詹福壽,魏 波,宋旭梅,馬一婧,芮淑賢,賈 偉

羊水細胞染色體核型分析目前仍是診斷胎兒染色體病的金標準,可檢出低比例嵌合體、非整倍體、片段較大(常大于5 Mb)的染色體缺失、重復、倒位及易位等,而對于小于5 Mb的染色體微缺失、微重復片段則無法檢出,并不能準確判斷額外小標記染色體的來源[1-2]。單核苷酸多態(tài)性芯片技術(SNP-array)實驗程序煩瑣、成本較高、通量較低,這些限制了該技術在產前遺傳學診斷中的大規(guī)模應用。拷貝數(shù)變異測序(CNV-seq)是一種低深度全基因組測序技術,可檢出基因組內大于100 kb的基因拷貝數(shù)變異(CNVs),具備操作簡便、檢測范圍廣、報告周期短、費用較低、所需樣本DNA量少(10 ng～50 ng DNA)、分辨率高、通量高等技術優(yōu)勢[3]。2019年專家共識提到可以考慮將CNV-seq檢測作為一線的產前診斷技術應用于臨床[4]。本研究主要探討CNV-seq技術聯(lián)合染色體G顯帶核型分析在胎兒染色體病產前診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2020年10月至2022年6月在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院產前中心就診936例患者,平均年齡(32.56±5.18)歲,其中,年齡高風險(預產年齡≥35歲)157例(16.77%),年齡<35歲者779例(83.23%)。產前診斷時的孕周為16+2～32+6周,平均孕周(18.95±3.47)周。孕婦簽署產前診斷知情同意書后穿刺,抽取羊水行CNV-seq技術和染色體G顯帶核型分析聯(lián)合檢測。

1.2 產前診斷指征:①年齡高風險(預產年齡≥35歲者)157例;②產前篩查高風險孕婦128例,包括早、中孕期血清學篩查(MSS)高風險和無創(chuàng)產前篩查(NIPT)高風險;③產前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常365例,其中超聲異常包括頸項透明層(NT)增厚、頸項軟組織(NF)增厚、羊水過多或過少、結構異常及多個超聲軟指標異常等;④胎兒宮內發(fā)育遲緩62例;⑤既往有不明原因的不良孕產史85例;⑥夫婦一方染色體異常者46例,包括染色體平衡易位攜帶者或非平衡染色體結構異常;⑦其他93例,包括夫婦一方有致畸因素接觸史、孕期服藥史、不良生活史、近親婚配等。本研究通過寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院科研倫理委員會批準(第2020—689號),所有孕婦均簽署產前診斷知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 超聲引導下羊水標本采集:完善相關檢驗、檢查,簽署介入性產前診斷知情同意書,孕婦仰臥位,超聲引導下采用21 G穿刺針行羊膜腔穿刺術,為避免母體細胞污染,穿刺成功后先抽取羊水1～2 mL丟棄,更換注射器后繼續(xù)抽取羊水3管,每管約8～10 mL,其中2管用于細胞培養(yǎng)制備染色體,剩余1管提取DNA用于CNV-seq技術檢測。

1.3.2 羊水細胞染色體G顯帶核型分析:2管羊水分2線獨立操作,1線采用和能生物羊水細胞培養(yǎng)基(廣州和能生物科技有限公司),另1線采用BI羊水細胞培養(yǎng)基(上海碧艾生物科技有限公司),分別置于兩臺含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱獨立培養(yǎng)。8～10 d后視細胞生長情況加入秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)3～5 h,使用胰蛋白酶消化法收獲細胞,滴片并于75 ℃烤片3 h 后G顯帶。制備好的玻片置于MetaSystems染色體全自動掃描分析系統(tǒng)(Ziess公司,德國)掃片分析,每線培養(yǎng)物計數(shù)不少于10個細胞,挑選不少于5個分散適中、帶紋清晰、至少達到400條帶水平的完整細胞進行核型分析。如疑為嵌合體或異常核型,則加大計數(shù),一般不少于50個細胞。染色體的核型描述依據人類染色體國際命名體制(ISCN)ISCN 2016進行。

1.3.3 CNV-seq技術檢測:常規(guī)抽提羊水基因組DNA,使用染色體CNV檢測試劑盒(北京貝瑞和康生物技術有限公司生產)和Illumina測序平臺NextSeq CN500對DNA文庫進行測序,檢測染色體非整倍體及全基因CNV,嚴格按照試劑說明書及實驗室檢驗標準操作規(guī)程(SOP)進行操作。測序結果通過ChAS 2.0軟件(Chromosome analysis Suite)進行數(shù)據分析,選取長度≥100 kb的片段進行分析。按照《美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)序列變異分類標準與指南2015》進行CNV致病性分析。主要參考人群多態(tài)性數(shù)據庫DGV(the Database of Genomic Variant)、人類孟德爾遺傳在線數(shù)據庫OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、患者表型相關的基因組結構變異數(shù)據庫DECIPHER(the Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensemble Resources)、基因劑量效應數(shù)據庫ClinGen(Clinical Genome Resource)、基因變異數(shù)據庫ClinVar及PubMed等數(shù)據庫及文獻進行CNV結果的判讀。根據CNV的性質不同分為致病性CNVs(pathogenic variants,P)、可能致病CNVs(likely pathogenic variants,LP)、臨床意義不明確CNVs(variants of unknown significance,VOUS)、良性CNVs(benign variants,B)及可能良性CNVs(likely benign variants,LB)5類[4]。為了臨床遺傳咨詢的需要,本研究只對前3類CNVs進行分析[5]。對檢測到VOUS的病例,建議進行胎兒父母CNV-seq檢測驗證。

1.4 統(tǒng)計學方法:采用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料采用例數(shù)或率(%)表示,采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檢測成功率:936例具備產前診斷指征并行羊膜腔穿刺的孕婦羊水標本,有1例血性羊水細胞培養(yǎng)至14 d,未見貼壁細胞生長,培養(yǎng)失敗,其余均培養(yǎng)成功,檢測成功率為99.89%(935/936)。CNV-seq技術檢測成功率為100%(936/936)。

2.2 胎兒羊水染色體G顯帶核型分析結果:胎兒羊水染色體G顯帶核型分析檢出異常74例,陽性檢出率為7.91%(74/936)。染色體數(shù)目異常47例,陽性檢出率為5.02%(47/936),其中21-三體27例,18-三體 3例,13-三體1例,Turner綜合征7例,Klinefelter綜合征3例,47,XXX綜合征2例,47,XYY綜合征1例,其他染色體數(shù)目異常3例。染色體結構異常26例,陽性檢出率為2.78%(26/936),其中平衡易位14例,倒位6例,其他染色體結構異常6例。染色體數(shù)目異常合并結構異常1例,陽性檢出率為0.11%(1/936)。染色體G顯帶異常核型分布情況及陽性率,見表1。

表1 胎兒羊水染色體G顯帶異常核型分布情況及陽性率

2.3 胎兒CNV-seq檢測結果:CNV-seq檢出染色體異常98例,陽性檢出率為10.47%(98/936)。檢出染色體數(shù)目異常46例,其中1例胎兒羊水染色體G顯帶核型為47,XN,+3[5]/46,XN[95],CNV-seq檢測結果提示未見異常。另外,14例胎兒染色體平衡易位攜帶者(包括5例羅伯遜易位)和6例胎兒染色體倒位攜帶者,CNV-seq檢測結果也提示未見異常。CNV-seq技術檢出致病性CNVs 64例(其中21-三體27例,18-三體 3例,13-三體1例,9號染色體三體嵌合體1例,Turner綜合征7例,Klinefelter綜合征3例,47,XXX綜合征2例,47,XYY綜合征1例),可能致病CNVs 12例,臨床意義不明確CNVs 22例。與傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析技術(7.91%)相比,陽性檢出率提高了2.56個百分點。

2.4 胎兒羊水染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq檢測結果:胎兒羊水染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq檢出染色體異常118例,陽性檢出率為12.61%(118/936)。胎兒羊水染色體G顯帶核型分析與CNV-seq檢測技術對于染色體非整倍體的異常檢出率一致。1例胎兒羊水染色體G顯帶核型為47,XN,+3[5]/46,XN[95],1例46,XN,add(11)(q25)[4]/46,XX[71]的低比例嵌合體,CNV-seq檢測結果均提示未見異常。1例47,XN,+9[11]/46,XN[39],CNV-seq結果提示9號染色體三體15%嵌合。對于羊水染色體G顯帶核型分析檢出的7例不平衡性改變,CNV-seq檢測結果提示異常并能準確地檢出染色體異常的位置及片段大小。羊水染色體G顯帶核型分析結果正常,CNV-seq檢測結果提示異常45例。羊水染色體G顯帶核型分析提示異常,CNV-seq檢測結果提示未見異常21例。兩種方法均檢測到異常的53例。CNV-seq部分致病性CNVs檢出信息表,見表2。

表2 CNV-seq部分致病性CNVs檢出信息表

2.5 胎兒羊水染色體G顯帶核型分析、CNV-seq兩者單獨檢測與其聯(lián)合檢測染色體異常檢出率比較:胎兒羊水染色體G顯帶核型分析、CNV-seq二者單獨檢測對染色體異常檢出率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CNV-seq單獨檢測與其聯(lián)合染色體核型分析檢測對染色體異常檢出率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。羊水染色體G顯帶核型分析單獨檢測與其聯(lián)合CNV-seq檢測對染色體異常檢出率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。羊水染色體G顯帶核型分析、CNV-seq二者單獨檢測與其聯(lián)合檢測對染色體異常檢出率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 染色體G顯帶核型分析、CNV-seq兩者單獨檢測與其聯(lián)合檢測染色體異常檢出率比較

3 討論

染色體異常包括染色體數(shù)目異常和結構異常,是導致胚胎停育、復發(fā)性流產及新生兒圍產期死亡的主要原因。產前診斷是減少遺傳病患兒出生的有效手段之一,是遺傳病預防的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的細胞遺傳染色體G顯帶核型分析仍是產前診斷染色體異常的金標準,但其無法檢測出染色體亞顯微結構改變,即染色體的微缺失和微重復綜合征(MMS)。到目前為止,已明確由拷貝數(shù)變異導致的MMS已達三百余種,其發(fā)病率約為1/600[6-7],占染色體異常所致出生缺陷的50%[8]。相關研究表明,染色體G顯帶核型分析未見異常但產前超聲提示結構異常的胎兒中,有6%～7%存在致病性或可能致病性的CNVs[9-11]。

張素華等[12]對316例孕婦羊水樣本進行染色體G顯帶核型分析和CNV-seq檢測,染色體G顯帶核型分析陽性檢出率為7.59%(24/316),CNV-seq技術對致病或可能致病性染色體異常的檢出率為9.49%(30/316),與傳統(tǒng)細胞遺傳學技術相比,染色體異常檢出率提高了1.90個百分點。本研究對具備產前診斷指征且無羊膜腔穿刺手術禁忌證的936例孕婦胎兒羊水標本行CNV-seq技術和染色體G顯帶核型分析聯(lián)合檢測,除1例血性羊水培養(yǎng)失敗外,其余均檢測成功。染色體G顯帶核型分析檢出異常74例,陽性檢出率為7.91%(74/936)。CNV-seq技術檢出染色體異常98例,陽性檢出率為10.47%(98/936)。與傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析技術(7.91%)相比,陽性檢出率提高了2.56個百分點。胎兒羊水染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq檢出染色體異常118例,陽性檢出率為12.61%(118/936)。與僅CNV-seq技術(10.47%)相比,陽性檢出率提高了2.14個百分點,與其他研究報道結果相似[5]。對于羊水染色體G顯帶核型分析檢出的7例不平衡性改變,CNV-seq檢測結果提示異常并能準確地檢出染色體異常的位置及片段大小。羊水染色體G顯帶核型分析結果正常,CNV-seq檢測結果提示異常45例。羊水染色體G顯帶核型分析提示異常,CNV-seq檢測結果提示未見異常21例。本研究表明,對于胎兒非整倍體染色體異常,上述兩種檢測方法均能準確診斷,并且對于染色體核型分析無法判斷染色體來源的異常片段,CNV-seq技術能夠精確地進行定位。CNV-seq技術不能檢出染色體的平衡易位、插入及倒位等[13],也不能檢出低比例的嵌合體,但是這些在表型異常的人群中是相對罕見的(占比<1%)[14]。如本研究中的1號孕婦胎兒染色體核型為47,XN,+mar,但染色體核型分析不能準確辨認其來源,CNV-seq檢測提示為13號染色體q11q12.12存在5.18 Mb的重復,致病性CNVs,為產前遺傳咨詢及胎兒的去留提供有力的科學依據。

嵌合體是指由來自不同基因型的合子演變而來的兩個或多個不同的細胞系混合構成的個體。嵌合體的形成機制較為復雜,存在真性和假性嵌合體兩種,因產前獲取的胎兒相關表型有限,所以給產前遺傳咨詢帶來了較大的挑戰(zhàn)和難度。染色體G顯帶核型分析不能區(qū)分真性和假性嵌合體,因此有研究認為,核型分析提示嵌合體的個體應使用其他檢測技術進一步印證[15]。在本研究中,1例胎兒羊水染色體G顯帶核型為47,XN,+3[5]/46,XN[95],1例46,XN,add(11)(q25)[4]/46,XX[71]的低比例嵌合體,CNV-seq檢測結果均提示未見異常。有研究報道1例染色體G顯帶核型分析結果為2號染色體三體嵌合體,嵌合比例為9%,而CNV-seq技術檢測嵌合比例高達33%,因超聲隨訪發(fā)現(xiàn)胎兒多發(fā)畸形而引產[16]。近年來,隨著分子生物學技術的快速發(fā)展,越來越多的臨床醫(yī)師把染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq技術作為產前診斷的有效策略,CNV-seq技術可對未培養(yǎng)的原始細胞進行檢測,且檢測范圍廣,報告周期短,分辨率高,通量高,有效彌補了細胞遺傳檢測技術的不足,兩種方法聯(lián)合檢測,可明顯提高染色體嵌合體檢測的靈敏度和準確度[17]。

綜上所述,染色體G顯帶核型分析和CNV-seq技術各具優(yōu)勢,檢測結果之間相互印證。染色體G顯帶核型分析在低比例嵌合體、平衡易位及倒位攜帶者檢測方面更具優(yōu)勢,而CNV-seq技術可檢出染色體的微缺失、微重復綜合征,可彌補染色體G顯帶核型分析分辨率的不足。CNV-seq技術和染色體G顯帶核型分析技術聯(lián)合應用,可提高染色體異常的檢出率,降低漏診率,有效提高產前診斷的質量,進一步降低人口出生缺陷的發(fā)生率。