朱小麗，陳小麗，程曉霞，林鋒強，王 劭，江丹丹

（1.福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；2.三明市農業(yè)農村局，福建三明 365000）

番鴨呼腸孤病毒病從1997年開始在福建省莆田市、福州市等多地發(fā)生，臨床上以肝、脾表面有多量針尖狀白色壞死點為主要病理變化，俗稱番鴨“肝白點病”[1-2]。該病主要發(fā)生于40日齡內番鴨，發(fā)病率可達30%～90%，病死率可達60%～80%[3-4]。2010年前，福建省為國內主要番鴨飼養(yǎng)區(qū)，番鴨呼腸孤病毒病在莆田市、漳州市等地多有發(fā)生，造成的危害尤其嚴重[3，5-7]。2010年后番鴨在江西、浙江和廣東等省份的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，番鴨呼腸孤病毒病流行范圍隨之越來越廣。

番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）活疫苗2013年獲得國家一類新獸藥證書，2014年商品化疫苗上市。隨著商品化疫苗的推廣應用，番鴨呼腸孤病毒病的發(fā)病率和病死率大大降低。臨床生產表明，MDRV活疫苗對番鴨呼腸孤病毒病的保護率可達90%以上[8-9]。然而小規(guī)模的番鴨呼腸孤病毒病疫情依然零星發(fā)生，其主要原因是很多散養(yǎng)戶沒有進行疫苗免疫[9]。為了解MDRV的分子流行病學特征，2021—2022年在福建省不同地區(qū)的番鴨發(fā)病飼養(yǎng)場收集臨床樣品進行病毒檢測、病原分離鑒定和基因序列分析，來評價MDRV流行毒株的生物學特性，以期為該病防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

80只1日齡雛番鴨和12日齡番鴨胚，購自漳州昌龍農牧有限公司；樣品基因組提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit和RT-PCR試劑Onestep RT-PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司；MDRV-MW9710株，由本實驗室保存；所用引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 樣品來源

2021—2022年從福建省莆田、三明、漳州、南平等地收集15～20日齡番鴨疑似臨床病例的肝脾組織病料樣品125份。病例臨床癥狀為采食量降低、精神沉郁、軟腳等，剖檢無包心包肝癥狀。

1.3 病原檢測

MDRV檢測引物，按照MDRV-MW9710株S4基因（KY580159）設計。上游引物MDRV-P1：CTACC TCAAA TGGTC GCAAT GGAG；下游引物MDRV-P2：GATCG TGTTG CCAAG TTAGA ACGAG（擴增長度500 bp，退火溫度56 ℃）。將臨床病料樣品按照1:5比例磨成勻漿，取200 μL按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒RNA。將所得核酸通過One-step RT-PCR SuperMix進行MDRV RT-PCR檢測。RT-PCR反應體系（50 μL）：病毒RNA 5 μL，2×TS Onestep Reaction Mix 25 μL，One-step Enzyme Mix 1 μL，上游和下游引物各1 μL，無核酶水17 μL。反應程序：45 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將所得產物在1%瓊脂糖凝膠，120 V電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

1.4 病原分離

按照文獻[10]方法，將MDRV陽性病料接種12日齡番鴨胚，收集48～96 h死亡胚尿囊液，提取DNA/RNA后進行MDRV、番鴨小鵝瘟病毒（MDGPV）、番鴨細小病毒（MDPV）、鴨新型呼腸孤病毒（NDRV）、鴨病毒性肝炎病毒（DHV）病原檢測。

1.5 母源抗體檢測

采集1日齡番鴨血液0.2 mL，分離血清后按照文獻[9]中的方法檢測中和抗體。

1.6 攻毒試驗

將40只1日齡雛番鴨分成8組，每組5只，其中MDRV分離株攻毒組6組（6株分離毒株各1組）、MDRV-MW9710株攻毒組1組和空白對照組1組。攻毒組每只番鴨肌內注射0.2 mL MDRV尿囊液，空白對照組每只注射同劑量的Hanks液。攻毒后觀察和記錄番鴨的發(fā)病死亡情況。

1.7 免疫攻毒試驗

將40只1日齡雛番鴨免疫MDRV活疫苗1羽份/只。7日齡時分成8組進行攻毒試驗（攻毒劑量0.2 mL/只），每組5只，其中攻毒組7組（6組MDRV分離株和1組MDRV-MW9710毒株），對照組1組。攻毒后觀察和記錄番鴨發(fā)病死亡情況。

1.8 序列測定及進化樹分析

按照MDRV-ZJ2000M株S4基因（KF306091）設計引物（上游引物MDRV-S4P1：GCTTTTTCCTTCTCCTTAGTG；下游引物MDRVS4P2：GATGAATAGCCCTTCCCC GCGG），擴增長度1 124 bp。取200 μL MDRV分離株尿囊液，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒RNA。RT-PCR反應體系及反應程序同1.3。按照文獻[10]進行PCR檢測。將所得到的產物送北京擎科生物科技有限公司福州分公司進行序列測定以及同源性和進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 臨床樣品病原檢測

收集的臨床病料樣品來自福建省4個地區(qū)的125家養(yǎng)殖場。115家養(yǎng)殖場在番鴨1日齡時免疫過MDRV活疫苗，在其病料樣品中均未檢測到MDRV強毒；10家在1日齡時沒有免疫MDRV活疫苗，在其病料樣品中檢測出MDRV強毒6份，其中4份來自南平市，2份分別來自三明市和莆田市（表1）。結果表明，MDRV活疫苗能夠有效預防MDRV感染。

表1 臨床樣品MDRV檢測結果 單位：份

2.2 病毒分離及檢測

在番鴨胚上將6份MDRV臨床陽性病料進行傳代，結果發(fā)現番鴨胚接種病料后均100%死亡，解剖發(fā)現胚體肝臟有白色壞死點。對相應尿囊液進行PCR檢測，僅能檢測到MDRV，其他病毒均為陰性（表2）。

表2 MDRV分離株尿囊液病毒檢測結果

2.3 母源抗體檢測及攻毒試驗

80只番鴨1日齡血清中和抗體效價檢測結果顯示，63份血清效價為20，17份血清效價為2-1。6株MDRV攻毒4～5 d后，攻毒組番鴨開始發(fā)病，7～14日齡多發(fā)，各組發(fā)病率為60%～100%，主要表現為拉稀、不愿站立、少食。番鴨死亡時間為攻毒后7～14 d（7～14日齡），死亡率為40%～60%（表3）。對死亡番鴨解剖發(fā)現，其肝臟和脾臟均有大量灰白色針尖狀壞死點。20日齡后，存活番鴨臨床癥狀逐漸消失，但生長緩慢，變成僵鴨。6組分離株攻毒組的發(fā)病率、病死率和臨床癥狀均與MDRVVMW9710株攻毒組相近（表3）。

表3 番鴨攻毒試驗結果 單位：只

2.4 免疫攻毒試驗

1日齡番鴨免疫MDRV活疫苗后，7日齡時使用6株分離株和MW9710株分別進行攻毒試驗，結果各組均未見發(fā)病和死亡現象（表4），表明MDRV活疫苗能夠抵抗不同MDRV分離株的感染。

表4 番鴨免疫攻毒試驗結果 單位：只

2.5 序列測定及進化樹分析

6株MDRV分離株均能擴增出1 124 bp條帶（圖1）。同源性分析結果（圖2）顯示：6株MDRV分離株的S4基因核苷酸序列與MDRVMW9710株一致。6株MDRV分離株之間的同源性為99.3%～99.7%，與國內MW9710株和ZJ2000M株同源性分別為98.9%～99.2%和96.1%～96.5%，與MDRV國外分離株89026和D2044株同源性分別為89.9%～90.6%和86.9%～87.2%。結果表明，2021—2022年福建省流行的MDRV毒株與國內流行株同源性較近，而與國外流行株同源性較遠。進化樹分析結果（圖3）顯示：6株分離株與MDRVMW9710株屬于同一分支，而與國外分離株屬于不同分支。

圖1 MDRV分離株S4基因擴增圖譜

圖2 6株MDRV分離株與參考株同源性分析結果

圖3 6株MDRV分離株進化樹分析結果

3 討論

番鴨呼腸孤病毒病自1997年在福建省莆田市和福州市大規(guī)模暴發(fā)后，逐漸在廣東、浙江等省份蔓延開來，造成番鴨大量死亡，經濟損失極為嚴重[3]。由于當時沒有特效藥物和疫苗，疫情難以控制[1]，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，導致鴨農飼養(yǎng)番鴨信心不足[5，7]。

目前福建省番鴨飼養(yǎng)區(qū)主要集中在漳州市、三明市、莆田市、南平市等地。這幾個地區(qū)的番鴨總飼養(yǎng)量占全省90%以上。2014年MDRV活疫苗被成功研制上市后，該病的大規(guī)模暴發(fā)大大減少。臨床生產證實，MDRV活疫苗免疫對MDRV感染的保護率可達90%以上[8-10]。本研究發(fā)現，目前福建省番鴨群中依然存在MDRV感染，但其主要散發(fā)于未免疫MDRV疫苗的鴨群，流行毒株與國內早期流行毒株同源性較高。

MDRV的S4基因序列在整個基因組中變異程度最大，其編碼的σC蛋白是病毒外殼上一種結構蛋白，相對分子質量最小，其功能是結合細胞，啟動病毒感染。σC蛋白氨基酸序列38～72位存在一個卷曲螺旋（coiled-coil）結構，它與N末端的疏水性氨基酸形成一個具有錨定功能的纖維性尾部，通過識別宿主細胞啟動病毒感染[11-14]。6株分離株的纖維性尾部高度保守，與1997年流行毒株MDRV-MW9710株同源性為98.6%～99.4%，存在變異的可能。進化樹分析發(fā)現，6株分離株與MDRV-MW9710株屬于同一分支，而與國外分離株屬于不同分支。

綜上，MDRV感染在福建省未免疫番鴨群中依然存在，流行毒株的生物學特性和基因組特性較為穩(wěn)定，變異程度小，當前疫苗的可有效防控該病流行，因此要重視MDRV活疫苗的免疫。