孟俊華，劉 媛，占慧慧，唐 宏，崔培梧*

基于特征圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和一測(cè)多評(píng)法的薤白質(zhì)量評(píng)價(jià)

孟俊華1, 2, 3，劉 媛1, 2, 3，占慧慧1, 2, 3，唐 宏1, 2, 3，崔培梧1, 2, 3*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥性與藥效三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)菌物藥研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

建立薤白特征圖譜分析方法，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS）開(kāi)展薤白質(zhì)量控制研究。采用HPLC方法，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-超純水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm，進(jìn)樣量20 μL，建立薤白特征圖譜，接著采用聚類分析（clustering analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least square method-discriminant analysis，OPLS-DA）對(duì)不同批次薤白飲片進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的可視化。同時(shí)以腺苷為內(nèi)參物建立QAMS法，建立內(nèi)參物與胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷的相對(duì)校正因子，采用外標(biāo)法（external standard method，ESM）與QAMS法分別測(cè)定12批次薤白樣品中胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷4種核苷類成分的含量，以驗(yàn)證QAMS法結(jié)果的可靠性。建立的HPLC特征圖譜方法較全面地反映了薤白藥材的化學(xué)成分，分析方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠；化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果基本一致；并通過(guò)OPLS-DA找出了3種可能的標(biāo)志性成分；QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果之間無(wú)顯著差異。建立的薤白特征圖譜分析方法、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法、多指標(biāo)成分QAMS法可為薤白和其他植物藥的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。

薤白；特征圖譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)；胞苷；尿苷；鳥(niǎo)苷；腺苷；一測(cè)多評(píng)；外標(biāo)法

薤白為百合科（Liliaceae）蔥屬L.植物小根蔥Bge.或薤G. Don.的干燥鱗莖，別名野薤、野蔥、薤白頭[1]，我國(guó)除新疆、青海外各省區(qū)均產(chǎn)，俄羅斯、朝鮮和日本也有分布[2]。薤白在臨床廣泛用于治療胸痹、心絞痛、哮喘等疾病，皂苷類化合物是其主要藥效成分[3]。國(guó)家衛(wèi)生部于20世紀(jì)90年代將薤白列入藥食同源植物名錄[4]，因此薤白也可用于功能性食品的開(kāi)發(fā)，具有廣泛的應(yīng)用前景。薤白主要含有甾體皂苷、揮發(fā)油、苯丙素類化合物、氨基酸、多糖與脂肪酸等多種生物活性成分[5-7]，具有抗腫瘤[8]、調(diào)血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化[9]、抗痙攣[10]、抗氧化[11]等活性。近年來(lái)，薤白的化學(xué)成分和藥理作用已經(jīng)得到深入的研究，但其質(zhì)量控制研究仍需加強(qiáng)，《中國(guó)藥典》2020年版也暫無(wú)薤白有效成分［含量測(cè)定］項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)[1]，而中藥又有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，且其品質(zhì)易受產(chǎn)地和加工方式影響。因此，單一的成分難以全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的優(yōu)劣，通過(guò)多指標(biāo)同步質(zhì)量控制反映中藥質(zhì)量已成為當(dāng)前中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域的共識(shí)。

化學(xué)計(jì)量學(xué)是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)或數(shù)學(xué)方法結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)將對(duì)化學(xué)體系的測(cè)量值與體系的狀態(tài)之間建立聯(lián)系[12]。而一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components le-marker，QAMS）是采用一種相對(duì)易得、價(jià)廉的內(nèi)參比物質(zhì)對(duì)照品，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分的同時(shí)測(cè)定[13]。特征圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和一測(cè)多評(píng)法可以根據(jù)多變量數(shù)值分析把同類與異類中藥材區(qū)別開(kāi)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的可視化[14]。本研究通過(guò)上述方法對(duì)薤白藥材進(jìn)行分類和質(zhì)量評(píng)價(jià)，為薤白的鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀；皖儀3100型高效液相色譜儀、EX224ZH型萬(wàn)分之一電子分析天平（OHAUS公司）；JS-40型超聲波清洗儀（常州鴻澤實(shí)驗(yàn)科技有限公司），Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Synergi Hydro-RT C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 材料

對(duì)照品胞苷（批號(hào)T16J7X9000）、尿苷（批號(hào)M02HS176753）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)D25GS172600）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99%；腺苷（批號(hào)RP210402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.85%）購(gòu)自成都麥德生物科技有限公司；乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑為分析純。薤白樣品來(lái)源見(jiàn)表1，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源中心王智副教授鑒定為薤G. Don.和小根蔥Bge.。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜方法

色譜柱為 Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-超純水（B），梯度洗脫：0～17 min，0.5% A；17～18 min，0.5%～5% A；18～30 min，5%～9% A；30～32 min，9% A；32～42 min，9%～11% A；42～45 min，11%～ 0.5% A；45～50 min，0.5% A；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖如圖1所示。

表1 樣品信息

2-胞嘧啶核苷 5-尿嘧啶核苷 6-鳥(niǎo)嘌呤核苷 8-腺嘌呤核苷

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取對(duì)照品適量，加10%甲醇溶解制成含胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷質(zhì)量濃度分別為5.016、14.884、15.120、14.960 μg/mL的混合對(duì)照品溶液用作外標(biāo)法定量和色譜峰指認(rèn)。另精密稱取適量對(duì)照品加10%甲醇溶解制成含胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷質(zhì)量濃度分別為10.20、34.20、35.40、35.00 μg/mL的混合對(duì)照品溶液STD1，后將STD1用10%甲醇分別稀釋至其0.8、0.6、0.4、0.2、0.1倍的混合對(duì)照品溶液STD2、STD3、STD4、STD5、STD6用作方法學(xué)線性考察[15]。置于4 ℃冰箱，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取薤白樣品粉末1.0 g（過(guò)60目篩），精密稱定，置于100 mL干燥具塞錐形瓶中，加10%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率240 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，用10%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品溶液、薤白對(duì)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明各成分保留時(shí)間基本一致，最大紫外吸收波長(zhǎng)高度吻合、各色譜峰分離度均大于1.5，表明方法專屬性良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液S1，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示1～9號(hào)峰峰面積RSD分別為1.87%、1.11%、1.54%、1.08%、0.49%、0.73%、0.86%、0.43%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以腺苷峰為參照，記錄各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示1～9號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.35%、0.17%、0.46%、0.68%、0.75%、0.22%、0.31%、0.07%、0.18%，相對(duì)峰面積RSD分別為1.07%、1.44%、0.82%、1.15%、1.34%、0.54%、0.63%、0.70%、0.59%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（S1）適量，分別于0、2、4、8、12、18、24 h以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示1～9號(hào)峰峰面積RSD分別為1.32%、1.49%、1.63%、0.98%、1.01%、0.69%、0.75、0.63%、0.47%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 特征圖譜的分析及評(píng)價(jià)

2.5.1 特征圖譜的建立及共有峰歸屬 12批薤白樣品分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將色譜信息導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行Mark峰匹配（版本：2012.130723），共確定9個(gè)共有峰，共有峰見(jiàn)圖2。其中共有峰中8號(hào)峰（腺苷）分離度較好，響應(yīng)較高，故以8號(hào)峰（腺苷）為參照峰（S峰）。經(jīng)與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相比對(duì)和DAD光譜分析，共指認(rèn)出4個(gè)特征峰，分別為1號(hào)峰胞苷、5號(hào)峰尿苷、6號(hào)鳥(niǎo)苷、8號(hào)峰腺苷。

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 以薤白12批樣品9個(gè)共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入Origin Pro 2021軟件進(jìn)行樣品相關(guān)性分析，并繪制相關(guān)系數(shù)圖。圖3中，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，圈的朝向代表正負(fù)相關(guān)性，圈越大越圓相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值越小，值代表樣品相關(guān)性顯著程度，從根據(jù)9個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)繪制的相關(guān)系數(shù)圖來(lái)看樣品S1～S12全部呈現(xiàn)正相關(guān)，整體相似度在0.80～1.00，有一定的波動(dòng)情況，樣品S3、S11、S12的相似度相對(duì)較低，表明不同產(chǎn)地不同批次的薤白樣品質(zhì)量存在著差異。2.5.3 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA分析是通過(guò)降維的思想在損失很少信息的前提下將多個(gè)互相關(guān)聯(lián)的變量轉(zhuǎn)化成少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,可以用較少的變量去解釋原始多變量中的大多數(shù)變異[16]。利用12批次薤白樣品的9個(gè)共有峰峰面積為變量，結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，計(jì)算主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率及因子載荷矩陣。結(jié)果如表2、3所示。第1主成分的特征根為4.321，能夠解釋的總變異為58.552%，第2主成分的特征根為1.816，能夠解釋的總變異為16.130%，第3主成分的特征根為1.740，能夠解釋12.844%的變異，因此提取主成分3個(gè)，累積貢獻(xiàn)率可達(dá)87.526%，可代表薤白樣品87.526%的信息。以絕對(duì)值為依據(jù)，第1主成分的信息主要來(lái)自于胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、9號(hào)、7號(hào)、1號(hào)峰峰面積、第2主成分的信息主要來(lái)自于4號(hào)峰峰面積、第3主成分的信息主要來(lái)自于3號(hào)峰峰面積。將12批次薤白樣品的9個(gè)共有峰峰面積為變量導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件建模，得到PCA得分圖（圖5），PCA得分圖表明以第1主成分為依據(jù)，t[1]軸將12批樣品分成2部分，表明12批次薤白樣品質(zhì)量存在著較大差異。

圖2 薤白HPLC特征圖譜共有峰

表2 PCA特征值及方差貢獻(xiàn)率

表3 PCA因子載荷矩陣

2.5.4 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）分析 因?yàn)镻CA為一種無(wú)監(jiān)督的模型驗(yàn)證方法，并不能夠?qū)λ袠颖炯右詤^(qū)分以使得每個(gè)樣本對(duì)模型都有相同的貢獻(xiàn)。所以，當(dāng)樣本組間差異大而組內(nèi)差異較小時(shí)，PCA分析難以區(qū)分和發(fā)現(xiàn)組內(nèi)差異。因此有必要采用一種有監(jiān)督模式的OPLS-DA分析[17]。

為進(jìn)一步尋找導(dǎo)致薤白質(zhì)量差異的標(biāo)志成分，本研究將12批薤白中9個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，以獲得OPLS-DA分析模型，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，在模型中解釋能力參數(shù)2、2分別為0.940和0.965，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2（cum）為0.903，表明該模型預(yù)測(cè)能力較好，12批薤白共有峰峰面積均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，將樣品根據(jù)PCA分析結(jié)果分為2類。對(duì)所建立的OPLS-DA模型進(jìn)行200次置換檢測(cè)，結(jié)果顯示2＝(0.0，0.512)，2＝(0.0，?2.22)，由于2擬合直線軸截距為?2.22，為負(fù)數(shù)，且最右側(cè)點(diǎn)2和2均高于左側(cè)，所以模型未出現(xiàn)過(guò)擬合的情況[18]，表明所構(gòu)建的OPLS-DA模型可以作為判別12批次薤白質(zhì)量成分的差異。由變量貢獻(xiàn)值圖（圖5）可見(jiàn)，VIP值大于1的有5號(hào)峰（尿苷）、6號(hào)峰（鳥(niǎo)苷）、8號(hào)峰（腺苷），VIP值分別為1.80361、1.305 27、1.201 45。因此，此3種成分可能是薤白的主要差異成分，可作為薤白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［含量測(cè)定］項(xiàng)的參考組分[19]。

圖4 PCA得分圖

圖5 OPLS-DA得分圖(A)、置信檢測(cè)圖(B) 和變量貢獻(xiàn)值圖(C)

2.5.5 聚類分析 將9個(gè)薤白HPLC特征圖譜共有峰峰面積作為變量導(dǎo)入Origin Pro 2021軟件進(jìn)行聚類分析時(shí)，行標(biāo)簽為樣本編號(hào)，列標(biāo)簽為9個(gè)共有峰名稱，對(duì)行數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化使得行數(shù)據(jù)具有可比性，采用平均聚類方法、曼哈頓距離類型，得到圖7，由藍(lán)至黃至紅的顏色及顏色深淺變化則表示薤白9個(gè)特征共有峰的峰面積差異程度。聚類分析將12批樣品分為2大類，S3、S11、S12被分為一大類，其余樣品則被分為另一大類。由此可知，不同薤白樣品的特征成分含量可能存在顯著差異，也不可僅僅依靠薤白產(chǎn)地、個(gè)頭大小等對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，基于特征圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和QAMS法的薤白分析方法可為薤白的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供快速、準(zhǔn)確的分析策略。

圖6 12批次薤白樣品聚類分析熱圖

2.6 多指標(biāo)成分的含量測(cè)定

為了對(duì)薤白更好地進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，在特征圖譜的基礎(chǔ)上，建立了QAMS方法測(cè)定胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷4個(gè)成分含量。

2.6.1 供試品溶液的制備 同“2.1”項(xiàng)。

2.6.2 對(duì)照品溶液的制備 同“2.2”項(xiàng)。

2.6.3 色譜條件 同“2.3”項(xiàng)。

2.6.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6，20 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，測(cè)定對(duì)照品的色譜峰面積。以各對(duì)照品濃度（）對(duì)相應(yīng)峰面積（）進(jìn)行回歸處理，得4個(gè)薤白核苷成分的回歸方程及線性范圍。結(jié)果表明4個(gè)薤白核苷成分的線性關(guān)系良好，如表4所示。

表4 4個(gè)核苷成分的線性回歸方程

2.6.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液S1，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷峰的峰面積RSD分別為1.11%、0.79%、0.73%、0.43%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以腺苷峰為參照，記錄各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷峰相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.17%、0.75%、0.22%、0.18%，相對(duì)峰面積RSD分別為1.44%、1.34%、0.54%、0.70%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（S1）適量，分別于0、2、4、8、12、18、24 h以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷號(hào)峰峰面積RSD分別為1.49%、1.01%、0.69%、0.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取適量已測(cè)定含量樣品（S1），按“2.3”項(xiàng)方法將稱樣量減半平行制備6份供試品溶液，并以1︰1的比例加入定量對(duì)照品，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷的平均加樣回收率分別為97.88%、103.4%、99.22%、97.63%，RSD分別為1.60%、0.74%、2.27%、2.01%。

2.6.9 相對(duì)校正因子（）的測(cè)定 在建立的梯度洗脫HPLC色譜條件“2.1”下，取混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5、10、15、20、25、30、35 μL[20]，記錄各成分的峰面積，以腺苷為內(nèi)參物，計(jì)算待測(cè)成分與內(nèi)參物的[21]。

＝(A/C)/(A/C)

A為待測(cè)成分峰面積，C為待測(cè)成分量濃度，s為內(nèi)參物峰面積，s為內(nèi)參物濃度

結(jié)果表明，腺苷作為內(nèi)參物時(shí)其他成分的的RSD均小于3%，見(jiàn)表5。

2.6.10 不同色譜柱對(duì)的影響 取“2.2”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為20 μL，采用皖儀3100高效液相色譜儀，分別考察Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB C18、Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Synergi Hydro-RT C18共4根色譜柱對(duì)各核苷的影響，結(jié)果胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷的RSD依次為0.70%、0.57%、0.77%，表明色譜柱的更換對(duì)各成分無(wú)顯著性影響，見(jiàn)表6。

表5 3個(gè)待測(cè)成分的f值

表6 不同色譜柱對(duì)f的影響

2.6.11 不同體積流量對(duì)的影響 實(shí)驗(yàn)采用皖儀3100高效液相色譜儀系統(tǒng)，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，考察不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）對(duì)4個(gè)核苷值的影響，各成分之間值重復(fù)性良好，其RSD均小于3%，表明不同體積流量對(duì)各成分值無(wú)顯著性影響，見(jiàn)表7。

表7 不同體積流量對(duì)f值的影響

2.6.12 不同柱溫對(duì)的影響 實(shí)驗(yàn)采用皖儀3100高效液相色譜儀系統(tǒng)，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，分別在不同柱溫（25、30、35 ℃）條件下測(cè)定核苷的值，結(jié)果顯示各成分之間的RSD均小于3%，表明柱溫對(duì)各成分的值無(wú)顯著性影響，見(jiàn)表8。

表8 不同柱溫對(duì)f值的影響

2.6.13 不同儀器對(duì)的影響 實(shí)驗(yàn)分別采用皖儀3100，Agilent 1200高效液相色譜儀系統(tǒng)，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，考察不同儀器對(duì)薤白核苷值的影響，結(jié)果各成分值的RSD均小于5%，見(jiàn)表9。

2.6.14 待測(cè)成分色譜峰定位 色譜峰的準(zhǔn)確定位是保證QAMS法應(yīng)用的前題[22-23]，為了僅在采用腺苷為對(duì)照品時(shí)，能夠確認(rèn)胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷色譜峰的位置，從而通過(guò)獲得的值同時(shí)計(jì)算另外3個(gè)成分的含量，達(dá)到QAMS的目的，故取“2.2”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，考察了采用不同儀器（儀器1：皖儀3100，儀器2：Agilent 1200）、不同色譜柱（柱1：Agilent Eclipse Plus C18、柱2：Agilent 5 TC-C18（2）、柱3：Welch Ultimate XB-C18）和不同操作人員（A、B、C）時(shí)另外3個(gè)薤白核苷成分與腺苷之間的保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間[22, 24]?？疾旖Y(jié)果表明，另外3個(gè)薤白核苷成分和內(nèi)參物腺苷之間的保留時(shí)間差值和相對(duì)保留時(shí)間值波動(dòng)較小，其RSD均小于5%（表10、11），因此保留時(shí)間差值法和相對(duì)保留時(shí)間法都可用于色譜峰定位。

表9 不同儀器對(duì)f值的影響

表10 保留時(shí)間差值

表11 相對(duì)保留時(shí)間

2.6.15 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 12批次薤白樣品，采用所建立的HPLC方法，首先通過(guò)外標(biāo)法（ESM）分別計(jì)算出薤白樣品中胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷的含量，然后以腺苷為內(nèi)參物，并通過(guò)測(cè)得的，根據(jù)QAMS的公式定量計(jì)算[22]。

W=(W×A)/(×A)

W為待測(cè)成分量，A為待測(cè)成分峰面積，s為內(nèi)參物量，A為內(nèi)參物峰面積，為待測(cè)成分與參照物分別計(jì)算出其余3個(gè)成分的含量

將ESM實(shí)測(cè)值與QAMS計(jì)算值進(jìn)行配對(duì)檢驗(yàn)[25]，結(jié)果值均＞0.05，表明2種方法測(cè)定結(jié)果之間無(wú)顯著差異，提示建立的QAMS法有較好的準(zhǔn)確性和可行性，見(jiàn)表12。

表12 ESM和QAMS測(cè)定12批薤白樣品中4個(gè)核苷的含量

3 討論

3.1 提取條件和色譜條件的優(yōu)化

本研究對(duì)不同提取溶劑（10%甲醇、25%甲醇、10%乙醇和純水），不同料液比（1∶50、2∶50、3∶50），不同提取方式時(shí)間（加熱回流、超聲），不同提取時(shí)間（20、30、40 min），不同流動(dòng)相水相組成（純水、0.1%甲酸、0.1%磷酸）進(jìn)行考察。最終選定以10%甲醇作為提取溶劑，料液比1∶50，超聲30 min鐘作為樣品的提取方法?？疾榱薃gilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，以Agilent Eclipse Plus C18色譜柱分離效果最好。并分別考察了流動(dòng)相為甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水時(shí)供試品溶液HPLC色譜圖中6個(gè)共有峰成分的分離狀況，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相水相為0.1%甲酸水時(shí)或者0.1%磷酸水時(shí)，譜圖基線浮動(dòng)大，峰形較差，因此選擇甲醇-純水為流動(dòng)相。

3.2 QAMS法用于薤白多組分含量測(cè)定質(zhì)量控制的合理性

根據(jù)QAMS法的指導(dǎo)原則，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)選擇藥材中的有效成分或指標(biāo)成分，且應(yīng)與待測(cè)成分為同類成分或母核相同，光譜特性基本一致[15]，因腺苷為薤白治療心絞痛、心肌梗塞主要有效成分[26]。且性質(zhì)相對(duì)較穩(wěn)定，峰形對(duì)稱度、分離度均良好，因此本研究所建立的QAMS法選擇以腺苷作為內(nèi)參物，結(jié)合OPLS-DA分析篩選出的變量VIP值貢獻(xiàn)大于1的有尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷，因此，分別以此4類核苷作為薤白多組分含量測(cè)定的質(zhì)控成分，建立了內(nèi)參物腺苷與待測(cè)成分胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷的，構(gòu)建了能夠適用于同時(shí)測(cè)量薤白多組分的QAMS法，同時(shí)以ESM法驗(yàn)證QAMS法的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明QAMS法和ESM法測(cè)定薤白中胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷4種核苷成分準(zhǔn)確度并無(wú)明顯差異，因此可用QAMS法代替外標(biāo)法對(duì)薤白中4核苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定，既降低了實(shí)驗(yàn)中對(duì)照品、儀器的投入成本，同時(shí)保證了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，可更加快速準(zhǔn)確地對(duì)薤白質(zhì)量做出評(píng)價(jià)。但是從測(cè)量值結(jié)果來(lái)看，各批次薤白藥材4種核苷類成分含量存在一定的批間差異，同時(shí)也表明了對(duì)于擁有多組分多靶點(diǎn)共同作用的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)應(yīng)建立多指標(biāo)檢測(cè)的重要性。

綜上所述，本研究建立了準(zhǔn)確可靠的可鑒別和分析薤白的HPLC方法；并從所建立的特征圖譜上指認(rèn)了9個(gè)共有峰，采用SPSS、SIMCA、Origin軟件對(duì)12批不同產(chǎn)地薤白飲片樣品進(jìn)行相似度分析、PCA、OPLS-DA分析。建立了內(nèi)參物腺苷與待測(cè)成分胞苷、尿苷、腺苷的，通過(guò)對(duì)12批市售不同產(chǎn)地薤白飲片中4個(gè)核苷成分含量的測(cè)定，以傳統(tǒng)ESM法測(cè)定結(jié)果驗(yàn)證QAMS測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，為薤白藥材的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1]中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 392.

[2]Ren Y L, Zheng W, Yu Z W,. Determination of fe, ca, mn, cr, ni and cu inby aas [J]., 2012, 3: 87-91.

[3]王榮, 白思慧, 王露露, 等. 薤白的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)野生植物資源, 2021, 40(10): 73-82.

[4]王苗, 張榮榕, 馬馨桐, 等. 中藥薤白藥食同源功效探析 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2020, 16(6): 195-201.

[5]王彤. 薤白化學(xué)成分的研究 [D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2017.

[6]楊依然. 薤化學(xué)成分與生物活性研究 [D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2021.

[7]盛艷華, 李萌萌, 郭云龍, 等. 薤白化學(xué)成分及其提取分離研究進(jìn)展 [J]. 特產(chǎn)研究, 2020, 42(5): 61-70.

[8]Baba M, Ohmura M, Kishi N,. Saponins isolated fromG. Don and antitumor-promoting activities of isoliquiritigenin and laxogenin from the same drug [J]., 2000, 23(5): 660-662.

[9]Okuyama T. Studies on the prevention of chemical carcinogens in natural resources (11): antitumor activities of Chinese drug Xiebai and the Kampo containing Xiebai [J]., 1995, 49(3): 261-265.

[10]譚中英, 張錦紅, 劉瑀曦, 等. 薤白平喘作用有效部位的篩選研究 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2011, 13(8): 40-41.

[11]陳錫雄. 薤白抑菌作用的初步研究 [J]. 杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2004, 3(4): 337-340.

[12]高森, 王蘋, 唐鋮, 等. 基于HPLC指紋圖譜、多指標(biāo)成分含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)的濕熱痹片質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5454-5461.

[13]王智民, 高慧敏, 付雪濤, 等. “一測(cè)多評(píng)”法中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2006, 31(23): 1925-1928.

[14]Hong Y, Liao X Y, Chen Z L. Determination of bioactive components in the fruits ofBunge by HPLC-MS/MS and quality evaluation by principal components and hierarchical cluster analyses [J]., 2021, 11(4): 465-471.

[15]羅家敏, 高雯, 李萍. 指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法的梔子質(zhì)量控制方法研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(11): 3480-3486.

[16]熊婧, 李慧勇, 李廣生, 等. 化學(xué)計(jì)量學(xué)在中藥色譜分析中的應(yīng)用探討 [J]. 藥物分析雜志, 2021, 41(10): 1681-1689.

[17]Shen T, Yu H, Wang Y Z. Assessing geographical origin ofusing untargeted chromatographic fingerprint, data fusion and chemometrics [J]., 2019, 24(14): 2562.

[18]李志平, 張穎, 高雨秋, 等. 基于HPLC多指標(biāo)成分定量控制結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的益氣通絡(luò)顆粒質(zhì)量研究 [J]. 中藥材, 2022, 45(9): 2188-2194.

[19]Razali M T A, Zainal Z A, Maulidiani M,. Classification of raw stingless bee honeys by bee species origins using the NMR- and LC-MS-based metabolomics approach [J]., 2018, 23(9): 2160.

[20]羅祖良, 仇峰, 韋日偉, 等. 相對(duì)校正因子在中藥多指標(biāo)測(cè)定中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2012, 43(7): 1448-1452.

[21]袁漢文, 呂夢(mèng)穎, 羅江溢, 等. 基于特征圖譜和一測(cè)多評(píng)法的黃柏質(zhì)量控制研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(17): 5491-5496.

[22]黃遠(yuǎn), 董福越, 李楚源, 等. 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定板藍(lán)根中6種化學(xué)成分的含量 [J]. 中草藥, 2021, 52(3): 845-851.

[23]王智民, 錢忠直, 張啟偉, 等. 一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(6): 657-658.

[24]徐文武, 謝濤, 呂東峰, 等. 一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定紅參中11種人參皂苷的含量 [J]. 中草藥, 2021, 52(7): 2099-2105.

[25]劉艷芬, 段芳, 張翹, 等. 基于HPLC-QAMS及化學(xué)計(jì)量學(xué)的利膽石顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(19): 6044-6053.

[26]趙書田, 劉理, 秦嫚嫚, 等. 薤白中皂苷類化合物種類及其藥理作用的研究進(jìn)展 [J]. 中成藥, 2021, 44(11): 3596-3603.

Quality evaluation ofbased on fingerprint HPLC spectrum combined with chemometrics and quantitative analysis of multi-components with a single-marker

MENG Jun-hua1,2,3, LIU Yuan1,2,3, ZHAN Hui-hui1,2,3, TANG Hong1,2,3, CUI Pei-wu1,2,3

1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Tertiary Research Laboratory of Medicinal Properties and Efficacy of Traditional Chinese Medicines, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. Mycomedicine Research Lab, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To establish an analytical method used for quality control of Xiebai (AMB) employing HPLC characteristics spectrum combined with stoichiometry and quantitative analysis of multi-components with a single-marker methodHPLC was performed on Agilent 1200 HPLC system equipped with DAD detector and Agilent Eclipse Plus C18column (250 mm × 4.6mm, 5μm), using methanol-ultrapure water solution as mobile phase employing gradient elution procedure with the flow rate of 1.0 mL/min, column temperature of 30 ℃, detection wavelength of 261 nm, and injection volume of 20 μL. Cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were used to identify chemical patterns of different batchesof AMB at a visualization analysis level. The QAMS method was also adopted to evaluate the main components contents including adenosine, cytidine, uridine, and guanosine inAMB samples with adenosine as the internal reference, and the relative correction factors of the internal reference and cytidine, uridine and guanosine were established subsequently. Finally, to confirm validity of QAMS method, the comparison of the contents data analyzed by QAMS method and external standard method (ESM) was also carried out.The established HPLC characteristics spectrum method can fully reflect the chemical composition of AMB. The analysis method showed specific, accurate and reliable characteristics and the relative correction factors have good repeatability. Moreover, the results of chemometric analysis were in accord with data calculated from methods mentioned above. In addition, three possible characteristic components were identified by OPLS-DA and there was no significant difference found between QAMS and ESM, which can provide a reference for quality evaluation of AMB.The established HPLC fingerprint spectrum method, stoichiometry method and multi-index components analytical method with QAMS can provide a reference for quality control and evaluation of AMB and other botanic drugs.

; HPLC fingerprint spectrum; chemometrics; adenosine; cytidine; uridine; guanosine; quantitative analysis of multi-components with a single marker; external standard method

R286.2

A

0253 - 2670(2023)21 - 7176 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.026

2023-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973211/C0033375）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目［D2022139（A2022005-17）］；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（湘教通［2022］174號(hào)-2918）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題（校行研字［2022］20號(hào)-2022CX87）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)“十四五”重點(diǎn)學(xué)科-生物工程學(xué)科（校行發(fā)規(guī)字[2023]2號(hào)）

孟俊華，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量與藥效分析。

通信作者：崔培梧，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量及藥效分析。E-mail: cuipeiwu@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]