楊昭君,崔文月,孫 菁,劉 偉

齲齒、牙髓炎是口腔科常見疾病,當(dāng)齲損范圍由牙表面向牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體蔓延至牙髓時,則會造成牙髓炎癥[1],繼續(xù)進展將導(dǎo)致更為嚴(yán)重的根尖周疾病。根管治療術(shù)常被用于治療牙髓及根尖周病變,但治療結(jié)束后牙齒易發(fā)生斷裂,最終導(dǎo)致患者拔除患牙[2]。近年來“牙髓再生治療”成為新的研究方向,人牙髓干細胞(hDPSCs)具有強大的增殖能力及多項分化潛能,可在體內(nèi)外受到多種胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié),是第三期牙本質(zhì)沉積的先決條件,在損傷修復(fù)及組織再生中發(fā)揮重要作用,被稱為理想的“種子細胞”[3-5]。牙齒遭受刺激后,牙髓將處于“損傷-修復(fù)”的動態(tài)平衡中,一旦微環(huán)境內(nèi)平衡被打破,牙髓將出現(xiàn)不可逆的損傷進而引發(fā)牙髓炎、牙吸收、根尖病變等情況。研究顯示,牙髓受到輕微刺激后成牙標(biāo)志物的表達均出現(xiàn)明顯上調(diào),形成“促炎-抗炎”的動態(tài)平衡,臨床上常可見修復(fù)性牙本質(zhì)生成,進而保護牙髓組織,避免其出現(xiàn)不可逆損傷[5-6]。然而,隨著刺激程度的加重和時間的延長,炎癥將抑制hDPSCs介導(dǎo)的組織再生的微環(huán)境,導(dǎo)致hDPSCs活性降低,成牙本質(zhì)分化標(biāo)記物表達也出現(xiàn)相應(yīng)下調(diào),細胞多向分化潛能也進一步受到影響。盡管炎癥通常被認(rèn)為是牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體損傷的原因,但它仍然是所有牙髓-牙本質(zhì)損傷修復(fù)或組織再生的必要階段。在進行牙髓組織修復(fù)或再生的過程中,hDPSCs與局部炎癥微環(huán)境的相互作用,可能會影響牙髓組織修復(fù)或再生的結(jié)果[7]。炎癥的牙髓組織中同樣存在牙髓干細胞,但相較正常牙髓干細胞,其增殖活性、多向分化能力還需進一步深入研究。作為革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,LPS在炎癥刺激發(fā)展的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,同時LPS作為構(gòu)建炎癥模型的好幫手,可在體外起到促進炎癥發(fā)展作用,促進hDPSCs中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β),白細胞介素6(IL-6)等炎癥因子的表達[8-10]。因此,本實驗采用不同濃度LPS刺激hDPSCs,研究其對hDPSCs增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料:本實驗選取的牙髓組織取自于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院頜面外科就診的18～30歲患者因正畸減數(shù)而新鮮拔除的健康完整的第三磨牙。所有標(biāo)本均提前經(jīng)過患者及家屬同意并簽署知情同意書。要求恒牙拔除后牙體完整,無齲病、牙髓病、根尖周病及牙周病,牙髓活力測試正常,X線片顯示根尖區(qū)發(fā)育已完成且未見明顯異常。

1.2 主要儀器和試劑:無菌超凈工作臺(Airtech,美國);二氧化碳恒溫孵箱(Thermo scientific,美國);熒光顯微鏡(Olympus,日本);4 ℃冰箱(美菱生物醫(yī)療,中國);-80 ℃深低溫冰箱(Thermo,美國);恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司,中國);電子分析天平(MettlerToledo,美國);酶標(biāo)儀(PerkinEimer,美國);高速離心機(Gene,德國);流式細胞儀(BD FacsCelesta,美國);移液器(Eppendorf,德國);α-MEM培養(yǎng)基(BI,以色列);PBS(VivaCell,中國);0.25%EDTA胰酶(Solarbio,中國);FBS(Gibco,美國);雙抗(BI,以色列);CCK-8試劑(APE×BIO,美國);LPS(Sigma,美國);CD29,CD34,CD45,CD90抗體(Biolegend,美國)

1.3 hDPSCs的體外培養(yǎng):臨床收集新鮮拔除的健康完整恒牙,去除離體牙上附著軟組織后用牙科高速手機牙頸部沿釉牙骨質(zhì)界磨出一條約1～2 mm深的溝槽,注意切勿露髓。用含2%雙抗的PBS浸洗3次;無菌條件下取出牙髓,含2%雙抗的PBS浸洗3次,用無菌眼科剪將牙髓剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊并移入無菌Eppendorf管內(nèi),以1 000 r/min離心5 min,棄上清液;加入4 mg/L Ⅰ型膠原酶37 ℃消化,每5 min震蕩1次,30 min后加入含血清培養(yǎng)液終止消化,以1 000 r/min離心5 min后用含200 mg/L牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)液重懸組織,均勻平鋪在60 mm的培養(yǎng)皿中,加入適量含200 mg/L胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)液,置于37 ℃,50 mL/L CO2的孵箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液1次,顯微鏡下觀察組織貼壁情況及細胞爬出與生長情況,待細胞生長匯合至80%時以2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代,取第3～5代hDPSCs用于實驗。

1.4 流式細胞儀測定hDPSCs表面標(biāo)記:采取流式細胞技術(shù)鑒定hDPSCs表面標(biāo)志。第3代的hDPSCs常規(guī)消化后,以1 000 r/min離心5 min,棄上清液。PBS重懸后再次離心,重復(fù)3次。將細胞沉淀加入含3%FBS的PBS中,將細胞懸液密度調(diào)整為1 106個/mL,將細胞以200 μL體積分裝,每管分別加入5 μL PE、APC、PerCP、FITC標(biāo)記的CD29、CD34、CD45、CD90及PBS。4 ℃避光孵育10 min,離心,棄上清液。PBS漂洗后,以1 500 r/min離心3 min,棄上清液,重復(fù)3次。加入300 μL PBS重懸,上機檢測表面標(biāo)記物表達。

1.5 CCK-8法檢測不同濃度LPS對hDPSCs增殖的影響:選取第3代hDPSCs,棄去原有培養(yǎng)基后使用PBS輕柔漂洗3次,常規(guī)消化并制成細胞懸液后,以2 104個/孔的密度接種于96孔板內(nèi),設(shè)置5個復(fù)孔及調(diào)零孔,每孔加入100 μL含有不同濃度LPS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基[11](0、20、40、80 μg/mL LPS),置于37 ℃,50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中,每2～3 d換液1次。在第1～7 d的同一時間段內(nèi)吸去原有培養(yǎng)基,更換為90 μL含有不同濃度LPS的培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑液的混合液。避光孵育1 h后在450 nm的波長下檢測OD值,并繪制在不同濃度LPS刺激下的細胞生長曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 hDPSCs原代培養(yǎng)結(jié)果:牙髓組織塊約在6～12 h后貼壁,3～4 d 后鏡下可觀察到組織塊周圍有細胞爬出,細胞為梭形,核圓居中,形態(tài)似成纖維細胞,見圖1(封三)。培養(yǎng)5～7 d 后見大量細胞貼壁生長,細胞簇密集,并以組織塊為中心呈渦旋狀分布于皿底,不同組織塊周圍細胞可見相互融合,見圖2(封三)。鏡下觀察原代細胞生長面積達皿底80%左右時,可按照1∶2比例進行傳代。24 h后可見絕大部分細胞貼壁完全,細胞均勻分布于皿底,細胞形態(tài)為長梭形,可見突起。傳代后細胞生長速度加快,3 d左右即可布滿皿底,見圖3(封三)。

2.2 hDPSCs鑒定:流式技術(shù)鑒定的結(jié)果表明,細胞表面標(biāo)記物CD29和CD90陽性率分別為99.9%和99.5%,并且CD34與CD45在本實驗中表達均為陰性,證實本實驗提取培養(yǎng)的hDPSCs屬于間充質(zhì)干細胞。

2.3 hDPSCs在不同濃度LPS刺激下的體外增殖結(jié)果:體外培養(yǎng)的第3代hDPSCs細胞貼壁牢固、狀態(tài)良好、生長速度增加,增殖實驗結(jié)果顯示細胞在第3 d進入快速增殖期,數(shù)量大幅增加,此后生長曲線較為平緩。不同濃度LPS作用hDPSCs第1、第2、第3 d,均可檢測到不同程度的細胞增殖,鏡下觀察到細胞貼壁生長狀態(tài)穩(wěn)定,未見明顯細胞凋亡。但后期增殖速率出現(xiàn)差別,并隨時間推移變化逐漸明顯。數(shù)據(jù)顯示不同濃度LPS組相較對照組細胞增殖能力均出現(xiàn)不同程度的抑制,以80 μg/mL抑制程度最為顯著。檢測第7 d細胞增殖OD值,見表1,不同濃度LPS組與對照組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=33.16,P<0.05),見圖4(封三)。

表1 各實驗組第7 d OD值

3 討論

牙齒容易受到損傷,最常見的是齲齒,口腔中的微生物會降解牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的礦化組織,并侵入核心的軟結(jié)締組織,即牙髓。牙髓中的成牙本質(zhì)細胞、成纖維細胞、干細胞和免疫細胞,以及血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),都參與了各種不同的防御機制,炎癥反應(yīng)機制對組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[12]。齲病和外傷常導(dǎo)致牙髓組織不同程度炎癥反應(yīng),輕度和緩慢的炎癥刺激有利于牙髓的修復(fù)與再生,而高強度的炎癥刺激可直接破壞牙髓的修復(fù)及再生潛能,如果沒有治療干預(yù),最終導(dǎo)致不可逆的牙髓壞死[13]。之前的研究[11,14]大部分皆采用較低濃度的LPS刺激牙髓干細胞來探究LPS對牙髓干細胞增殖活性及成骨分化等的作用,對于較高濃度LPS的刺激作用尚無進一步探究,因此本實驗采用較高濃度(20、40、80 μg/mL)LPS來模擬不同程度炎癥刺激對hDPSCs活力的影響,同時為以后體外塑造炎性牙髓干細胞模型確定合適LPS培養(yǎng)濃度。本實驗采用CCK-8法測定細胞增殖能力,結(jié)果說明使用20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL LPS刺激hDPSCs在較短時間內(nèi)均產(chǎn)生小范圍促進增殖的作用,但長時間刺激會引起細胞增殖能力下降。并且隨著時間的推移,LPS濃度越高,增殖速率越慢,與對照組差異越顯著,甚至最后出現(xiàn)抑制作用,嚴(yán)重損傷了hDPSCs活性。這與之前的研究結(jié)果,高強度的炎癥刺激將嚴(yán)重破壞牙髓的再生能力一致。但對于不同濃度LPS干預(yù)后,導(dǎo)致牙髓干細胞增殖出現(xiàn)差異的具體機制還未深入探討。正常情況下,中性粒細胞是牙髓內(nèi)免疫細胞的主要細胞群,發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用[15]。當(dāng)牙髓遭受刺激并觸發(fā)免疫反應(yīng)后,其內(nèi)部引發(fā)血管改變,免疫細胞聚集,最終可引發(fā)牙髓炎癥,導(dǎo)致牙髓損傷[16-18]。造成牙髓炎癥最主要的原因是細菌感染,這一結(jié)論也已被大眾接受。早在20世紀(jì)90年代,就已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌是導(dǎo)致牙髓感染的主要細菌,如牙髓卟啉單胞菌、乳桿菌、放線菌等[19],這些細菌通過牙本質(zhì)小管、深牙周袋甚至血液循環(huán)等途徑侵入并釋放脂多糖、酶及多種代謝產(chǎn)物長期刺激牙髓從而引發(fā)一系列免疫效應(yīng)[20]。研究證實,在宏觀及微觀兩方面均可觀察到炎癥刺激下的牙髓與正常狀態(tài)相比存在明顯差異。從宏觀角度出發(fā),炎癥牙髓表現(xiàn)出牙髓充血、血管擴張、血管通透性增加等現(xiàn)象;于微觀表達而言,LPS刺激牙髓組織后,被模式識別受體(PRRs)識別,釋放促炎因子、趨化因子等炎性介質(zhì),如TNF-α、IL-1β、VEGF等,炎性介質(zhì)還可激活NF-κB等因子,誘導(dǎo)促炎因子、黏附分子及趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄,進一步加強炎癥反應(yīng),并且隨著時間延長和損傷程度增加,炎癥浸潤范圍逐步擴張,直至侵及整個牙髓[21]。此外,血管通透性增加導(dǎo)致免疫細胞浸潤,并增加炎癥部位細胞因子和趨化因子等免疫介質(zhì)的濃度。與此同時,牙髓干細胞對炎癥又有著復(fù)雜的免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)作用,對某些炎癥性疾病也有潛在的療效[22]。若對炎性牙髓干細胞也能加以利用,曾經(jīng)因炎癥而摘除的牙髓組織也能得以保留,甚至發(fā)揮更大的作用。因此,本課題將繼續(xù)探討體外不同程度炎癥環(huán)境刺激下,牙髓干細胞炎癥因子表達情況及減輕炎癥損傷的有效藥物,為以后牙髓炎的治療提供更多優(yōu)選方案,實現(xiàn)保存“活牙”的目標(biāo),充分發(fā)掘炎性牙髓干細胞的干細胞特性及治療價值。