儀于波長405 nm處依次測出各組吸光度值。

1.2.9 免疫熒光染色法檢測BV2細(xì)胞M1型標(biāo)志物COX-2及M2型標(biāo)志物CD206表達(dá):將生長狀態(tài)良好的BV2細(xì)胞取出經(jīng)消化離心后,加入2 ml全培制成2×104/ml細(xì)胞懸液待用,在空24孔板中每孔加入2 μl培養(yǎng)基后,放入圓形細(xì)胞爬片,使細(xì)胞爬片與24孔板緊密貼合,每孔加入100 μl細(xì)胞懸液,800 μl全培,培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁,實驗分組及實驗處理同上,細(xì)胞貼壁80%后吸出全培,每孔使用PBS清洗3遍,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS清洗3遍,免疫染色通透液于室溫下孵育10 min以完全覆蓋細(xì)胞爬片為度,PBS清洗3遍。室溫下用5%的BSA溶液封閉30 min。加入鼠抗COX-2抗體(1∶800),兔抗CD206抗體(1∶1000),以一抗溶液完全覆蓋細(xì)胞爬片為度,于冰箱4 ℃下過夜。復(fù)溫后吸出一抗,用10%TBST溶液清洗3次,每孔滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的Goat Anti-rabbit IgG(1∶1000) 和Alexa Fluor 594標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG(1∶1000)熒光二抗溶液以完全覆蓋細(xì)胞爬片為度,于搖床上室溫避光孵育1 h。吸出二抗,用10%TBST溶液清洗3次,滴加抗熒光淬滅封片液(含DAPI)于載玻片上,將細(xì)胞爬片細(xì)胞面浸沒于封片液內(nèi),覆蓋蓋玻片固定,期間避免產(chǎn)生氣泡,最后于正置熒光顯微鏡下放大200倍,觀察并采集圖片。

2 結(jié) 果

2.1 各組含藥血清對BV2細(xì)胞活力影響比較 在分別使用藥物劑量為10、20、25、30 μl苓桂術(shù)甘湯含藥血清干預(yù)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞,其中25 μl苓桂術(shù)甘湯對BV2細(xì)胞活力最強,當(dāng)藥物劑量增加至30 μl時,細(xì)胞活力明顯下降,因此選用藥物劑量為25 μl苓桂術(shù)甘湯含藥血清用于后續(xù)實驗。

2.2 各組BV2細(xì)胞的形態(tài)比較 見圖1。對照組BV2細(xì)胞為靜息狀態(tài),胞體較小為圓形,整體明亮,邊緣清晰;模型組的BV2細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后產(chǎn)生明顯的形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞胞體變大,細(xì)胞突觸變短變粗,突觸數(shù)量變多,呈現(xiàn)出典型的阿米巴樣改變;米諾環(huán)素組、苓桂術(shù)甘湯組給予含藥血清24 h后,部分BV2細(xì)胞的胞體脹大恢復(fù),突觸消失,胞體變圓,且苓桂術(shù)甘湯組細(xì)胞形態(tài)更趨近于對照組。

圖1 各組BV2細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較(倒置顯微鏡,圖標(biāo)尺=50 μm)

2.3 各組BV2細(xì)胞NO釋放情況比較 硝酸還原酶法檢測BV2細(xì)胞上清中NO含量水平,見表1。模型組BV2細(xì)胞釋放的NO高于對照組,苓桂術(shù)甘湯組BV2細(xì)胞上清中的NO含量低于模型組(P<0.05)。

表1 各組BV2細(xì)胞NO釋放情況比較

2.4 各組BV2細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10分泌量比較 見表2。ELISA法檢測BV2細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抗炎因子IL-10的分泌量。模型組的炎癥因子IL-1β、IL-6高于對照組,抗炎因子IL-10低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。米諾環(huán)素組、苓桂術(shù)甘湯組的TNF-α、IL-1β、IL-6含量低于模型組 ,而IL-10高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 各組BV2細(xì)胞M1型向M2型轉(zhuǎn)化比較 免疫熒光化學(xué)染色法觀察四組小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)志物COX-2及M2型標(biāo)志物CD206表達(dá),見圖2。對照組BV2細(xì)胞以M2型標(biāo)志物CD206為主,表明其處于靜息態(tài);模型組BV2細(xì)胞以M1型標(biāo)志物COX-2為主,CD206的熒光反應(yīng)則降低;米諾環(huán)素組、苓桂術(shù)甘湯組的M1型標(biāo)志物COX-2明顯減少,M2型標(biāo)志物CD206升高。

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是來自于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中胚層的巨噬細(xì)胞,歸屬于免疫系統(tǒng)。一般來說,小膠質(zhì)細(xì)胞激活和TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子釋放必然伴隨在神經(jīng)炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中,小膠質(zhì)細(xì)胞在健康大腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中處于靜止?fàn)顟B(tài)(M0型),起到對周圍組織的“免疫監(jiān)視”[13]。出現(xiàn)病理炎癥刺激時,小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形變并活化,釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞炎癥因子,參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展[14]。炎癥刺激時小膠質(zhì)細(xì)胞由M0轉(zhuǎn)向M2型,釋放抗炎因子IL-10等,發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用,但小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)激活會使抗炎表型M2轉(zhuǎn)變到促炎表型M1型,這一轉(zhuǎn)變過程同時伴隨著過量TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子釋放及氧化應(yīng)激,對神經(jīng)細(xì)胞造成損傷,而這類炎癥因子被證明與多種腦疾病相關(guān)[14-15]。促炎細(xì)胞因子iNOS會誘使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量NO,從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[3]。因此可通過檢測細(xì)胞上清中NO含量判斷BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型建立的成功與否。更多實驗數(shù)據(jù)表明,小膠質(zhì)細(xì)胞被過度激活至M1型,會產(chǎn)生對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷,加重AD病理。M1、M2型的小膠質(zhì)細(xì)胞分別存在不同標(biāo)志物,COX-2是M1 型的標(biāo)志物,處于M1型的小膠質(zhì)細(xì)胞會分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6 等致炎因子和NO,介導(dǎo)神經(jīng)炎癥,產(chǎn)生神經(jīng)毒性;CD206是M2 型標(biāo)志物,處于M2型的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌 IL-10 等抗炎因子,可進(jìn)行抗炎修復(fù)[16]。因此通過藥物干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活表型,減少 M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞增多,逆轉(zhuǎn)部分小膠質(zhì)細(xì)胞由M2轉(zhuǎn)向M1,使其更多存在于M2型,可能會對修復(fù)神經(jīng)元損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷起到積極效果[17]。體內(nèi)和體外研究中,實驗性誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)保護(hù)性表型M2極化,可顯著緩解AD模型中的神經(jīng)炎癥反應(yīng),改善病理損傷[18-20]。因此,控制小膠質(zhì)細(xì)胞極化可能是治療AD靶點。

中醫(yī)學(xué)并沒有與AD完全對應(yīng)的病癥名稱,本病的主要臨床表現(xiàn)包括健忘、智力低下、呆傻愚笨等,多歸屬于中醫(yī)“癡呆”“健忘”“善忘”等范疇。《醫(yī)林改錯》記載:“靈機記性在腦者,因飲食生氣血,長肌肉,精汁之清者,化而為髓,由脊骨上行入腦,名曰腦髓”[21]。指出年齡的增長,是臟腑功能減弱,神智異常的主要病因,年齡增長,脾氣也隨之虛弱,氣血化生不足,無法充養(yǎng)腦髓,腦絡(luò)失養(yǎng),神機失用,同時脾失運化,易內(nèi)生痰液,痰濁上犯,蒙蔽清竅,可見頭暈神疲,反應(yīng)呆鈍,或終日無語,產(chǎn)生神志的異常改變[22]。

脾為后天之本,氣血生化之源。脾可運化水液,化生水谷精微并運輸至全身,脾氣升清,將水谷精微上輸心肺,下輸膀胱;脾胃為氣機升降的樞紐;且脾藏意在志為思。因此,脾與人的思想記憶有著密切聯(lián)系。脾胃健運,方可使“清陽出上竅,濁陰出下竅”[23]。脾氣虛弱升清受阻,亦會導(dǎo)致胃降濁功能受損,清陽不升濁陰不降,上不能濡養(yǎng)清竅,且濁氣上逆,會致清竅失養(yǎng),出現(xiàn)神疲、頭昏等癥狀?！端氖バ脑础费?“己土東升……若輪樞莫運,升降失職,喜怒不生,悲恐弗作,則土氣凝滯,而生憂思”[24]。脾胃氣機升降功能與神智功能密切相關(guān)。脾主運化水液,發(fā)揮著對水液吸收、傳輸、布散功能?！帮嬋胗谖?游溢精氣,上輸于脾,脾氣散精,上歸于肺,通調(diào)水道,下輸膀胱”[25],指的是飲食的水谷經(jīng)脾轉(zhuǎn)化為津液向四周分散輸布至其他臟腑,濡養(yǎng)組織器官,上達(dá)肺衛(wèi),下達(dá)膀胱,經(jīng)代謝后的水液通過汗液、尿液排出體外,維持人體水液代謝平衡。脾性喜燥惡濕,若脾為濕困,影響脾氣運化功能,水液正常代謝及精微輸布失常,則會積生痰飲?！毒霸廊珪费?“蓋痰涎之化,本因水谷,使脾強胃健如少壯者流,則隨食隨化,皆成血氣,焉得留而為痰,惟其不能盡化,而十留一二,則一二為痰矣。十留三四,則三四為痰矣……而痰涎日多,由其故,正以無氣,不能運化,愈虛則痰盛也”[26]?！夺t(yī)宗必讀》云:“脾為生痰之源,治痰不理脾胃,非其治也”,指出從脾論治痰飲是治痰之要[27]。因此,從痰飲論治AD也要兼顧脾臟功能的恢復(fù),是治病必求本的理念。顧保群[28]認(rèn)為,中醫(yī)痰飲的本質(zhì)可涉及諸多病理學(xué)過程,炎癥液體滲出、細(xì)胞和組織變性、壞死為基礎(chǔ)的變質(zhì),多呈現(xiàn)為液態(tài)的“痰飲”,通過人體孔竅排出體外,形成所謂“有形之痰飲”。隨著LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1激活產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β、IL-6等神經(jīng)炎癥因子不斷增加和堆積,均屬于體內(nèi)有形的病理物質(zhì),酷似痰飲中有形之痰的病理基礎(chǔ),因而可歸屬于“痰飲”范疇。積生痰飲,神機失用是AD的重要病理。AD整個疾病過程的生命活動呈下降趨勢,類屬“陰病”,癡呆中的痰飲為病,亦為陰邪,從其基本屬性上看,二者相同。AD癥狀多以神志異常為主,而痰飲擅長蒙蔽清竅,擾亂神明致神志不清,因此二者的致病要點相符。AD還伴有多處并發(fā)癥和各種不可預(yù)測的臨床表現(xiàn),痰飲致病廣泛,病癥繁雜,“痰飲善動不局,隨氣機升降,內(nèi)而臟腑經(jīng)絡(luò),外而皮肉筋骨,周身上下無所不至”“痰之為物,隨氣升降,無處不到”,二者致病特點相符[26]。同時,AD病程早期隱匿性強,不易診斷,且疾病進(jìn)展過程緩慢,與痰飲致病病勢纏綿,病程較長類似?！疤禋庾钍?呆氣最深”[29],可見痰飲的蓄積程度與AD病程進(jìn)展相關(guān)?？傊?中醫(yī)認(rèn)為AD的病機多為虛實夾雜,常見于氣血陰陽失調(diào)、臟腑虧虛,伴有瘀血、痰濕等病理產(chǎn)物[30],根據(jù)歷代醫(yī)家對AD相關(guān)臨床癥狀及病因病機的描述和分析,結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)藥對AD治療效果的實驗發(fā)現(xiàn),痰飲以年齡增長,臟腑虛衰為本,水液痰濕等停聚為標(biāo)。

“病痰飲者,當(dāng)以溫藥和之?！避吖鹦g(shù)甘湯出自張仲景《傷寒雜病論》,由茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草四味中藥組成。原方以茯苓為君,利水滲濕,健脾寧心;桂枝溫經(jīng)通陽,化氣利水;白術(shù)補脾化濕;甘草甘平,補脾益氣,調(diào)和諸藥?！督饏T要略·痰飲咳嗽病脈證治》云:“心下有痰飲,胸脅支滿,目眩,苓桂術(shù)甘湯主之”[31]。神經(jīng)炎癥伴隨著的炎癥因子釋放,這與中醫(yī)痰飲范圍中的“有形之痰”相似,苓桂術(shù)甘湯是治療脾虛痰飲的基礎(chǔ)方劑,該方通過減少多種炎癥因子分泌,發(fā)揮抗炎和保護(hù)神經(jīng)作用。多項研究表明,白術(shù)內(nèi)酯I、桂皮醛、18β-甘草次酸等均有減少炎癥因子分泌,抗炎抗氧化功能及神經(jīng)保護(hù)作用,通過MAPK或NF-κB通路發(fā)揮對AD的治療作用[32-34]。

綜上,苓桂術(shù)甘湯含藥血清可以顯著降低經(jīng)LPS激活的BV2細(xì)胞NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子釋放,增加抗炎因子IL-10分泌,逆轉(zhuǎn)LPS激活的BV2細(xì)胞由M2向M1型轉(zhuǎn)變,促進(jìn)其向M2型轉(zhuǎn)變,減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng),是治療AD的一種策略[35-36]。因本實驗只是在體外細(xì)胞模型中進(jìn)行,仍需體內(nèi)驗證,且本實驗采用的苓桂術(shù)甘湯含藥血清干預(yù)BV2細(xì)胞,也需開展更多檢測驗證其功效。