戴全武，劉 毅，曾格格，田 宇，黃振陽(yáng)

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

中藥桂枝為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥嫩枝，味辛、甘，性溫，有發(fā)汗解肌、溫經(jīng)筋脈、助陽(yáng)化氣的功效，本品以生用為主，生品桂枝辛散溫通作用較強(qiáng)［1，2］。中藥白芍來源于毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora）的干燥根，味苦、酸，微寒，有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂汗止陰、平肝止疼的功效［3］。桂枝-白芍藥對(duì)最早出現(xiàn)在《傷寒論》的桂枝湯中，是典型的相制藥對(duì)，二藥相合，一收一散，相互制約，為臨床常用的調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、溫通止痛藥對(duì)［4］。桂枝-白芍藥對(duì)是桂枝湯及其類方的功效基礎(chǔ)，常用于營(yíng)衛(wèi)不和、外感風(fēng)寒等癥，在臨床治療中應(yīng)用廣泛，療效顯著［5］。桂枝和白芍均含有大量的揮發(fā)性成分，在臨床上有重要的應(yīng)用價(jià)值［6，7］，使用頂空固相微萃?。℉S-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法（HS-SPME-GC-MS）分析桂枝、白芍配伍前后揮發(fā)性成分的報(bào)道較少。HS-SPME 技術(shù)是集樣品的萃取、濃縮、進(jìn)樣功能于一體的高效前處理方法［8］。因此本研究采用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法對(duì)比分析桂枝、白芍配伍前后的揮發(fā)性成分變化，以期為桂枝-白芍藥對(duì)的配伍規(guī)律及其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桂枝（批號(hào)210701）和白芍（批號(hào)210901）購(gòu)于湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室楊紅兵教授鑒定為樟科植物肉桂的干燥嫩枝和毛茛科植物芍藥的干燥根。將桂枝和白芍藥材分別打粉，過四號(hào)篩備用。

1.2 儀器

手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣裝置（德國(guó)IKA 公司）；ThermoFisher Trace 1310 型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)ThermoFisher 公司）；頂空瓶（15 mL）；65 μm 聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纖維頭（美國(guó)Supelco 公司）；ALC-210.2 型百分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）條件

1）GC 條件。色譜柱：TG-1701MS 毛細(xì)管柱；升溫程序：從50 ℃開始，保持2.5 min，以10 ℃/min 升溫至250 ℃；載氣：高純度He（99.999 %）；柱流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

2）MS 條件。EI 源；電子能量：70 eV，溫度：250 ℃，采用全掃描模式采集數(shù)據(jù)，掃描質(zhì)量范圍：40～600 amu。

1.4 頂空固相微萃取條件

1.4.1 取樣量 分別精密稱取桂枝-白芍藥對(duì)混合粉（質(zhì)量比為1∶1）0.40、0.60、0.80、1.00 g，在60 ℃下平衡10 min，選用65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭萃取15 min，進(jìn)針后解析3 min，按GC-MS 的條件進(jìn)樣測(cè)定，以色譜出峰總面積為主要指標(biāo)，以質(zhì)譜鑒定出的化合物種類數(shù)為輔助指標(biāo)，對(duì)樣品取樣量進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳取樣量為0.60 g。

1.4.2 萃取溫度 精密稱取桂枝-白芍藥對(duì)混合粉0.60 g，其他條件不變，分別在40、60、80、100、120 ℃條件下對(duì)混合樣品進(jìn)行萃取，按GC-MS 的條件進(jìn)樣測(cè)定和分析，確定最佳萃取溫度為60 ℃。

1.4.3 萃取時(shí)間 精密稱取桂枝-白芍藥對(duì)混合粉0.60 g，在60 ℃下加熱平衡10 min，其他條件不變，選用65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭分別萃取10、15、20、25、30 min，按GC-MS 的條件進(jìn)樣測(cè)定和分析，確定最佳萃取時(shí)間為15 min。

1.4.4 解析時(shí)間 精密稱取桂枝-白芍藥對(duì)混合粉0.60 g，在60 ℃下加熱平衡10 min，選用65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭萃取25 min，取出，立即插入色譜儀進(jìn)樣口，分別解析1、2、3、4、5 min，按GC-MS 的條件進(jìn)樣測(cè)定和分析，確定最佳解析時(shí)間為3 min。

綜合單因素考察［9］結(jié)果，確定最佳的萃取條件：取樣量0.60 g，萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間15 min，解析時(shí)間3 min。單味藥與桂枝-白芍藥對(duì)的試驗(yàn)條件一致。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，并運(yùn)用Mainlib 譜庫(kù)對(duì)所出峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索，以鑒定各組分。使用SPSS 26.0 軟件對(duì)桂枝、白芍及其藥對(duì)的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

依照上述條件通過HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法分析桂枝、白芍及其藥對(duì)的揮發(fā)性成分，通過氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀得到總離子流圖（圖1、圖2、圖3）。用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，并運(yùn)用Mainlib譜庫(kù)對(duì)所出峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索，初步鑒別出87 個(gè)成分，具體信息見表1。

表1 桂枝、白芍及其藥對(duì)的揮發(fā)性成分

圖1 桂枝的總離子流

圖2 白芍的總離子流

圖3 桂枝-白芍藥對(duì)的總離子流

2.1 桂枝、白芍及其藥對(duì)的定量分析

由圖1、圖2、圖3、表1 可知，桂枝出峰83 個(gè)，鑒定出47 個(gè)成分，相對(duì)含量為96.91%；白芍出峰86個(gè)，鑒定出49 個(gè)成分，相對(duì)含量為90.58%；桂枝-白芍藥對(duì)出峰81 個(gè)，鑒定出54 個(gè)成分，相對(duì)含量為94.57%。

桂枝的總揮發(fā)性成分中相對(duì)含量最高的是反式-肉桂醛（37.23%），其次是α-依蘭油烯（7.43%）、鄰甲氧基肉桂醛（7.14%）、α-蒎烯（7.00%）等。白芍總揮發(fā)性成分中相對(duì)含量最高的是γ-馬欖烯（17.23%），其次是α-姜黃烯（10.76%）、β-石竹烯（9.05%）、丹皮酚（7.82%）等。桂枝-白芍藥對(duì)總揮發(fā)性成分中相對(duì)含量最高的是反式-肉桂醛（21.33%），其次是鄰甲氧基肉桂醛（6.92%）、α-雪松烯（6.79%）、肉桂醛（5.35%）等。

2.2 桂枝、白芍及其藥對(duì)的揮發(fā)性成分種類和相對(duì)含量分析

從桂枝、白芍及其藥對(duì)中鑒別出的化學(xué)成分可以分為醛類、酯類、烯類、酮類、醚類、酚類、醇類、酸類，具體信息見表2。桂枝、白芍及其藥對(duì)中均是烯類成分最多。桂枝中醛類、烯類的相對(duì)含量較高，分別為48.52%、44.62%；白芍中烯類的相對(duì)含量最高，分別為71.72%；桂枝-白芍藥對(duì)中醛類、烯類的相對(duì)含量較高，分別為41.10%、44.22%。

表2 桂枝、白芍及其藥對(duì)揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和相對(duì)含量

2.3 桂枝、白芍及其藥對(duì)共有成分和特有成分分析

桂枝、白芍及其藥對(duì)有13 個(gè)共有成分，包括δ-欖香烯、β-石竹烯、γ-依蘭油烯、α-姜黃烯等，且相對(duì)含量有所差異。桂枝-白芍藥對(duì)和桂枝有38 個(gè)共有成分，包括反式-肉桂醛、肉桂醛、α-蒎烯等。桂枝-白芍藥對(duì)和白芍有23 個(gè)共有成分，包括γ-馬欖烯、伯克希哈拉德烯、α-律草烯等。桂枝-白芍藥對(duì)有6 個(gè)特有成分（2.49%），包括長(zhǎng)葉松烯（0.61%）、反式-β-金合歡烯（0.98%）、反式乙酸戊烯酯（0.28%）等。桂枝有7 個(gè)特有成分（10.32%），包括α-依蘭油烯（7.43%）、去氫白菖烯（2.16%）、（+）-苜蓿烯（0.25%）等。白芍有24 個(gè)特有成分（24.33%），包括（+）-β-芹子烯（6.01%）、大根香葉烯B（2.53%）、β-倍半水芹烯（2.17%）等。

2.4 桂枝、白芍及其藥對(duì)的揮發(fā)性成分PCA

由表1 可知，桂枝、白芍及其藥對(duì)的揮發(fā)性成分相對(duì)含量數(shù)據(jù)離散，因此采用主成分分析把離散的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)桂枝、白芍及其藥對(duì)揮發(fā)性成分的相似性和差異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用SPSS 26.0 軟件對(duì)3 組樣品的87 種揮發(fā)性成分相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析（PCA）［9］。由表3 可知，前2 個(gè)主成分的初始特征值均大于1.000，前2 個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)97.026%，可以反映樣品揮發(fā)性成分相對(duì)含量的整體信息，因此選取前2 個(gè)主成分進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果見表4。綜合得分越高，主成分占該組總揮發(fā)性成分相對(duì)含量的比例越高。單味藥與桂枝-白芍藥對(duì)的綜合得分有所差異，其中桂枝-白芍藥對(duì)的綜合得分最高，表明桂枝-白芍藥對(duì)配伍后主成分相對(duì)含量更高，治療作用更強(qiáng)。

表3 主成分的初始特征值、方差及累積貢獻(xiàn)率

表4 桂枝、白芍及其藥對(duì)揮發(fā)性成分主成分得分和綜合得分

3 小結(jié)與討論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法對(duì)桂枝、白芍及其藥對(duì)配伍前后的揮發(fā)性成分進(jìn)行對(duì)比分析，分別鑒定出47、49、54 個(gè)揮發(fā)性成分，相對(duì)含量分別為96.91%、90.58%、94.57%。桂枝-白芍藥對(duì)和桂枝有38 個(gè)共有成分，桂枝-白芍藥對(duì)和白芍有23個(gè)共有成分，桂枝-白芍藥對(duì)有6 個(gè)特有成分，桂枝-白芍藥對(duì)的大部揮發(fā)性成分來源于桂枝。

桂枝-白芍藥對(duì)中有6 個(gè)新增的揮發(fā)性成分，分別是反式乙酸戊烯酯、反式-β-金合歡烯、長(zhǎng)葉松烯、3-異丙基-4a，5-二甲基-1，2，3，4，4a，5，6，7-八氫萘-1-醇、4（15），5，10（14）-大根香葉三烯-1-醇、石竹-4（12），8（13）-二烯-5β-醇；單味藥有33 個(gè)成分未在桂枝-白芍藥對(duì)中檢出，包括α-依蘭油烯、（+）-苜蓿烯、β-倍半水芹烯等。桂枝-白芍藥對(duì)中有16 種來源于單味藥，其揮發(fā)性成分的相對(duì)含量有一定上升，如反式-α-沒藥烯、桉油烯醇、愈創(chuàng)蘭油烴、（4E）-1-甲基-4-（6-甲基庚-5-烯-2-亞基）環(huán)己烯等，桂枝揮發(fā)性成分中相對(duì)含量較高的反式-肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、α-蒎烯等在桂枝-白芍藥對(duì)中相對(duì)含量均有明顯下降，白芍揮發(fā)性成分中相對(duì)含量較高的γ-馬欖烯、α-姜黃烯、β-石竹烯等在桂枝-白芍藥對(duì)中相對(duì)含量也有所下降。桂枝-白芍藥對(duì)中相對(duì)含量增加的桉油烯醇具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用［10］，愈創(chuàng)蘭油烴有抗菌、消腫、鎮(zhèn)痛作用［11］，桂枝-白芍藥對(duì)中新增加的成分藥理作用研究較少。反式-肉桂醛是桂枝鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、通血脈作用的主要成分之一，桂枝生品辛散能力強(qiáng)［12-14］，配伍后，反式-肉桂醛等主要揮發(fā)性成分相對(duì)含量的降低能夠抑制桂枝過強(qiáng)的辛散能力。桂枝、白芍配伍前后的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和相對(duì)含量都發(fā)生了較大變化，表明桂枝、白芍配伍后桂枝-白芍藥對(duì)中的揮發(fā)性成分不只是單味藥成分的簡(jiǎn)單相加，可能是中藥的揮發(fā)性成分在高溫萃取過程中發(fā)生了水解、氧化、還原、脫羧、聚合等反應(yīng)，導(dǎo)致成分轉(zhuǎn)變［15］，具體原因有待進(jìn)一步探究。

頂空固相微萃取技術(shù)具有待測(cè)物質(zhì)用量少、無損傷等優(yōu)點(diǎn)，適用于分析低沸點(diǎn)的萜類、醛酮類和小極性的烴類化合物，常與GC-MS 聯(lián)用分析中藥材的揮發(fā)性成分［14，16］，與溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法相比具有操作簡(jiǎn)便、耗費(fèi)時(shí)間短、揮發(fā)性成分損失少、成本低等優(yōu)點(diǎn)［17-19］。本研究應(yīng)用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法對(duì)桂枝、白芍配伍前后的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)及鑒定，對(duì)配伍前后揮發(fā)性成分的變化進(jìn)行探究，為桂枝-白芍藥對(duì)的配伍規(guī)律及其應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。