鄭雨微 于浪潮 夏士杰 何雨曦 呂紅明

(黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院,黑龍江 大慶 163319)

氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是由于動物機體活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與抗氧化劑的防御之間的失衡,而致使組織器官損害的過程[1]。近年來,多項研究指出氧化應(yīng)激嚴重影響雞的繁殖性能,破壞仔豬腸道健康并參與奶牛多種營養(yǎng)代謝性疾病(如酮病、脂肪肝、低鈣血癥及乳房炎等)的進程[2-4]。另外,氧化應(yīng)激還能引起動物下丘腦神經(jīng)元損傷,抑制動物采食,降低其生產(chǎn)性能[5]。研究表明,5-羥色胺(5-HT)注射于腦室可激活細胞內(nèi)的NADPH氧化酶,引起下丘腦ROS含量增加,進而促使動物采食量下降[6]。由此提示,探究增強動物機體的抗氧化能力、清除體內(nèi)氧自由基及改善腦組織氧化損傷,可能是提高畜禽采食量及生產(chǎn)性能的一種有效策略。

核因子紅細胞2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)是一種由7個結(jié)構(gòu)域組成的重要核轉(zhuǎn)錄因子,其主要功能參與調(diào)節(jié)機體氧化還原。研究表明,Nrf2激活后可抑制過多的ROS聚集以平衡細胞的氧化應(yīng)激,減輕機體組織氧化損害,改善神經(jīng)毒素導致的神經(jīng)細胞元損傷[7-8]。在正常情況下,Nrf2和Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)作為復(fù)合體存在于細胞質(zhì)中,Keap1是Nrf2的天然抑制劑。然而,氧化刺激或小分子化合物能導致其構(gòu)象變化使Keap1的降解,進而使Nrf2積累并轉(zhuǎn)移到細胞核,激活Nrf2調(diào)控的下游抗氧化基因的表達,如血紅素氧合酶-1(HO-1)[9]。大量研究表明,天然植物化合物可通過激活Nrf2信號通路緩解多種刺激物導致的神經(jīng)元細胞損傷[10]。Wei等[11]表明鞣花酸可通過激活Nrf2信號保護多巴胺神經(jīng)元免受魚藤酮誘導的神經(jīng)毒性。Wruck等[12]發(fā)現(xiàn)木犀草素通過依賴ERK介導的Keap1/Nrf2-ARE途徑保護大鼠PC12和C6細胞免受1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenyl-pyridinium,MPP+)誘導的神經(jīng)損傷。

異鼠李素(Isorhamnetin,ISO)是一種存在于沙棘果實中的天然黃酮類化合物,具有良好的抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護作用[13]。有研究表明,異鼠李素通過增強細胞的抗氧化能力可有效緩解過氧化氫(H2O2)誘導的人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT)氧化損傷[14]。譚會潔等[15]揭示異鼠李素通過PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號通路可顯著減輕魚藤酮誘導的PC12細胞損傷。6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)是一種神經(jīng)毒性化合物,經(jīng)常用于體外誘導腦組織氧化損傷的模型[16]。異鼠李素能否通過上調(diào)Keap1/Nrf2抗氧化信號通路保護6-OHDA導致的神經(jīng)元細胞損傷,尚未有相關(guān)研究。因而本研究利用6-OHDA誘導人神經(jīng)元細胞系(SH-SY5Y)的神經(jīng)毒性,探究異鼠李素對神經(jīng)細胞元氧化損傷的保護作用,為氧化應(yīng)激引發(fā)的動物腦組織損傷的防治提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 試劑和試驗材料

人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;GSH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;異鼠李素(ISO),純度>98%,由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供(成都,中國);6-羥基多巴胺(6-OHDA)和二甲亞砜(DMSO)均由Sigma-Aldrich公司提供。試驗所涉及的抗體主要購自Abcam(Cambridge MA USA)公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶由賽默飛世爾生物化學制品(美國)有限公司生產(chǎn)。除非有特別地說明,其他試劑均由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)提供。

1.2 SH-SY5Y神經(jīng)元細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(其中含1%谷氨酰胺、3 mmol/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、0.1%β-巰基乙醇、100 U/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素),并放置在濕度適宜含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 SH-SY5Y神經(jīng)元細胞活力檢測

CCK-8試劑盒用于測定ISO對6-OHDA誘導SH-SY5Y神經(jīng)元細胞活力的影響。首先,用胰酶消化并在對數(shù)期生長的SH-SY5Y細胞離心后,鋪于96孔的培養(yǎng)板中,細胞計數(shù)每孔為5×103cells/孔,培養(yǎng)時間為24 h。然后,利用不同劑量的6-OHDA(50、75、150、300和600 μmol/L)刺激細胞24 h,以篩選最適合的6-OHDA刺激劑量。其次,在用6-OHDA(300 μmol/L)處理之前1 h,加入5、10和20 μmol/L的ISO,再共同處理24 h。然后,在每個小孔中添加10 μL CCK-8,放置于培養(yǎng)皿中2 h,最后用酶標儀檢測450 nm下的吸光值,檢測細胞活性。

1.4 SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的細胞凋亡檢測

Hoechst 33342對細胞核進行染色,用于評估ISO對6-OHDA誘導SH-SY5Y神經(jīng)元細胞活力的影響。首先,用胰酶消化并在對數(shù)期生長的SH-SY5Y細胞離心后,鋪于12孔的培養(yǎng)板中,細胞計數(shù)每孔為2.5×105cells/孔,培養(yǎng)時間為24 h。其次,在用6-OHDA(300 μmol/L)處理之前1 h,加入5、10和20 μmol/L的ISO;再共同處理18 h后,在培養(yǎng)基中加入Hoechst 33342(2 μL/孔)作用15 min后,使用5 mL的固定液,固定10 min。最后,采用無菌的PBS液沖洗3遍后,用不同倍數(shù)的熒光顯微鏡觀察細胞凋亡程度。

1.5 SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的氧化損傷檢測

活性氧(ROS)探針檢測ISO對6-OHDA誘導SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的氧化損傷的影響。首先,將SH-SY5Y細胞接種在96孔板(2×103cells/孔)中24 h。然后,將細胞置于不同濃度的ISO(5、10和20 μmol/L)中18 h,以及6-OHDA(300 μmol/L)中3 h,將細胞與50 mmol/L DCFH-DA孵育30 min,用檢測器分別在激發(fā)和發(fā)射波長485和535 nm處評估DCF熒光強度,并使用熒光顯微鏡拍照。

1.6 SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的GSH含量檢測

為檢測細胞內(nèi)還原谷胱甘肽(GSH)水平,評估ISO的抗氧化活性。首先,將SH-SY5Y神經(jīng)元細胞在75 mm3培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,然后將細胞在不同濃度的ISO處理18 h,隨后接受6-OHDA(300 μmol/L)3 h的刺激。根據(jù)試劑盒說明,利用GSH檢測試劑盒對細胞內(nèi)GSH水平進行量化,使用酶標儀測定405 nm處吸光度。

1.7 SH-SY5Y神經(jīng)元細胞中Keap1的過表達

用于擴增Keap1全編碼區(qū)序列的引物如下:5′-GCT CTA GAG CAT GCA GCC AGA TCC CAG GC-3′(Forword)和5′-CGC GGA TCC GCG TCA ACA GGT ACA GTT CTG CTG G-3′(Reverse)。然后,PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和BamHI酶切后克隆到表達載體VR1012中。用Viafect轉(zhuǎn)染試劑(Promega)將重組載體VR1012-Keap1轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y神經(jīng)元細胞系,以實現(xiàn)Keap1的過量表達[17]。

1.8 JC-1染色法檢測SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的線粒體損傷

線粒體膜電位(ΔΨ)由JC-1染色測定。首先,SH-SY5Y細胞在12孔板中培養(yǎng)(2.5×105cells/孔);接著用ISO(20 μmol/L)處理細胞18 h后,再用6-OHDA(300 μmol/L)處理3 h。最后,利用JC-1(10 μg/mL)染料在37 ℃,避光,孵育20 min,再使用熒光顯微鏡拍照、保存。

1.9 Western blot分析SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白、凋亡蛋白水平

收集處理好的細胞,加入混合蛋白酶抑制劑(10 μmol/L)和蛋白裂解液(RIPA),充分震蕩后置于4 ℃冰箱中,裂解30 min。然后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清。用BCA試劑測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度,根據(jù)上樣量加樣相同數(shù)量的蛋白質(zhì)。隨后,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(Nrf2抗體:A16737、Keap1抗體:ab66620、NQO1抗體:ab80588、HO-1抗體:ab68477、GCLC抗體:ab207777、GCLM抗體:ab126704、Caspase-3抗體:300968、Bax抗體:ab32503、Bcl-2抗體:ab59348、β-actin抗體:60008-1-Ig及Lamin B抗體:SGA1910)和二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗)孵育后。化學發(fā)光劑ECL,在顯影儀器上顯影,并使用Image Lab 4.0.1軟件分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有試驗都進行獨立3次重復(fù)。所有數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0(IBM)軟件進行分析與統(tǒng)計,結(jié)果用Mean±SD表示。組間比較采用“One-way ANOVA”檢驗,多重比較實用LSD方法。并以P<0.05代表差異性顯著,P<0.01代表差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISO改善6-OHDA誘導的SH-SY5Y神經(jīng)元細胞活性

本研究結(jié)果顯示:不同濃度的6-OHDA(50、75、150、300和600 μmol/L)刺激SH-SY5Y細胞24 h均能顯著降低細胞的存活率,其中300 μmol/L細胞活性接近50%(圖1(a))。因此,300 μmol/L被選為后續(xù)試驗的最佳刺激劑量。同時,研究結(jié)果表明了ISO(5、10和20 μmol/L)處理細胞可有效增加300 μmol/L 6-OHDA降低的細胞存活率且呈劑量依賴性,其中ISO(20 μmol/L)治療組細胞存活率高達70%,而單獨使用ISO(20 μmol/L)處理組細胞活性無明顯下降(圖1(b))。此外,通過細胞形態(tài)學觀察,6-OHDA可誘發(fā)明顯的形態(tài)學變化,導致細胞損傷和萎縮、促進細胞死亡,進而顯著減少細胞的數(shù)量,而經(jīng)ISO(5、10和20 μmol/L)處理能不同程度地改善細胞損傷和增多細胞數(shù)量(圖1(c))。

2.2 ISO抑制6-OHDA誘導的SH-SY5Y神經(jīng)元細胞凋亡

如圖2(a)～(b)所示:與空白組(Control)相比,300 μmol/L的6-OHDA能顯著誘導細胞凋亡(凋亡細胞的細胞核呈致密濃染),細胞凋亡率為40%左右,而經(jīng)ISO(5、10和20 μmol/L)處理后SH-SY5Y凋亡細胞呈劑量依賴性減少,其中高劑量的凋亡細胞降低至15%左右。同時,凋亡蛋白的檢測結(jié)果顯示:6-OHDA(300 μmol/L)可顯著促進Bax和Caspase-3的激活,并抑制Bcl-2的表達,而ISO(20 μmol/L)可有效降低Bax和剪切型Caspase-3的表達,并上調(diào)Bcl-2和前體型Caspase-3的蛋白水平(圖2(c)～(g))。

(a)～(b)Hoechst染色及分析(200×);(c)Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3;(d)～(g)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

2.3 ISO減輕6-OHDA誘導的SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的氧化應(yīng)激

胞內(nèi)活性氧(ROS)聚集是導致神經(jīng)毒性的重要原因之一。本試驗結(jié)果表明,與空白組(Control)相比,300 μmol/L的6-OHDA可顯著誘導ROS過多產(chǎn)生(P<0.01),而ISO(20 μmol/L)處理后可顯著減少6-OHDA誘導的ROS過度積累(圖3(a)～(b))。此外,結(jié)果還顯示300 μmol/L的6-OHDA能明顯消耗細胞中GSH的含量(P<0.05),而ISO(20 μmol/L)處理后可顯著減少GSH的消耗(P<0.05)(圖3(c))。

2.4 ISO改善6-OHDA誘導的SH-SY5Y神經(jīng)元細胞的線粒體損傷

線粒體膜電位(MMP,ΔΨm)的下降是細胞凋亡和線粒體功能障礙的早期階段的一個標志性事件。當線粒體膜電位低時,JC-1產(chǎn)生綠色熒光,代表MMP崩潰;反之,JC-1產(chǎn)生紅色熒光。6-OHDA(300 μmol/L)可誘導綠色熒光點的數(shù)量顯著增加,而ISO(20 μmol/L)能明顯減少綠色熒光點的數(shù)量,而增加紅色熒光。這些結(jié)果提示,ISO可有效改善6-OHDA誘發(fā)的線粒體功能紊亂(圖4)。

紅色代表正常細胞;綠色代表線粒體膜電位損傷細胞,200×。

2.5 ISO增強SH-SY5Y神經(jīng)元細胞中抗氧化蛋白的表達

鑒于GCLC、GCLM、HO-1和NQO1是細胞中重要的抗氧化蛋白,因而本試驗進一步檢測ISO對GCLC、GCLM、HO-1與NQO1表達水平的影響。首先,不同濃度ISO(2.5、5、10和20 μmol/L)處理SH-SY5Y細胞18 h。結(jié)果顯示,ISO能顯著促進抗氧化蛋白GCLC、GCLM、HO-1和NQO1表達(P<0.05),其中20 μmol/L的ISO效果最佳(圖5)。

(a)Western blot分析抗氧化蛋白GCLC、GCLM、HO-1和NQO1表達情況;(b)～(e)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

2.6 ISO上調(diào)SH-SY5Y神經(jīng)元細胞中Keap1/Nrf2信號通路

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對多種抗氧化酶(如GCLC、GCLM、HO-1和NQO1等)具有關(guān)鍵的調(diào)控作用,而Keap1可負向調(diào)節(jié)Nrf2。本研究結(jié)果表明,ISO可有效增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位,并降低其細胞質(zhì)水平(圖6(a)～(b))。為明確ISO激活的Nrf2信號是否直接被Keap1抑制所調(diào)節(jié),進行過表達SH-SY5Y細胞Keap1。結(jié)果顯示,Keap1的過表達能顯著降低ISO增強的Nrf2、GCLC、GCLM、HO-1和NQO1蛋白的表達,這表明ISO介導的抗氧化蛋白的表達與Keap1/Nrf2信號通路密切相關(guān)(圖6(c)～(g))。

(a)Western blot分析Nrf2漿核蛋白表達情況;(c)Western blot分析過表達Keap1(OE-Keap1)后對Keap1、Nrf2、NQO1及HO-1蛋白表達影響;(b),(d)～(e)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

2.7 ISO逆轉(zhuǎn)6-OHDA降低的Nrf2抗氧化信號通路

基于上述結(jié)果,本試驗進一步檢測了ISO對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞抗氧化蛋白表達的影響。結(jié)果顯示,300 μmol/L的6-OHDA能顯著降低抗氧化蛋白Nrf2、GCLC、HO-1與NQO1的表達,而ISO(20 μmol/L)處理后可有效恢復(fù)這些蛋白的表達(圖7)。

(a)Western blot分析Nrf2、GCLC、NQO1及HO-1蛋白表達影響;(b)～(e)相應(yīng)蛋白的灰度分析。

3 討 論

飼料是畜禽獲取營養(yǎng)的主要來源,但由于儲存與生產(chǎn)過程中易受空氣氧化,引起氧化變性、蛋白質(zhì)破壞,而產(chǎn)生有毒有害的物質(zhì),進而導致動物機體氧化損傷及采食量降低,嚴重影響畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益[18-19]。在飼料中添加適量的抗氧化劑可有效改善在儲存過程中飼料的氧化等問題,并能有效防止飼料氧化造成的畜禽機體氧化損傷。近年來,研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑還能通過減少下丘腦ROS含量,增加其下丘腦促采食神經(jīng)元的NPY/AgRP蛋白表達,提高動物的采食量,繼而增強其生產(chǎn)性能[20]。天然植物化合物因具有來源廣泛、毒副作用小及藥理活性多樣,在神經(jīng)損傷保護作用的應(yīng)用中備受研究者關(guān)注[21]。ISO作為一種果實食用性黃酮類小分子化合物,具有良好的抗氧化、抗炎和抗凋亡活性[22]。本研究表明,ISO可通過上調(diào)Nrf2抗氧化通路有效緩解6-OHDA誘導的細胞氧化應(yīng)激、細胞凋亡及線粒體損傷,進而改善神經(jīng)元細胞的損傷。

有研究表明,6-羥基多巴胺(6-OHDA)是一種選擇性的兒茶酚胺能神經(jīng)毒素,常用于神經(jīng)元細胞氧化損傷的模型[23]。6-OHDA可以被多巴胺轉(zhuǎn)運器接受,通過抑制線粒體電子轉(zhuǎn)運鏈復(fù)合物I和IV,而導致過多的ROS產(chǎn)生[24]。在長壽的非有絲分裂細胞(如神經(jīng)元)中,氧化應(yīng)激是由線粒體ROS的過度產(chǎn)生或抗氧化防御系統(tǒng)的損害所引起,繼而導致線粒體功能障礙和細胞死亡級聯(lián)的啟動[25]。此外,腹腔注射脂肪乳劑可導致下丘腦ROS含量增加,促使動物采食量下降,而清除ROS含量,則能提高其采食量[26]。本研究表明,6-OHDA可以顯著增加神經(jīng)元細胞的神經(jīng)毒性、細胞凋亡和死亡,引起過多的ROS聚集,而經(jīng)ISO處理后可有效地緩解神經(jīng)元細胞這些損傷。此外,有研究指出,Bcl-2家族和caspase家族在調(diào)控細胞凋亡的途徑中起著極其重要的作用,尤其是線粒體途徑[24]。Bcl-2是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵調(diào)控者,通過線粒體途徑調(diào)控細胞色素c的釋放。Caspase-3是級聯(lián)反應(yīng)下游的凋亡最關(guān)鍵的執(zhí)行者,其激活主要取決于細胞色素c的釋放[25]。本研究發(fā)現(xiàn)ISO通過抑制Caspase-3的激活和Bax的表達及上調(diào)Bcl-2蛋白水平,逆轉(zhuǎn)了6-OHDA誘導的細胞凋亡?？紤]到ROS的積累會導致線粒體功能紊亂并引發(fā)細胞凋亡,本研究進一步探究了ISO對ROS的產(chǎn)生和6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞中的線粒體功能障礙的影響。本研究結(jié)果表明,6-OHDA顯著促進了ROS的產(chǎn)生并加劇了線粒體的損傷,而ISO處理可有效改善ROS產(chǎn)生和線粒體損傷。綜上所述,這些研究表明ISO通過抑制6-OHDA誘導的氧化應(yīng)激,進而改善其導致神經(jīng)毒性、線粒體損傷、細胞凋亡和細胞凋亡相關(guān)蛋白表達。

目前,核轉(zhuǎn)錄因子(Nrf2)是一種與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,在體內(nèi)和體外都能減輕多種氧化劑如MPP+/MPTP、魚藤酮、6-OHDA和過氧化氫的導致的機體組織細胞的氧化損傷[26-27]。Keap1-Nrf2/ARE信號通路在保護細胞對抗內(nèi)源性和外源性應(yīng)激方面起至關(guān)重要的作用,而Keap1與Nrf2結(jié)合存在胞漿中,Nrf2不能表現(xiàn)出生物活性[28]。事實上,包括天然化合物在內(nèi)的許多生物活性分子都依賴于Nrf2的活化來調(diào)控各種抗氧化酶的表達,調(diào)節(jié)G-谷氨酰半胱氨酸連接酶催化(GCLC)/調(diào)節(jié)(GCLM)亞單位、NAD(P)H:醌氧化還原酶(NQO1)和Ⅱ期解毒酶(血紅素氧合酶,HO-1)的表達等,以防止氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂和神經(jīng)炎癥[29-30]。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn),不同劑量的ISO(尤其是20 μmol/L)處理SH-SY5Y神經(jīng)元細胞18 h能顯著增加抗氧化基因HO-1、GCLM、GCLC和NQO1的表達。此外,ISO處理能顯著促進Nrf2的核轉(zhuǎn)位,降低細胞質(zhì)中Nrf2的比率。然而,過表達Keap1后能顯著逆轉(zhuǎn)ISO提高的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達水平,這表明ISO可能通過促進Keap1的降解而導致Nrf2入核被激活。此外,據(jù)報道6-OHDA可通過抑制Nrf2抗氧化信號通路,以破壞神經(jīng)元細胞氧化-抗氧化平衡,進而導致細胞氧化損傷[31]。的確,在研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)6-OHDA能顯著引起Nrf2、GCLC、HO-1和NQO1的蛋白表達下降,而經(jīng)20 μmol/L的ISO處理后能顯著恢復(fù)這些抗氧化蛋白的表達。

4 結(jié) 論

ISO可上調(diào)Keap1/Nrf2及其下游抗氧化相關(guān)蛋白GCLC、GCLM、HO-1和NQO1的表達,進而保護神經(jīng)元細胞免受6-OHDA誘導的神經(jīng)毒性、氧化應(yīng)激和線粒體損傷。本研究將有助于對氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷的防治提供新策略及新飼料抗氧化添加劑的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ),具有重要的科學意義和應(yīng)用價值。