李俊秀，廖夏云，b，趙立春，b，梁 潔，b

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，a.藥學(xué)院；b.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200）

青錢柳［Cyclocarya paliurus（Bata1.）Iljinskaja］系雙子葉植物綱胡桃科的青錢柳屬植物。其葉片中含有黃酮、多糖、三萜皂苷和有機(jī)酸等多種活性成分［1-3］；動物及臨床試驗(yàn)研究表明，青錢柳提取物具有降血糖［4］、降血壓［5，6］、降血脂［5］、增強(qiáng)細(xì)胞免疫［6］、抗氧化［5，7］、防衰老［8］、抗癌［9］等多種保健功能，以青錢柳葉片制成的“保健茶”成為中國首個被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證的抗高血糖植物茶［10］。青錢柳黃酮是青錢柳葉片中含量較豐富的一類化合物，與青錢柳葉片具有的保健功能和治療作用密切相關(guān)，因此黃酮類化合物的質(zhì)量研究有助于對青錢柳葉片藥材及其提取物進(jìn)行質(zhì)量控制。青錢柳黃酮多是槲皮素和山奈酚與糖形成的糖苷［11］。研究表明，大多數(shù)黃酮苷類化合物口服后，首先在消化道上皮細(xì)胞水解酶或腸道微生物作用下，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的黃酮苷元而被吸收，口服黃酮苷類化合物的效應(yīng)成分多為黃酮苷元［12］。對青錢柳葉片黃酮類成分含量測定的研究已有很多報道［13-17］，但對黃酮類成分水解后黃酮苷元含量測定及制備工藝的研究較少。因此，本研究建立酸水解提取青錢柳葉片中2 種黃酮苷元（槲皮素和山奈酚）及其含量的HPLC 測定方法，以期為青錢柳質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（包括四元泵、在線真空脫氣機(jī)G-7111A、標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器G-7129A、智能化柱溫箱G-7116A、VWD 紫外檢測器G-7114A、Agilent 1160 色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司）；Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；Direct-Q 超純水制備儀；循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）；數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；EA-240 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 試藥

青錢柳葉片藥材產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)百色市隆林縣，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園白隆華研究員鑒定為青錢柳的干燥葉片。槲皮素對照品（批號100081-201610）、山奈酚對照品（批號100861-201611）均購于中國食品藥品檢定研究院。提取用的甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、鹽酸（分析純）均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，液相用的甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購于美國Fisher scientific 公司，水為Direct-Q 制的去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比為35∶65）；檢測波長：370 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品0.010 2 g（99.1%）于25 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配成0.4043 3 mg/mL 的槲皮素對照品貯備液；精密稱取山奈酚對照品（95.5%）0.010 1 g于20 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配成0.482 3 mg/mL 的山奈酚對照品貯備液。再分別吸取槲皮素、山奈酚對照品貯備液1.00 mL，置于同一容量瓶（10 mL）中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到含有槲皮素（40.433 μg/mL）、山奈酚（48.228 μg/mL）的混合對照品溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備 精密稱取干燥青錢柳葉片粉末（100 目篩）0.5 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，加入溶劑（V乙醇∶V鹽酸=8∶1）10 mL，置于90 ℃恒溫水浴鍋中回流60 min，取出放冷至室溫，過濾，濾渣用乙醇洗滌，合并濾液，乙醇定容至25 mL，搖勻。過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別吸取混合對照品溶液、樣品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行HPLC 測定，記錄各色譜（圖1）。結(jié)果表明，混合對照品溶液圖譜中指標(biāo)成分峰的保留時間與青錢柳葉片水解樣品溶液中指標(biāo)成分的保留時間一致，槲皮素和山奈酚理論塔板數(shù)均大于6 000，分離度均大于1.5 且對稱因子良好，符合含量測定的要求。

圖1 混合對照品（a）和樣品溶液（b）的高效液相色譜

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取槲皮素、山奈酚的混合對照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，依次進(jìn)樣測定，以混合對照品溶液峰面積（y）為縱坐標(biāo)、混合對照品進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計算，線性關(guān)系考察結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。槲皮素回歸方程為y=4 770.6x+17.489，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7；山奈酚回歸方程為y=4 366.6x-13.913，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。結(jié)果表明，槲皮素的進(jìn)樣量在0.080 8～0.808 7 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；山奈酚的進(jìn)樣量在0.096 4～0.964 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 槲皮素（a）和山奈酚（b）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.6 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)自動進(jìn)樣6 次，記錄槲皮素和山奈酚的峰面積，并計算其平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表1 可知，槲皮素和山奈酚峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均為0.08%，表明儀器精密度良好，滿足測定含量的試驗(yàn)要求。

表1 精密度考察結(jié)果

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.3”項方法制備樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣測定，由表2 可知，槲皮素和山奈酚峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.45%、0.54%（RSD＜2.00%，n=7），表明所制備的樣品溶液在24 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取相同質(zhì)量（0.5 g）的青錢柳葉片粉末6 份，按“2.1.3”項方法制備樣品溶液，測定2 個成分的平均含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，槲皮素、山奈酚含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.96%、3.01%，表明本方法的重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取青錢柳葉片藥材粉末6 份（青錢柳葉片藥材粉末水解后槲皮素含量為1.658 mg/g、山奈酚含量為2.720 mg/g），每份0.25 g，分別精密加入一定量的槲皮素、山奈酚對照品貯備液，按“2.1.3”項方法制備樣品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表4。槲皮素、山奈酚的平均加樣回收率分別為100.97%、97.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.93%、3.29%，表明加樣回收率良好。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 黃酮苷元提取及酸解條件的研究

2.2.1 提取方式和溶劑的選擇 精密稱取青錢柳葉片粉末0.5 g，分別以甲醇-鹽酸（體積比為4∶1）、乙醇-鹽酸（體積比為4∶1）為提取及水解的溶劑，料液比為1∶15（m/V，g/mL），稱定重量后，分別采用超聲波輔助提取法（60 min）、恒溫水浴回流提取法（90 ℃，60 min）提取及水解，取出，放冷，補(bǔ)足減失的重量，過0.45 μm 微孔濾膜，續(xù)濾液按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行HPLC 測定，記錄2 種黃酮苷元（槲皮素、山奈酚）的峰面積并計算含量。比較2 種方法和2 種溶劑對2 種水解黃酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量的差異，結(jié)果如表5 所示，無論使用哪種溶劑，恒溫水浴回流提取的黃酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量均高于超聲波輔助提?。? 種提取方法中，采用乙醇-鹽酸為溶劑時得到的黃酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量較高。因此，提取方式選擇恒溫水浴回流提取法，溶劑選擇乙醇-鹽酸。

表5 提取方式和溶劑考察含量測定結(jié)果（單位：mg/g）

2.2.2 單因素優(yōu)化試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)考察恒溫水浴回流提取法中水解液的乙醇-鹽酸體積比、料液比、回流時間和水浴溫度4 個因素對2 種水解黃酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量的影響，以確定各因素的參數(shù)范圍，為優(yōu)化工藝參數(shù)提供依據(jù)。

1）乙醇-鹽酸體積比的考察。按“2.1.1”和“2.1.3”項下樣品溶液制備和測定的方法，固定料液比（1∶15）、水浴溫度（80 ℃）、回流時間（60 min），考察乙醇-鹽酸不同體積比（4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）為溶劑時對槲皮素、山奈酚含量的影響。由圖3 可知，乙醇-鹽酸不同體積比對槲皮素、山奈酚含量的影響效果基本一致，隨著乙醇比例的增大，槲皮素、山奈酚含量均增加，乙醇-鹽酸體積比為8∶1 時達(dá)最大值，因此優(yōu)化試驗(yàn)的乙醇-鹽酸體積比設(shè)置為8∶1 左右。

圖3 體積比對槲皮素、山奈酚含量的影響

2）料液比的考察。固定乙醇-鹽酸體積比（8∶1）、水浴溫度（80 ℃）、回流時間（60 min），考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）對槲皮素、山奈酚含量的影響。由如圖4 可知，不同料液比對槲皮素、山奈酚含量的影響效果基本一致，隨著提取液的量增加，槲皮素、山奈酚含量逐步增加，當(dāng)料液比達(dá)1∶25 時基本穩(wěn)定，因此優(yōu)化試驗(yàn)時料液比設(shè)置為1∶25 左右。

圖4 料液比對槲皮素、山奈酚含量的影響

3）回流時間的考察。固定乙醇-鹽酸體積比（8∶1）、料液比（1∶25）、水浴溫度（80 ℃），考察不同回流時間（30、60、90、120 min）對槲皮素、山奈酚含量的影響。由圖5 可知，不同回流時間對槲皮素、山奈酚含量的影響效果基本一致，槲皮素、山奈酚含量均在30～90 min 隨著回流時間的增加而增加，并在90 min達(dá)最大值，90 min 以上時含量降低，因此優(yōu)化試驗(yàn)中回流時間設(shè)置為90 min 左右。

圖5 回流時間對槲皮素、山奈酚含量的影響

4）回流溫度的考察。固定乙醇-鹽酸體積比（8∶1），料液比（1∶25），回流時間（60 min），考察不同水浴溫度（60、70、80、90、100 ℃）對槲皮素、山奈酚含量的影響。由圖6 可知，不同回流溫度對槲皮素、山奈酚含量的影響效果基本一致，且隨著回流溫度的上升，槲皮素、山奈酚含量同步增加，90 ℃時趨于平穩(wěn)，因此優(yōu)化試驗(yàn)的回流溫度設(shè)置為90 ℃左右。

圖6 回流溫度對槲皮素、山奈酚含量的影響

2.2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn) 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計在單因素考察結(jié)果基礎(chǔ)上，確定因素水平的范圍、恒溫水浴回流提取及水解條件，分別以乙醇-鹽酸體積比、料液比、回流溫度、回流時間4 個因素作為考察對象，每個因素3 個水平，以槲皮素、山奈酚總含量為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化設(shè)計（表6），數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理［18］。

表6 正交優(yōu)化試驗(yàn)因素及水平

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果和極差（表7）分析可知，各因素對槲皮素和山奈酚總含量的影響表現(xiàn)為A（乙醇-鹽酸體積比）＞D（回流時間）＞C（回流溫度）＞B（料液比），乙醇-鹽酸體積比是影響槲皮素和山奈酚總含量的重要因素。以極差最小的因素B作為誤差項進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表8）表明，A、C、D因素?zé)o顯著差異（P＞0.05），各因素的重要性表現(xiàn)為FA＞FD＞FC＞FB，各因素對槲皮素和山奈酚總含量的影響表現(xiàn)為A（乙醇-鹽酸體積比）＞D（回流時間）＞C（回流溫度）＞B（料液比）。極差分析和方差分析得出優(yōu)化工藝為A3B1C2D1，即以乙醇-鹽酸（體積比為8∶1）為提取及水解的溶劑，每次按料液比1∶20 的量加入，90 ℃恒溫水浴回流60 min。

表7 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表8 正交試驗(yàn)方差分析

2.2.4 優(yōu)化參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn) 上述優(yōu)化工藝參數(shù)不在正交試驗(yàn)組合之內(nèi)，為了進(jìn)一步檢驗(yàn)優(yōu)選工藝的可靠性，取3 份青錢柳葉片粉末，對A3B1C2D1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行HPLC 測定，記錄2 種水解黃酮苷元（槲皮素、山奈酚）的峰面積并計算含量。結(jié)果（表9）表明，驗(yàn)證樣品中槲皮素、山奈酚含量平均值分別為1.663 4、2.325 7 mg/g，槲皮素和山奈酚總含量平均值為3.989 1 mg/g，與正交試驗(yàn)最優(yōu)水平組合（A3B3C2D1）值相當(dāng)，說明優(yōu)化比較成功。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品中2 種水解黃酮苷元的含量測定

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量青錢柳葉片樣品粉末0.5 g（100 目），平行3 份，按“2.3.1”項下方法制備樣品溶液，精密吸取10 μL 進(jìn)樣，按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄槲皮素、山奈酚成分峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計算樣品水解后的2 種黃酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量（n=3）。由表10 可知，槲皮素、山奈酚的平均含量分別為1.691 2、2.726 3 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.76%、2.27%。

表10 樣品中槲皮素、山奈酚的含量

3 討論

采用二極管陣列檢測器（DAD）在190～400 nm下分別對2 個待測成分的對照品溶液進(jìn)行紫外吸收全波長掃描，顯示槲皮素在255、370 nm 波長處有最大吸收，山奈酚在265、370 nm 波長處有最大吸收，故測定波長選擇370 nm，在此波長下，2 種成分基線平穩(wěn)且無其他成分干擾，含量測定靈敏度高。

流動相組成考察了甲醇-0.1%甲酸溶液體系、乙腈-0.1%甲酸溶液體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水為流動相時，2 種待測成分的峰形更尖銳、對稱性更好，達(dá)到相同分離效果的有機(jī)相使用比例低，故流動相組成選用乙腈-0.1%甲酸水溶液體系。以該體系的不同體積分?jǐn)?shù)配比進(jìn)行考察試驗(yàn)，綜合考慮目標(biāo)成分獲得良好的分離效果和適宜的出峰時間，最終選定流動相比例為乙腈∶0.1%甲酸=35∶65（體積比），此比例下11 min 左右可出完峰。

分別以80%甲醇、80%乙醇為溶劑，采用超聲波輔助提取法和回流法提取測定青錢柳葉片中槲皮素、山奈酚含量，但此時所測得的槲皮素、山奈酚含量比較低甚至無法檢出成分峰。后查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，青錢柳黃酮多是槲皮素和山奈酚為母核與糖形成的糖苷［11］，因此，本研究采用加酸提取及水解的方法，使黃酮苷水解為苷元后再測定其相應(yīng)苷元的含量。結(jié)果表明，按本試驗(yàn)優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行水解，色譜圖中的成分峰數(shù)量明顯減少，且水解前含量較多的異槲皮苷的成分峰未能檢出，而槲皮素和山奈酚的色譜峰大大增高，含量均明顯上升，表明黃酮苷完全水解為對應(yīng)的黃酮苷元，符合大多數(shù)黃酮苷類化合物口服后在體內(nèi)代謝為苷元的實(shí)際情況，也能夠緩解目前黃酮苷類對照品缺乏的困境，對評估總黃酮的含量也有一定意義。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)最終優(yōu)化的提取水解工藝可顯著提高青錢柳葉片黃酮苷元含量，建立的檢測方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為青錢柳葉片藥材的質(zhì)量評價提供參考。