王 娟,謝雨澤,李 贊,陳 琛,王 敬,黃建輝,賈文軒

(河北省食品安全重點實驗室,國家市場監(jiān)管重點實驗室(特殊食品監(jiān)管技術(shù)),特殊食品安全與健康河北省工程研究中心,河北省食品檢驗研究院,河北 石家莊 050227)

中國出口歐盟的茶葉中頻繁檢出高含量的高氯酸鹽,讓氯酸鹽和高氯酸鹽受到密切關(guān)注[1-3]。氯酸鹽和高氯酸鹽主要作為清潔食品生產(chǎn)的殺菌劑的副產(chǎn)品出現(xiàn)[4]。隨著氯酸鹽和高氯酸鹽的排放, 使其越來越多進(jìn)入到環(huán)境中[5,6],因其極易溶于水[7],從而污染土壤及地下水, 隨著地下水和地表水的流動, 被植物等吸收、積累, 經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體[8,9]。研究表明,氯酸鹽和高氯酸鹽會阻礙甲狀腺對碘的吸收, 尤其對于甲狀腺功能障礙人群、缺碘患者、孕婦和嬰幼兒,會嚴(yán)重影響其新陳代謝和生長發(fā)育[10-12]。因此,2020年歐盟委員會發(fā)布(EU)2020/685號條例,修訂了高氯酸鹽(perchlorate)在部分食品中的最大殘留限量,其中,茶葉中高氯酸鹽限量為0.75 mg/kg[13]。氯酸鹽作為農(nóng)藥已不再被歐盟批準(zhǔn)使用,其默認(rèn)遵循標(biāo)準(zhǔn)(EU)2020/749 號條例中的相關(guān)規(guī)定,茶葉中的最大殘留量為0.05 mg/kg[14]。

氯酸鹽、高氯酸鹽具有強極性、水溶性以及小分子的特點[3,15],常用的檢測方法有比色法[16]、離子色譜法[17-19]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[20-22]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[23-25]等。本文利用離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立檢出限低,精密度良好,可準(zhǔn)確定性和定量茶葉中氯酸鹽和高氯酸鹽含量的方法,為市場中茶葉的安全監(jiān)管提供更有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯酸鹽(1 000 mg/L,o2si公司)、高氯酸鹽(1 000 mg/L,o2si公司)、氯酸鹽-18O3(200 mg/L,EURL-SRM公司)、高氯酸鹽-18O4(200 mg/L,EURL-SRM公司)。

RP柱(1cc,Agela公司)、Ag/H(1cc,Agela公司)、甲醇、乙腈(色譜純,ThermoFisher科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-5000+離子色譜儀, EG淋洗液自動發(fā)生器,Dionex ASRS 300 (2 mm)微膜抑制器, AS-AP自動進(jìn)樣器(美國Thermo Scientific公司);TSQ Endura質(zhì)譜儀(Thermo Scientific);渦旋混勻器,IKA;離心機,SiGMA 3K15;超聲波清洗儀,ElmasonicP 300H;電子天平(美國Mettler Toledo公司);離心機(德國Merck公司);Milli-Q純水(德國Merck公司);渦旋振蕩器(德國Heidolph公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

實驗前分別將氯酸鹽、高氯酸鹽用超純水稀釋成10 mg/L的儲備液。將高氯酸鹽-18O4、氯酸鹽-18O3用超純水稀釋成1 mg/L的儲備液。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g粉碎的茶葉樣品粉末于50 mL 聚丙烯離心管中,加入 10 mL 純水,渦旋 2 min,30 ℃震蕩提取時間為 20 min。以8 000 r/min 離心 5 min,取1 mL上清液于10 mL容量瓶中,加入1 mL 乙腈,用純水定容至刻度,搖勻,待凈化。

取上述濾液經(jīng)IC-RP柱、IC-Ag/H柱凈化,棄去4 mL流出液,收集洗脫液,通過再生纖維素濾膜后待測。固相萃取柱使用前需進(jìn)行活化,RP柱使用前依次用10 mL 甲醇、15 mL水通過,Ag/H柱用10 mL 水通過,均靜置活化30 min[26]。

1.3.3 分析條件

1)離子色譜條件。色譜柱:Dionex IonPac AS 19-4 μm分析柱(250 mm×2 mm)、AG 19-4 μm保護住(50 mm×2 mm);流速為0.2 mL/min;進(jìn)樣量為100 μL;柱溫為30 ℃;陰離子微膜抑制器,外接水循環(huán)模式,流動相:KOH溶液,采用梯度洗脫的方法進(jìn)行分離,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2)質(zhì)譜條件。離子源:ESI-;掃描模式:MRM;負(fù)離子電離電壓3000 V;離子傳輸管溫度380 ℃;霧化器溫度350 ℃;鞘氣流速30 mL/min;輔助其流速10 mL/min;反吹氣流速1 mL/min;Trace Finder 3.2 software數(shù)據(jù)分析軟件;氯酸鹽、高氯酸鹽的質(zhì)譜分析監(jiān)測離子對、碰撞能量和去簇電壓見表2。目標(biāo)物質(zhì)譜圖如圖1所示。

圖1 氯酸鹽、高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖

表2 氯酸鹽、高氯酸鹽的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 離子色譜條件的選擇

因為色譜柱需接入質(zhì)譜儀,選擇2 mm×250 mm色譜柱,同時配置2 mm陰離子抑制器。該方法比較了AS11-HC-4 μm,AS19-4 μm,AS16三種色譜柱,分別檢測了10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品和茶葉基質(zhì)樣品,發(fā)現(xiàn)相同條件下,AS11-HC-4 μm上標(biāo)液高氯酸鹽不能洗脫,AS19-4 μm,AS16均可實現(xiàn)分離,且AS16分析柱的保留時間提前,但是茶葉基質(zhì)樣品時氯酸鹽存在干擾,因此選擇AS19-4 μm作為分析柱。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

離子色譜儀的流動相為純水,經(jīng)KOH在線發(fā)生器后產(chǎn)生強堿KOH,后經(jīng)過抑制器變?yōu)榧兯?與質(zhì)譜常用的甲醇、乙腈等有機溶劑相比,對檢測物的離子化效率的促進(jìn)作用較弱,因此在抑制器后,質(zhì)譜進(jìn)樣口前接三通,利用計量泵輸入有機溶劑,進(jìn)入質(zhì)譜促進(jìn)電離。分別實驗有機溶劑甲醇、乙腈,發(fā)現(xiàn)使用甲醇會增加抑制器背壓,減少抑制器壽命,所以選用有機溶劑乙腈。計量泵的輸入乙腈流速0.1 mL/min、0.15 mL/min、0.2 mL/min,發(fā)現(xiàn)0.15 mL/min、0.2 mL/min均可提高檢測物的響應(yīng),考慮到抑制器的背壓,計量泵流速選擇0.15 mL/min。實驗比較了50 ng/mL響應(yīng)變化情況,結(jié)果見表3。

表3 氯酸鹽、高氯酸鹽的響應(yīng)

2.3 前處理方法的選擇

2.3.1 提取試劑的選擇

目標(biāo)物均屬于強極性化合物,均極易溶于水,實驗比較了純水、50%甲醇水、40 mmol/LNaOH水溶液的提取效果,回收率結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示,堿溶液提取時目標(biāo)物的回收率低于其余兩種提取液,50%甲醇水提取和純水提取時目標(biāo)物回收率均可達(dá)到實驗室日常檢測要求,而采用純水提取時,目標(biāo)物峰型更優(yōu),因此選擇純水作為提取溶劑。

圖2 不同提取試劑的回收率

茶葉經(jīng)純水提取后,為減少顆粒物的影響,用純水稀釋10倍后再進(jìn)行固相萃取凈化,實際凈化過程中發(fā)現(xiàn)過固相萃取柱時較困難,耗時費力,可能是茶葉基質(zhì)復(fù)雜,蛋白、糖類、茶多酚含量較高,需要凈化處理。根據(jù)文獻(xiàn)報道[27-29],選取乙腈沉淀蛋白,離心過纖維素濾膜后,通過RP 固相萃取小柱吸附糖類等疏水物質(zhì),再通過Ag/H柱去除氯化物、微量重金屬來提高敏感性、降低基線和獲得更好的分離效果。

2.3.2 提取溫度的選擇

參考文獻(xiàn)[25,30],實驗選取了30 ℃、65 ℃、80 ℃下,震蕩提取20 min,比較提取溫度對提取效率的影響。在茶葉樣品中添加125 μg/kg氯酸鹽和250 μg/kg高氯酸鹽,其結(jié)果見表4。3種溫度下氯酸鹽含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.45%,高氯酸鹽含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.93%,表明提取溫度對實驗結(jié)果未有較顯著影響,故選擇30 ℃作為提取溫度。

表4 不同提取溫度下氯酸鹽、高氯酸鹽的含量

2.3.3 離心時間的選擇

比較離心時間對提取效率的影響,采用建立的檢測方法測定氯酸鹽添加量為50 μg/kg,高氯酸鹽添加量為100 μg/kg茶葉樣品,當(dāng)離心時間為5、10、15 min時,氯酸鹽的測定值分別為 49.5、48.2、48.9 μg/kg,高氯酸鹽的測定值分別為98.1、99.0、102.0 μg/kg。試驗表明,離心時間對實驗結(jié)果未有較明顯影響。因此本實驗選擇8 000 r離心5 min。

2.4 線性范圍及檢出限

用純水將分析物配置成0.02～200 ng/mL系列混和標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照 1.3.3分析條件進(jìn)樣分析。發(fā)現(xiàn)氯酸鹽在0.08～200 ng/mL,高氯酸鹽在0.04～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好,均可符合實驗要求。以3倍噪聲為檢出限,計算得到氯酸根檢出限為 1.0 μg/kg ,高氯酸根檢出限為0.5 μg/kg;以 10 倍噪聲的濃度為定量限,計算得到氯酸根定量限為 4.0 μg/kg ,高氯酸根定量限為2.0 μg/kg,結(jié)果見表5。

表5 線性范圍及檢出限、定量限

2.5 回收率與精密度

稱取多份茶葉基質(zhì),氯酸鹽分別添加25、50、125μg/kg;高氯酸鹽分別添加50、100、250μg/kg,對氯酸鹽和高氯酸鹽進(jìn)行回收率和精密度的考察。每個添加濃度水平下做 6個平行樣品。方法的精密度及回收率數(shù)據(jù)見表6。結(jié)果顯示所建方法各項性能參數(shù)均滿足檢測需求。

表6 氯酸鹽、高氯酸鹽的加標(biāo)回收率和精密度

2.6 市售樣品的檢測

按照1.3節(jié)中實驗方法對從市場隨即采購的20種茶葉(8批次綠茶、4批次紅茶、4批次鐵觀音、1批次白茶、2批次黑茶、1批次莓茶)進(jìn)行測定,樣品中氯酸鹽、高氯酸鹽含量結(jié)果見表7。結(jié)果顯示,茶葉中均檢出氯酸鹽和高氯酸鹽,氯酸鹽在9.34～86.5 μg/kg。有1批次綠茶的氯酸鹽超過歐盟最大殘留量;高氯酸鹽在2.69～106 μg/kg,均符合歐盟的要求。試驗結(jié)果表明茶葉中氯酸鹽有超限量的風(fēng)險,危害消費者權(quán)益和健康,需要引起監(jiān)管部門關(guān)注,建立風(fēng)險抽檢檢測預(yù)案,因此,建立茶葉中氯酸鹽和高氯酸鹽含量的檢測方法具有實際應(yīng)用價值。

表7 市售茶葉中氯酸鹽、高氯酸鹽測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定茶葉中氯酸鹽和高氯酸鹽的含量。通過純水提取,固相萃取凈化,操作簡單,經(jīng)方法學(xué)驗證具有回收率高,檢出限低,精密度良好等特點,可準(zhǔn)確定性和定量茶葉中氯酸鹽和高氯酸鹽,為我國進(jìn)出口茶葉的風(fēng)險監(jiān)測提供了一種新的技術(shù)手段。