季君珂，宓曉雨，袁楊洋，程 宇，張文棟，張 晨，江 蕓

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210023）

生物被膜是一種微生物在不利環(huán)境條件下的生存機(jī)制和適應(yīng)形式[1]。在食品加工環(huán)境中，腐敗菌和致病菌都可能污染食物，并常以多菌種生物被膜的形式存在[2]。微生物、接觸表面、存活環(huán)境三者之間發(fā)生各種相互作用，對(duì)生物被膜的結(jié)構(gòu)與活性產(chǎn)生復(fù)雜影響[3-4]。

大腸桿菌（Escherichia coli）是評(píng)價(jià)食品污染常用指示菌之一，食品中大腸菌群含量表示食品被糞便污染的程度，一些血清型菌株攜帶毒力基因而具致病性[5-6]。在生豬屠宰、胴體分割、貯運(yùn)銷(xiāo)售過(guò)程中極易導(dǎo)致肉類(lèi)食品污染大腸桿菌。假單胞菌（Pseudomonas）是肉品貯藏末期典型的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，具有很強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生腐敗產(chǎn)物的能力[7]。研究表明，大腸桿菌和假單胞菌均可在肉品生產(chǎn)加工接觸表面以及肉品表面形成生物被膜，且假單胞菌已成為近年來(lái)生鮮肉研究中生物被膜的模型細(xì)菌[8]。生物被膜附著在接觸表面，使菌株細(xì)胞對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗力增強(qiáng)，不易清除，成為細(xì)菌交叉污染源頭和傳播中心，對(duì)食品安全構(gòu)成重大威脅。據(jù)報(bào)道，生物被膜中的細(xì)菌與浮游細(xì)菌相比，抗性增加10～1000 倍[9]。生物被膜還會(huì)增加人類(lèi)患食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，據(jù)估計(jì)80%的細(xì)菌性感染與生物被膜有關(guān)[10-11]。而多菌種混合被膜在食品生產(chǎn)環(huán)境中的存在更為廣泛，且近年研究發(fā)現(xiàn)混合生物被膜比單種生物被膜對(duì)抑菌劑、抗生素等表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性[12-14]，這將對(duì)肉品造成反復(fù)持久的交叉污染[14-16]，進(jìn)一步加大安全風(fēng)險(xiǎn)。此外，大量研究表明生物被膜的形成具有顯著的菌株差異，研究肉源分離株混合生物被膜的形成對(duì)于肉品生產(chǎn)過(guò)程中微生物的污染控制更具實(shí)際指導(dǎo)意義[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)加工實(shí)際情況，以肉源大腸桿菌和肉源假單胞菌為研究對(duì)象，首先分析兩種菌不同菌株生物被膜形成能力；然后采用不銹鋼片計(jì)數(shù)法探討兩種菌不同菌株混合被膜形成過(guò)程中被膜量動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而研究?jī)煞N菌混合成膜時(shí)胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）組成和微觀(guān)結(jié)構(gòu)的變化；采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）絕對(duì)定量方法分析生物被膜和浮游菌中相關(guān)成膜基因表達(dá)差異及接觸表面基因表達(dá)絕對(duì)量的變化；旨在為揭示肉源腐敗微生物混合被膜形成規(guī)律提供科學(xué)基礎(chǔ)，以及為肉類(lèi)生產(chǎn)加工中微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及污染控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌共31 株，為本實(shí)驗(yàn)室前期從某生豬屠宰車(chē)間（傳送帶表面、操作臺(tái)表面，以及車(chē)間刀具、手套表面）及豬酮體表面中分離所得[20]。假單胞菌共13 株，為本實(shí)驗(yàn)室前期從腐敗豬肉中分離所得[21]。

食品級(jí)304不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm，2B光潔面）南通順豐醫(yī)療器械有限公司；96 孔透明細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、酵母提取物（yeast extract，YE）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基基礎(chǔ)、CFC基礎(chǔ)添加劑 北京陸橋技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫、乙醇、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、丙酮（均為分析純）南京藤春生物科技有限公司；苯酚（分析純）南京峰昌生物科技有限公司；濃硫酸（分析純）南京化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒 南京建成生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒（D9108A）、PrimeSTAR?Max DNA聚合酶、Prime Script? RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒日本Takara公司；DNA Marker（DL 2000）、Gel Red核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M2多功能酶標(biāo)儀、Thermal Cycler普通PCR儀美國(guó)Molecular Devices公司；2-16KL高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；Nano-30微量紫外分光光度計(jì) 杭州奧盛儀器有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HVE-50立式壓力蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；HX-4拍打式無(wú)菌均質(zhì)器 上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司；QL-200微型渦旋混合儀 海門(mén)其林貝爾儀器有限公司；ZQTY-70臺(tái)式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LSM 710共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

將凍存的大腸桿菌和假單胞菌分別在TSA-YE平板上劃線(xiàn)活化兩次，分別在37 ℃培養(yǎng)24 h和28 ℃培養(yǎng)48 h。挑取兩菌單菌落分別接種于3 mL和6 mL TSB中，分別于37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)18 h和28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2 次，使菌數(shù)達(dá)到穩(wěn)定期。取1 mL培養(yǎng)好的菌液離心（8000×g、5 min、4 ℃），棄上清液，用PBS（pH 7.2）洗滌3 次，調(diào)整菌懸液濃度為108CFU/mL備用。

1.3.2 大腸桿菌和假單胞菌生物被膜形成能力測(cè)定

將1.3.1節(jié)菌懸液用新鮮TSB梯度稀釋至濃度為102CFU/mL，吸取180 μL至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以無(wú)菌TSB為對(duì)照，封口膜封口，25 ℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，無(wú)菌蒸餾水漂洗3 次，室溫干燥30 min。吸取0.25 g/100 mL結(jié)晶紫200 μL于微孔中染色30 min，棄去染液，無(wú)菌蒸餾水漂洗3 次，使用200 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液洗脫黏附菌體30 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處光密度（OD570nm）。每個(gè)菌株重復(fù)6 次。

將測(cè)得的各菌株平均OD值與臨界OD值（ODC=對(duì)照組OD值＋3 倍標(biāo)準(zhǔn)差[22]）進(jìn)行比較，對(duì)被膜形成能力進(jìn)行分類(lèi)：無(wú)生物被膜形成能力：OD≤ODC；較弱生物被膜形成能力：ODC＜OD≤2×ODC；中等生物被膜形成能力：2×ODC＜OD≤4×ODC；較強(qiáng)生物被膜形成能力：4×ODC＜OD。

1.3.3 大腸桿菌與假單胞菌混合被膜形成動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)分析

根據(jù)1.3.2節(jié)結(jié)果，選取被膜形成能力不同的菌株進(jìn)行大腸桿菌和假單胞菌混合被膜形成動(dòng)態(tài)過(guò)程研究。

1.3.31 大腸桿菌與假單胞菌混合被膜制備

選用食品級(jí)304不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm，2B光潔面）作為生物被膜形成的接觸載體。將1.3.1節(jié)制備的大腸桿菌和假單胞菌懸液?jiǎn)为?dú)或共同接種至含新鮮TSB和不銹鋼片（一半浸入）的無(wú)菌玻璃盒中，分別為單菌生物被膜組和混合生物被膜組，其中兩種細(xì)菌濃度均為106CFU/mL。無(wú)菌保鮮膜封口，25 ℃靜置培養(yǎng)12、24、36、72、120 h和168 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.32 大腸桿菌與假單胞菌生物被膜的收集與計(jì)數(shù)

培養(yǎng)結(jié)束后取出不銹鋼片并用無(wú)菌生理鹽水漂洗3 次以去除表面未黏附菌體，置于均質(zhì)袋中充分拍打均質(zhì)（8 次/s、1 min），正反面各拍打1 次[23]。梯度稀釋后選擇合適稀釋度進(jìn)行涂布，其中大腸桿菌單菌被膜組采用TSA-利福平平板，假單胞菌單菌被膜組采用CFC假單胞菌選擇性平板，混合被膜組采用上述兩種選擇性平板同時(shí)進(jìn)行涂布。涂布結(jié)束后大腸桿菌于37 ℃培養(yǎng)24 h，假單胞菌于28 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.4 生物被膜CLSM分析

將編碼含有紅色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pUC-mcherrystr（3830 bp）[24]和含有編碼綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒sfgfp-MCS（5855 bp）[25]分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌和假單胞菌中。綠色熒光菌和紅色熒光菌的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為490～550 nm和560～700 nm。采用1.3.3.1節(jié)方法制備含有熒光蛋白菌株的單菌被膜和混合被膜，25 ℃靜置培養(yǎng)24、72 h和168 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出不銹鋼片并用無(wú)菌生理鹽水漂洗3 次。采用CLSM觀(guān)察單菌和混合生物被膜在鋼片表面的分布情況。

1.3.5 大腸桿菌與假單胞菌混合被膜形成時(shí)EPS含量分析

按1.3.3.1節(jié)制備大腸桿菌與假單胞菌單菌被膜和混合被膜，培養(yǎng)72、168 h取出不銹鋼片并用無(wú)菌生理鹽水漂洗3 次。采用棉簽擦拭法收集不銹鋼片表面生物被膜，擦拭后棉球置于離心管中充分渦旋3 min，得到的菌懸液用于EPS含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

參考Cao Bin等[26]的方法制備菌懸液中松散型EPS（loose EPS，L-EPS）和緊密型EPS（bound EPS，B-EPS）。按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定L-EPS和B-EPS中的蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.0018x＋0.1514（R2=0.9978），其中x為蛋白質(zhì)量濃度/（μg/mL），y為吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別計(jì)算L-EPS和B-EPS中蛋白含量，進(jìn)而計(jì)算出總EPS（total EPS，T-EPS）中的蛋白含量?？偺呛坎捎帽椒?硫酸法[27]測(cè)定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.1956x＋0.0818（R2=0.9973），其中x為葡萄糖質(zhì)量濃度/（μg/mL），y為吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算L-EPS和B-EPS中多糖含量，進(jìn)而計(jì)算出T-EPS中多糖含量。

1.3.6 生物被膜和浮游菌中相關(guān)成膜基因的表達(dá)水平測(cè)定

采用real-time PCR絕對(duì)定量方法測(cè)定單菌被膜與混合被膜、單菌培養(yǎng)液與混菌培養(yǎng)液中浮游菌的相關(guān)成膜基因表達(dá)量變化，分別基于單位面積和單位菌數(shù)進(jìn)行基因表達(dá)量分析。

1.3.6.1 生物被膜和浮游菌的收集及培養(yǎng)計(jì)數(shù)

以食品級(jí)304不銹鋼片為接觸載體，25 ℃靜置培養(yǎng)72 h和168 h后收集生物被膜，方法同1.3.3.1節(jié)。將均質(zhì)液離心（12000×g、15 min、4 ℃），沉淀用于核酸提取。同時(shí)對(duì)不銹鋼片上的生物被膜進(jìn)行選擇性平板計(jì)數(shù)，方法同1.3.3.2節(jié)，菌數(shù)結(jié)果用于生物被膜基于單位菌數(shù)基因表達(dá)量的計(jì)算。

取出鋼片后，充分渦旋剩余培養(yǎng)液，吸取2 mL培養(yǎng)液于離心管中，無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3 次并等量重懸（8000×g、5 min、4 ℃），取菌體沉淀用于核酸提取。同時(shí)對(duì)培養(yǎng)液中的浮游菌進(jìn)行選擇性平板計(jì)數(shù)，選擇性培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同1.3.3.2節(jié)，菌數(shù)結(jié)果用于培養(yǎng)液中浮游菌基于單位菌數(shù)基因表達(dá)量的計(jì)算。

1.3.62 總RNA提取及cDNA合成

按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用核酸蛋白微量測(cè)定儀測(cè)定提取的總RNA濃度和純度，確定提取的RNA濃度、純度合格（OD260nm/OD280nm為1.8～2.0），調(diào)整RNA濃度后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系（10 μL）：2 μL 5×Prime Script RT Master Mix混合液、2 μL RNA、6 μL去RNA酶水。反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃、15 min，85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s，4 ℃，∞。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20 ℃保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.63 成膜基因特異性確定

查閱文獻(xiàn)共得到與大腸桿菌成膜相關(guān)的基因40 個(gè)[28-34]，與假單胞菌成膜相關(guān)的基因9 個(gè)[35-36]，采用real-time PCR驗(yàn)證每個(gè)基因在兩種細(xì)菌內(nèi)的擴(kuò)增情況，并最終確定3 個(gè)僅與大腸桿菌成膜相關(guān)的基因（csgA、papC、fimH），2 個(gè)僅與假單胞菌成膜相關(guān)的基因（cbrA、phoR）。各基因引物序列如表1所示，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 PCR primers used in this study

1.3.64 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由南京擎科公司構(gòu)建合成。取測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)質(zhì)粒，采用微量分光光度計(jì)測(cè)定純度和濃度，按下式計(jì)算質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)。

使用去RNA酶水梯度稀釋?zhuān)箻?biāo)準(zhǔn)檢測(cè)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為100～10-6ng/μL，作為模板。PCR體系（20 μL）：SYBR Green Master（2×）（ROX）10 μL，PCR正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水7.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解程序：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃停留15 s。以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值（lg（copies/μL））為橫坐標(biāo)，循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。

1.3.65 相關(guān)成膜基因real-time PCR分析

以1.3.6.2節(jié)制備的cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR，獲得相關(guān)基因的Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別計(jì)算單菌生物被膜、混合生物被膜中基于單位面積的基因絕對(duì)表達(dá)量（copies/cm2），以探討混合生物被膜形成時(shí)接觸材料表面基因的絕對(duì)表達(dá)水平變化。進(jìn)一步消除菌數(shù)差異，分別計(jì)算生物被膜、培養(yǎng)液浮游菌的基于單位菌數(shù)的基因絕對(duì)表達(dá)量（copies/CFU），以探討浮游菌形成生物被膜后菌體的基因表達(dá)差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行相應(yīng)數(shù)據(jù)及圖表分析，采用SPSS v17.0（IBM公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗(yàn)，兩組之間顯著性差異分析采用t檢驗(yàn)。結(jié)果以±s表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌和假單胞菌生物被膜形成能力分析

采用微孔板結(jié)晶紫染色法評(píng)估25 ℃培養(yǎng)72 h時(shí)31 株肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力。如圖1A所示，31 株肉源大腸桿菌中29 株（93.55%）菌株表現(xiàn)出生物被膜形成能力，但存在顯著的菌株差異性（P＜0.05）。進(jìn)一步對(duì)生物被膜形成能力進(jìn)行分類(lèi)發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)、中、弱、無(wú)4 種生物被膜表型的菌株數(shù)量分別為8、11、10、2 株，分別占菌株總數(shù)的25.81%、35.48%、32.26%、6.45%。如圖1B所示，13 株肉源假單胞菌于25 ℃培養(yǎng)72 h時(shí)，12 株（92.31%）菌株表現(xiàn)出生物被膜形成能力，亦存在顯著的菌株差異性（P＜0.05）。進(jìn)一步對(duì)生物被膜形成能力進(jìn)行分類(lèi)，強(qiáng)、中、弱、無(wú)4 種生物被膜表型的菌株數(shù)量分別為3、6、3、1 株，分別占菌株總數(shù)的23.08%、46.15%、23.08%、7.69%。

圖1 大腸桿菌（A）和假單胞菌（B）微孔板表面生物被膜形成能力Fig.1 Biofilm-forming capacity of E. coli (A) and Pseudomonas (B) on polystyrene microplate surfaces

2.2 大腸桿菌和假單胞菌混合被膜形成曲線(xiàn)分析

根據(jù)2.1節(jié)結(jié)果，選取成膜能力強(qiáng)的大腸桿菌菌株D4-18和C-13與成膜能力強(qiáng)的假單胞菌菌株Y2-11和成膜能力弱的假單胞菌菌株Y2-210進(jìn)行組合，探究大腸桿菌和假單胞菌不同菌株混合被膜的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程。

單菌生物被膜形成過(guò)程發(fā)現(xiàn)，兩株大腸桿菌D4-18和C-13成膜動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)不完全相同（圖2A），在36 h達(dá)到最大成膜量6.185（lg（CFU/cm2））和6.833（lg（CFU/cm2）），之后被膜量逐漸減少，而168 h時(shí)D4-18被膜量又增加；兩株假單胞菌成膜動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)差異明顯（圖2B），Y2-210波動(dòng)明顯，生物膜形成量逐漸增加，至72 h達(dá)到最多（6.16（lg（CFU/cm2））），Y2-11增加較快，至36 h時(shí)達(dá)到最多（6.61（lg（CFU/cm2））），之后維持相對(duì)穩(wěn)定。值得注意的是，根據(jù)上述微孔板結(jié)晶紫染色法培養(yǎng)72 h結(jié)果選取的強(qiáng)被膜形成能力假單胞菌Y2-210和弱假單胞菌Y2-11，與不銹鋼片被膜形成情況不完全相符，且二者在不銹鋼片表面培養(yǎng)72 h時(shí)成膜量相近，分別為6.16（lg（CFU/cm2））和6.33（lg（CFU/cm2））。

混合生物被膜中的大腸桿菌和假單胞菌形成曲線(xiàn)與其各自單菌被膜形成曲線(xiàn)存在較大差異，表明混合成膜時(shí)兩菌發(fā)生交互作用，且在不同成膜階段表現(xiàn)出不同的交互作用。大腸桿菌C-13被膜形成受假單胞菌Y2-11的影響與成膜階段有關(guān)，而假單胞菌Y2-11一直受到大腸桿菌C-13的抑制（圖2C）；大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-210在培養(yǎng)初期發(fā)生相互促進(jìn)，之后大腸桿菌D4-18始終受到假單胞菌Y2-210的抑制（圖2D）。結(jié)果表明，兩個(gè)菌株組合混合被膜形成過(guò)程中交互作用的動(dòng)態(tài)變化具明顯的菌株差異。

2.3 生物被膜CLSM分析結(jié)果

如圖3所示，培養(yǎng)24 h，大腸桿菌單菌生物被膜的紅色熒光信號(hào)呈現(xiàn)一定強(qiáng)度并出現(xiàn)聚集，表明大腸桿菌在不銹鋼片表面黏附并聚集，假單胞菌單菌生物被膜的綠色熒光信號(hào)弱于大腸桿菌，而混合生物被膜的熒光信號(hào)則更弱。培養(yǎng)72 h，單菌培養(yǎng)的大腸桿菌和假單胞菌熒光信號(hào)均增多增強(qiáng)，呈現(xiàn)更致密的分布，而混合生物被膜中紅色熒光面積和綠色熒光面積均明顯少于兩種單菌，表明混合培養(yǎng)時(shí)兩種單菌的生物被膜形成受到抑制。168 h，大腸桿菌和假單胞菌的被膜分布更加致密，而混合生物被膜中兩菌的分布不如單菌致密，表明此時(shí)仍表現(xiàn)為相互抑制。對(duì)比被膜量培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果，生物被膜形成過(guò)程中CLSM變化情況與被膜量的變化情況一致。

2.4 大腸桿菌和假單胞菌混合被膜形成過(guò)程中EPS的變化

2.4.1 EPS蛋白含量

如圖4所示，與72 h相比，168 h單菌生物被膜、混合生物被膜中L-EPS、B-EPS、T-EPS的蛋白含量均顯著增加（P＜0.05），表明隨著成膜時(shí)間延長(zhǎng)3 種EPS的蛋白質(zhì)分泌增多?；旌仙锉荒ぶ? 種EPS的蛋白含量并非都高于兩種單菌生物被膜，但均顯著低于兩單菌生物薄膜中的EPS蛋白含量之和（P＜0.05），其中72 h和168 h混合生物被膜中T-EPS蛋白含量分別較兩單菌生物被膜T-EPS蛋白含量之和減少31%和48%，表明兩菌混合成膜時(shí)蛋白質(zhì)的分泌受到抑制。此外，B-EPS的蛋白含量明顯低于L-EPS。

2.4.2 EPS多糖含量分析

如圖5所示，EPS多糖含量變化與蛋白含量變化類(lèi)似，隨著成膜時(shí)間延長(zhǎng)L-EPS、B-EPS、T-EPS的多糖含量均顯著增多（P＜0.05）。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜3 種EPS的多糖含量均顯著低于兩單菌生物被膜之和（P＜0.05），其中72 h和168 h混合生物被膜T-EPS多糖含量分別比兩單菌生物被膜T-EPS多糖含量之和減少38%和56%。表明兩菌混合成膜時(shí)多糖的分泌受到抑制。此外，B-EPS多糖含量明顯低于L-EPS（P＜0.05）。

圖5 大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-2 10生物被膜形成時(shí)EPS多糖含量變化Fig.5 Changes of polysaccharide content in EPS during biofilm formation by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

2.5 生物被膜和浮游菌中相關(guān)成膜基因的表達(dá)變化

大腸桿菌D4-18的pap C基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-3.342x＋36.583（R2=0.993）；fimH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-3.359x＋35.867（R2=0.997）；csgA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-3.089x＋34.695（R2=0.996）。假單胞菌Y2-210的phoR基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-4.0661x＋41.946（R2=0.997）；cbrA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=-3.802x＋43.178（R2=0.991）；其中x為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值（lg（copies/μL）），y為測(cè)得的Ct值。5 種成膜基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，Ct值在5～30之間，滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)要求。

2.5.1 生物被膜中單位面積基因絕對(duì)表達(dá)量的變化

如圖6所示，大腸桿菌、假單胞菌單菌生物被膜形成時(shí)，5 種基因均有一定水平表達(dá)，且隨著成膜時(shí)間延長(zhǎng)不銹鋼片上的表達(dá)量增加。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜形成過(guò)程中假單胞菌phoR、cbrA基因的絕對(duì)表達(dá)量未發(fā)生顯著變化，而大腸桿菌3 個(gè)基因的絕對(duì)表達(dá)量發(fā)生顯著變化，72 hpapC、csgA絕對(duì)表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），168 hcsgA絕對(duì)表達(dá)量仍極顯著增加（P＜0.01），而papC、fimH絕對(duì)表達(dá)量極顯著減少（P＜0.01）。

圖6 大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-2 10單種被膜與混合被膜中單位面積基因表達(dá)量的變化Fig.6 Changes of gene expression per unit area in single and mixedspecies biofilms formed by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

2.5.2 生物被膜和浮游菌中單位菌數(shù)基因的表達(dá)差異

考慮到生物被膜與培養(yǎng)液中浮游菌數(shù)存在差異，為消除此差異進(jìn)一步計(jì)算生物被膜、培養(yǎng)液浮游菌的單位菌數(shù)基因表達(dá)量。如圖7所示，與浮游菌相比，大腸桿菌單菌生物被膜和混合生物被膜中3 種成膜基因papC、fimH、csgA的單位菌數(shù)表達(dá)量在72 h和168 h均極顯著增加（P＜0.01），表明生物被膜形成時(shí)相關(guān)成膜基因的表達(dá)均顯著上調(diào)。與單菌培養(yǎng)液中浮游菌相比，混合培養(yǎng)液中的大腸桿菌浮游菌在72 h和168 hcsgA的單位菌數(shù)表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01），papC基因的單位菌數(shù)表達(dá)量?jī)H在72 h時(shí)極顯著降低（P＜0.01），而fimH的單位菌數(shù)表達(dá)量無(wú)顯著變化，表明混合培養(yǎng)時(shí)兩菌發(fā)生交互作用，對(duì)浮游菌中成膜相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜中papC和csgA的單位菌數(shù)表達(dá)量在72 h和168 h極顯著增加（P＜0.01），表明混合生物被膜形成時(shí)papC和csgA表達(dá)極顯著上調(diào)。

圖7 大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-2 10單種被膜與混合被膜中單位菌數(shù)基因表達(dá)量的變化Fig.7 Changes of gene expression per unit cell number in single and mixed-species biofilm formed by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

如圖7所示，與浮游菌相比，假單胞菌單菌生物被膜和混合生物被膜中2 種成膜基因phoR和cbrA的單位菌數(shù)表達(dá)量在72 h和168 h均極顯著增加（P＜0.01），表明生物被膜形成時(shí)相關(guān)成膜基因的表達(dá)均顯著上調(diào)。與單菌培養(yǎng)液中浮游菌相比，72 h時(shí)混合培養(yǎng)液中的假單胞菌浮游菌phoR表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），而cbrA基因表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），其余均無(wú)顯著變化，表明混合培養(yǎng)時(shí)兩菌發(fā)生交互作用，對(duì)浮游菌中成膜基因表達(dá)產(chǎn)生影響。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜中兩種成膜基因phoR和cbrA的表達(dá)量在72 h均極顯著減少（P＜0.01），表明混合成膜時(shí)兩種基因表達(dá)極顯著下調(diào)。

3 討論

食源性致病菌和腐敗菌黏附在食品表面并形成生物被膜是食品受到微生物持續(xù)性污染的主要來(lái)源，給食品工業(yè)帶來(lái)巨大損失[38]。研究表明，大多數(shù)食源性細(xì)菌例如沙門(mén)氏菌（Salmonella）、單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、氣單胞菌（Aeromonas）等均具有一定的生物被膜形成能力，且存在明顯菌株差異[39-41]。關(guān)于食源性大腸桿菌和假單胞菌的被膜形成能力比較也有相關(guān)報(bào)道。Bhardwaj等[42]從60 個(gè)乳制品和肉類(lèi)樣品中分離出32 株大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)30 株菌株具有成膜能力，其中15 株成膜能力較弱，存在明顯菌株差異。Radovanovic等[43]發(fā)現(xiàn)臨床環(huán)境及乳、肉制品中分離的108 株假單胞菌有98 株可以形成生物被膜，其中68 株具有中等成膜能力，8 株具有強(qiáng)成膜能力。本實(shí)驗(yàn)評(píng)估25 ℃培養(yǎng)72 h肉源分離菌株的生物被膜形成能力發(fā)現(xiàn)，31 株肉源大腸桿菌和13 株肉源假單胞菌中大部分菌株具有一定的生物被膜形成能力，并且具有明顯菌株差異。但是，F(xiàn)eng Yuqing等[44]對(duì)食品環(huán)境中分離的68株大腸桿菌進(jìn)行生物被膜形成能力分析，結(jié)果顯示所有菌株均不能形成生物被膜。Lianou等[45]研究發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌生物被膜的形成能力并沒(méi)有菌株差異。上述關(guān)于菌株生物被膜形成能力的報(bào)道并不完全一致，這可能是由于生物被膜的形成能力與菌種、菌株來(lái)源、培養(yǎng)條件、環(huán)境條件等有關(guān)[46]。微孔板結(jié)晶紫染色法是評(píng)價(jià)細(xì)菌生物被膜形成能力的常用方法，其簡(jiǎn)便快捷，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌生物被膜的檢測(cè)[47]。然而，Yuan Lei等[48]對(duì)從乳制品中分離出的假單胞菌分別采用微孔板結(jié)晶紫染色法和基于不銹鋼片的平板計(jì)數(shù)法分析生物被膜形成能力，發(fā)現(xiàn)兩種方法之間存在中等相關(guān)性；而Sadiq等[49]發(fā)現(xiàn)兩種方法之間沒(méi)有良好的一致性。本研究采用微孔板結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)72 h大腸桿菌D4-18成膜能力顯著高于C-13，而基于不銹鋼片成膜72 h C-13被膜量反而顯著多于D4-18；同時(shí)微孔板結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn)被膜形成能力分別為強(qiáng)和弱的兩株假單胞菌，基于不銹鋼片成膜72 h并無(wú)顯著差異，表明兩種評(píng)估方法結(jié)論不一致。不同材質(zhì)接觸面，由于表面粗糙度、疏水性、親水性等不同，可能影響細(xì)胞黏附和生物被膜形成[48]。

混合被膜內(nèi)不同菌種之間可發(fā)生不同交互作用，呈現(xiàn)促進(jìn)、競(jìng)爭(zhēng)或中立效應(yīng)[46]。有研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌可以抑制大腸桿菌[50-51]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[52]、變形鏈球菌（Streptococcus mutans）和單核細(xì)胞李斯特菌等細(xì)菌生物被膜的形成[53]。相反，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)假單胞菌可以促進(jìn)大腸桿菌[2]、鏈球菌[54]、氣單胞菌[55]和白色念珠菌（Monilia albican）生物被膜的形成。此外，大腸桿菌也有相關(guān)報(bào)道，它可以促進(jìn)白色念珠菌、抑制金黃色葡萄球菌等生物被膜的形成[56-57]。本研究中，大腸桿菌和假單胞菌混合成膜時(shí)在不同培養(yǎng)時(shí)間表現(xiàn)不同的交互作用，且本實(shí)驗(yàn)采用兩個(gè)菌株組合混合成膜，在成膜過(guò)程中表現(xiàn)出不同的交互作用變化，表明在混合被膜形成過(guò)程中，交互作用的變化與菌株和成膜階段有關(guān)[24]。本實(shí)驗(yàn)利用CLSM結(jié)合導(dǎo)入熒光蛋白基因的方法較好地觀(guān)察到混合生物被膜形成過(guò)程中發(fā)紅色熒光大腸桿菌和發(fā)綠色熒光假單胞菌微觀(guān)分布情況，且CLSM變化情況與被膜量培養(yǎng)計(jì)數(shù)變化情況一致。

生物被膜內(nèi)的細(xì)菌可以通過(guò)分泌EPS保護(hù)細(xì)菌免受惡劣環(huán)境的影響[58-59]。EPS是生物被膜中細(xì)胞周?chē)暮窕|(zhì)，既可以與被膜細(xì)胞緊密結(jié)合形成B-EPS，也可以間接附著在細(xì)胞表面形成L-EPS[26]。EPS中胞外多糖可作為胞外基質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)元素，通過(guò)相互作用決定生物被膜的機(jī)械穩(wěn)定性和黏附情況，胞外蛋白有助于生物被膜的形成和維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Chen Ping等[60]研究副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和單核細(xì)胞李斯特菌混合生物被膜中EPS化學(xué)成分的變化，發(fā)現(xiàn)生物被膜EPS中蛋白質(zhì)和多糖的含量均低于單菌生物被膜，這與本研究結(jié)果類(lèi)似。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和假單胞菌混合成膜過(guò)程中，L-EPS和B-EPS中蛋白質(zhì)和胞外多糖的分泌均受到了抑制，這可能是由于大腸桿菌和假單胞菌的相互作用影響蛋白質(zhì)和多糖的分泌。此外，本研究發(fā)現(xiàn)多糖含量的減少程度高于蛋白質(zhì)，表明胞外多糖是混合生物被膜結(jié)構(gòu)減少的主要原因[60]。

生物被膜形成過(guò)程中，由于生存環(huán)境和狀態(tài)的改變以及復(fù)雜的相互作用，可能影響成膜基因的表達(dá)，進(jìn)而改變細(xì)菌對(duì)食品表面的黏附情況，影響食品安全[61-62]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與培養(yǎng)液浮游菌相比，生物被膜形成時(shí)大腸桿菌和假單胞菌菌體相關(guān)成膜基因的表達(dá)均顯著上調(diào)，表明這些基因參與調(diào)控生物被膜形成?；旌仙锉荒ば纬蛇^(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)變化大多采用real-time PCR相對(duì)定量方法，與報(bào)道結(jié)果不完全一致；例如，在糞腸球菌（Enterococcus faecalis）存在下白色念珠菌的黏附相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而糞腸球菌的被膜形成相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)[63]。Xu Jingguo等[64]研究腸炎沙門(mén)氏菌與副蕈狀芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）形成雙菌生物被膜中菌株的基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)屬于腸炎沙門(mén)氏菌生物被膜形成和環(huán)境抗性途徑的基因顯著上調(diào)。本研究采用絕對(duì)定量方法，消除菌數(shù)差異后也可反映菌體基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與單菌生物被膜相比，混合生物被膜形成時(shí)大腸桿菌成膜基因papC、csgA的表達(dá)均顯著上調(diào)，而假單胞菌成膜基因phoR和cbrA表達(dá)在72 h顯著下調(diào)。上述關(guān)于混合生物被膜形成時(shí)相關(guān)基因表達(dá)變化的報(bào)道不完全一致，可能與菌種、菌株、成膜條件等因素有關(guān)[46]。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)基因表達(dá)量變化與混合成膜過(guò)程中交互效應(yīng)的變化不相符，可能是混合成膜時(shí)多個(gè)基因共同參與，而本實(shí)驗(yàn)采用絕對(duì)定量方法，僅分析了大腸桿菌特異性的3 個(gè)基因和假單胞菌特異性的2 個(gè)基因，關(guān)于其他成膜基因的變化尚需進(jìn)一步研究探討。此外，本研究基于不銹鋼片單位面積基因絕對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌、假單胞菌單菌生物被膜形成時(shí)，5 種基因均有一定量表達(dá)，且隨著成膜時(shí)間延長(zhǎng)不銹鋼片上的菌株基因表達(dá)量增加；與單菌生物被膜相比，混合生物被膜形成時(shí)基因絕對(duì)表達(dá)量發(fā)生不同程度變化，這與大腸桿菌和假單胞菌的生物膜形成量差異及兩者之間的交互作用有一定相關(guān)性。real-time PCR絕對(duì)定量方法不僅可以通過(guò)消除菌數(shù)差異分析菌體相關(guān)基因的表達(dá)差異，還可直接定量反映接觸表面或生長(zhǎng)環(huán)境中基因?qū)嶋H表達(dá)量，從而為評(píng)估環(huán)境和食品微生物安全風(fēng)險(xiǎn)水平提供更直接的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)肉源分離的大腸桿菌和假單胞菌進(jìn)行被膜形成能力比較，發(fā)現(xiàn)存在明顯的菌株差異。大腸桿菌和假單胞菌混合生物被膜形成過(guò)程中，不同成膜時(shí)間表現(xiàn)不同的交互作用變化。生物被膜形成過(guò)程中CLSM變化情況與被膜量培養(yǎng)計(jì)數(shù)的變化情況一致。在混合生物被膜形成過(guò)程中，EPS中蛋白質(zhì)和多糖的分泌受到抑制。采用real-time PCR絕對(duì)定量方法分析成膜基因表達(dá)量，基于單位菌數(shù)基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，單菌被膜與混合被膜、生物被膜黏附菌體與培養(yǎng)液浮游菌體相關(guān)基因的表達(dá)存在差異；基于不銹鋼片單位面積基因絕對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，5 種成膜基因均有一定量表達(dá)，混合成膜時(shí)基因絕對(duì)表達(dá)量發(fā)生不同程度變化。絕對(duì)定量方法不僅可以分析菌體相關(guān)基因的表達(dá)水平差異，還可直接定量反映接觸表面或生長(zhǎng)環(huán)境中基因?qū)嶋H表達(dá)量，從而為評(píng)估環(huán)境和食品微生物安全風(fēng)險(xiǎn)水平提供更直接的科學(xué)依據(jù)，這也對(duì)今后食源性致病菌生物被膜形成時(shí)的毒性評(píng)估具有重要指導(dǎo)意義。