柯昌虎，嚴 慧，趙 陽，朱 軍，李志浩

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院，湖北十堰 442008；2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院（西北醫(yī)院），西安 710004）

人口老齡化在全世界呈不可逆的趨勢，是人類正面臨的一個共同難題。目前，中國65 歲及以上人口比重達13.50%［1］，即將步入中度老齡化階段，人口老齡化程度已明顯高于世界平均水平（9.3%）。衰老是生物體的結構和功能隨著年齡的增長而下降的一種生理性現(xiàn)象，與炎癥反應、應激反應、能量代謝、內(nèi)分泌等有關，已成為糖尿病、癌癥、心血管疾病等人類疾病的主要危險因素［2］。衰老問題是社會問題，也是重要的生物醫(yī)學問題。如何有效延緩衰老進程，提高健康整體水平，應對老齡化帶來的挑戰(zhàn)，成為當下人們思考和關注的熱點問題。中醫(yī)藥在預防保健方面優(yōu)勢明顯，中藥及復方可以有效延緩衰老，干預老年性疾病發(fā)生發(fā)展過程［3］。

黃精（PolygonatiRhizoma）始載于《名醫(yī)別錄》，自古以來作為養(yǎng)生佳品，是一味藥食同源的藥材，廣泛用于臨床配方、中成藥生產(chǎn)以及古法九制后作為功能性食品及藥膳原料等。藥用黃精來源于百合科植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效［4］?，F(xiàn)代研究表明，黃精主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類、生物堿類、植物甾醇類等化學成分［5］，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抑菌抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗骨質(zhì)疏松等多方面的藥理作用［6］，臨床上用于治療動脈粥樣硬化、卵巢功能減退、糖尿病并發(fā)癥、原發(fā)性高血壓、慢性胃炎、改善心腎及肝腎功能等。研究發(fā)現(xiàn)，黃精可以通過調(diào)控BDNF-TrkB 信號途徑，顯著上調(diào)突觸可塑性相關蛋白的表達，改善自然衰老大鼠海馬和皮層神經(jīng)元損傷，進而改善自然衰老大鼠認知功能障礙［7］；可以通過降低ROS水平來延緩傳代培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞的衰老進程并保護其功能［8］；可以通過抑制ATM/ATR 通路，調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞的細胞周期，干預內(nèi)皮祖細胞的老化進程［9］。黃精中功能性成分多糖可以通過調(diào)節(jié)大鼠Klotho-FGF23內(nèi)分泌軸、緩解氧化應激、平衡鈣磷代謝發(fā)揮抗衰老作用［10］；可以通過抑制氧化應激來減輕D-半乳糖誘導的心臟衰老［11］；可以清除自由基，增加抗氧化酶活性，能夠改善D-Gal模型小鼠學習記憶的能力［12］。雖然黃精具有良好的抗衰老作用，但其抗衰老的藥效物質(zhì)成分尚無系統(tǒng)報道，發(fā)揮療效的具體機制亦不明確。本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法，構建黃精有效成分-靶點-衰老作用網(wǎng)絡，探討其抗衰老的物質(zhì)基礎及可能的分子作用機制，為臨床治療衰老及保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃精活性成分及作用靶點的篩選

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集黃精的化學成分，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 兩個指標作為篩選條件獲取候選成分［13］，在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取相關成分的SMILES 格式，未檢索到的化合物通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載成分的mol2 格式文件，然后轉化為SMILES格式文件。通過Swiss target prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）導入SMILES 文件獲取成分的靶點，取Probability 大于0 的靶點。

1.2 衰老疾病相關靶點的篩選及共同靶點的獲取

以“aging”為檢索詞，分別在GeneCards（https：//www. genecards. org/）、OMIM（https：//omim. org/）、DiGSeE（http：//210.107.182.61/geneSearch/）、HAGR（https：//genomics.senescence.info/）數(shù)據(jù)庫中篩選衰老相關靶點，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫中提取關聯(lián)性評分大于10 的基因。在Venny 2.1 在線平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分別錄入黃精與衰老的靶點，繪制韋恩圖，獲取二者的共有靶點。

1.3 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡的構建

使用Cytoscape 3.8.2 軟件上傳成分及靶點信息，構建“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網(wǎng)絡圖，使用Network Analyzer 功能以節(jié)點度值（Degree）為拓撲指標進行分析。在網(wǎng)絡中，節(jié)點分別代表藥物、成分、靶點和疾病，邊表示任意兩者之間的互作關系。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡的構建

在STRING 在線平臺數(shù)據(jù)庫（https：//www.stringdb.org/）中，點擊Multiple proteins 上傳共有靶點，設置Organism 類型為“Homo sapiens”，選擇交互作用大于0.4 的靶點，下載TSV 格式數(shù)據(jù)文件，導入Cytoscape 3.8.2 軟件中進行拓撲分析，構建蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡可視化。

1.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO 功能與KEGG 通路富集分析，主要由以下4步進行。第一步，上傳黃精的有效作用靶點；第二步，Select Identifier 設置為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，并限定物種為“Homo Sapiens”；第三步，List Type 設置為“Gene List”；第四步，提交數(shù)據(jù)獲取結果。以P＜0.01 為閾值進行篩選，探討黃精抗衰老的生物學過程和信號通路。

1.6 分子對接驗證

從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載活性成分2D 結構的sdf文件，使用Open Babel 軟件將其轉化為mol2 格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中獲得蛋白受體的3D 結構，運用PyMOL 軟件對蛋白去水、去除蛋白結構中小分子配體，保存pdb 文件格式。使用AutoDock 工具將蛋白和活性成分進行分子對接，再使用PyMOL 軟件對成分-蛋白對接結果進行可視化分析。結合自由能小于0，則表明藥物成分的分子和配體受體可以自發(fā)結合，結合打分值越低則形成的復合物越穩(wěn)定。

2 結果與分析

2.1 黃精主要活性成分及作用靶點

檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到黃精的化學成分114個，以OB≥30%和DL≥0.18 作為指標共篩選出活性成分12 個，結果見表1。將各個成分的SMILES 格式導入Swiss target prediction 數(shù)據(jù)中查找成分靶點，取Probability 大于0，合并去重共得到318 個靶點。

續(xù)表1

2.2 疾病靶點的檢索及藥物-疾病共有靶點的篩選

使用GeneCards、OMIM、DiGSeE、HAGR 數(shù)據(jù)庫篩選衰老靶點，合并去重后共獲得506 個靶點。使用Venny 在線工具對黃精靶點和衰老靶點進行交集分析，繪制出韋恩圖，如圖1 所示，二者取匹配后得到黃精和衰老共有靶點81 個。

圖1 黃精和衰老的靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建

將黃精活性成分與共有靶點等信息輸入到Cytoscape 3.8.2 軟件中，繪制“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡，如圖2 所示。共有95 個節(jié)點、302條邊，圖中黃色六邊形代表黃精，綠色正方形代表中藥的核心成分，藍色圓形代表靶點，紅色菱形代表疾病。對網(wǎng)絡圖進行拓撲分析，degree平均值為6.357 9，其中degree 排名前5 位的成分是黃芩素（degree=31）、4′，5-二羥基黃酮（degree=30）、甘草素（degree=28）、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮（degree=28）、zhonghualiaoine 1（degree=25），可能是黃精抗衰老的關鍵活性成分。

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建

在STRING 數(shù)據(jù)庫中錄入黃精和衰老共有靶點，選取置信度＞0.4 的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，得到黃精抗衰老的靶點蛋白相互作用信息數(shù)據(jù)，導入Cytoscape 3.8.2 軟件中進行PPI可視化分析，網(wǎng)絡中共有81 個節(jié)點，共有910 條邊，degree 平均值為22.469 1，大于平均值靶點的有34 個，結果如圖3 所示。Degree 排名前5位的靶點是EGFR（degree=60）、VEGFA（degree=57）、HIF1A（degree=51）、ESR1（degree=51）、STAT3（degree=51），其可能在抗衰老中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.5 GO 功能富集分析結果

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對篩選的基因進行GO 功能富集分析（P＜0.01），結果共有227 條生物學過程，其中生物過程（BP）164 條，主要涉及蛋白質(zhì)自磷酸化、細胞增殖的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等；細胞組分表達過程（CC）25 條，主要涉及核質(zhì)、胞漿、受體復合物、小窩、線粒體等；分子功能相關的過程（MF）38 條，主要涉及酶結合、ATP 結合、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、蛋白質(zhì)結合等。分別選取BP、CC、MF 的前10 個條目進行氣泡圖展示，結果見圖4，其中橫軸為富集因子，縱軸為GO 功能名稱，表明黃精可以通過參與調(diào)控多種生物學過程而發(fā)揮抗衰老作用。

圖4 黃精抗衰老的GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析結果

對篩選的基因進行KEGG 通路富集分析（P＜0.01），共獲得79 條信號通路，主要涉及癌癥途徑（30個靶點）、癌癥中的蛋白多糖（21 個靶點）、HIF-1 信號通路（15 個靶點）、Ras 信號通路（20 個靶點）、癌癥的中樞碳代謝（13 個靶點）、PI3K-Akt 信號通路（23個靶點）、FoxO 信號通路（16 個靶點）、Rap1 信號通路（18 個靶點）、催乳素信號通路（12 個靶點）、ErbB信號通路（12 個靶點）、胰島素信號通路（14 個靶點）等。選擇前20 條進行氣泡圖展示，結果如圖5 所示，其中橫軸為富集因子，縱軸為通路名稱，表明黃精的有效成分和抗衰老靶點可能分布于不同的通路中，可通過多種通路達到抗衰老的作用。

圖5 黃精抗衰老的KEGG 通路富集分析

2.7 分子對接結果

從PDB 數(shù)據(jù)庫中篩選受體EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 的蛋白三維結構，將其分別與配體黃芩素（C4）、4′，5 -二羥基黃酮（C1）、甘草素（C2）、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮（C3）、zhonghualiaoine 1（C11）在AutoDock中進行分子對接，結合能小于-20.93 kJ/mol 表示可以形成穩(wěn)定的對接結構［14］，5 個活性成分與5 個靶點之間均能產(chǎn)生穩(wěn)定的結合，對接結合能見圖6。受體ESR1 與配體的結合能均小于-20.93 kJ/mol，使用PyMOL 軟件進行可視化分析，結果顯示，ESR1 與C4通過氨基酸殘基ALA318、ASP321、ARG363 產(chǎn)生6個氫鍵作用，與C1 通過氨基酸殘基GLY521、LEU387 產(chǎn)生2 個氫鍵作用，與C2 通過氨基酸殘基GLU353、ARG394 產(chǎn)生2 個氫鍵作用，與C3 通過氨基酸殘基GLY521 產(chǎn)生1 個氫鍵作用，與C11 通過氨基酸殘基HIS305 產(chǎn)生3 個氫鍵作用（圖7）。

圖6 對接結合能熱圖

圖7 分子對接圖

3 小結與討論

衰老是生理功能不可逆轉地逐漸衰退，表現(xiàn)出抵抗感染的能力下降、對疫苗的反應減弱、癌癥發(fā)病率增加、自身免疫和結構性低度炎癥的發(fā)病率升高等，會引起各種癌癥、心血管疾病、代謝性疾病等諸多與年齡相關的疾病，從而給家庭和整個社會帶來了沉重的心理和經(jīng)濟負擔［15］。因此，尋找抗衰老藥物對延緩生理性衰老和治療衰老相關疾病都至關重要。中醫(yī)藥干預衰老以整體觀念、辨證論治為特點，在延緩衰老方面作用明顯?！侗阕印分杏涊d黃精“得坤土之氣，獲天地之精”，被美譽為“仙人余糧”，《本草綱目》稱黃精“補諸虛、填精髓，平補氣血而潤”。黃精對肺、脾、腎都能補益，藥用食用均可以防衰延年。現(xiàn)代藥理研究也表明黃精具有良好的延緩衰老等藥理作用，但其化學成分復雜，治療衰老分子機制尚未明確，本研究采用網(wǎng)絡藥理學對黃精治療衰老的機制進行分析，并利用分子對接技術進行驗證。

以生物利用度和類藥性為考察指標，從黃精中篩選出黃芩素、4′，5-二羥基黃酮、甘草素、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等活性成分。其中，黃芩素屬于黃酮類活性成分，能夠有效清除自由基，起到抗氧化劑作用，并應用于治療與氧化應激相關的多種疾病，可以通過降低果蠅體內(nèi)活性氧、丙二醛、氧化型谷胱甘肽等3 種物質(zhì)的含量，減輕氧化應激水平，從而延長果蠅壽命［16］；可以通過調(diào)控氨基酸代謝、核苷酸代謝和糖代謝等途徑延緩大鼠衰老［17］；可以提高衰老大鼠心肌抗氧化能力，抑制其下游p53/p21Cip1/Waf1信號通路，延緩成年SD 大鼠的心肌衰老［18］；可以顯著抑制SAMP8 小鼠大腦皮層中IL-6、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子的釋放，明顯改變6 個菌屬的豐度，通過抑制皮層促炎細胞因子和調(diào)節(jié)腸道菌群，改善小鼠的衰老狀態(tài)和認知功能［19］；可以通過抑制SASP，抑制JAK2/STAT1/NF-κB 通路和調(diào)節(jié)亮氨酸代謝，在H2O2誘導的衰老星形膠質(zhì)細胞中發(fā)揮保護和抗衰老作用［20］。甘草素屬于雙氫黃酮類成分，具有抗炎、抗氧化以及神經(jīng)保護作用，能夠改善學習記憶功能，有助于延緩衰老。生物體內(nèi)自由基過量累積會加速機體老化，甘草素可以通過抽氫反應捕獲體內(nèi)·OH、·OOH 和·OOCl3C 3 種活性氧自由基，發(fā)揮清除自由基作用［21］。甘草素還具有雌激素樣作用，通過上調(diào)ERβ 水平，對抗Aβ 毒副作用，可以消除去卵巢APP/PS1 雙轉基因小鼠腦內(nèi)老年斑［22］。

經(jīng)黃精和衰老共有靶點交集篩選出EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶點。其中表皮生長因子（EGF）是EGFR 最重要的配體之一，影響細胞的增殖、分化等過程，以EGF 激活EGFR 能夠誘導細胞衰老［23］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）參與血管生成，在控制血管通透性、維持心血管活性及微血管密度等方面發(fā)揮重要的作用。通過基因手段保持循環(huán)中的VEGF 水平能夠維持衰老過程中的血管穩(wěn)態(tài)，提供全面的衰老保護，減輕各種年齡相關疾病，例如年齡相關的體重增加、肝脂肪變性、骨質(zhì)疏松、炎癥和腫瘤。提升小鼠體內(nèi)VEGF 水平，能夠顯著延長小鼠壽命，雄性小鼠延壽48%、雌性小鼠延壽39%［24］。缺氧誘導因子1A（HIF1A/HIF1α）信號在急性缺氧應激中，對維持細胞存活具有非常重要的意義。長期慢性的缺氧以及病理性應激條件下，HIF-1α 信號會通過誘導組蛋白賴氨酸去甲基化酶來破壞染色質(zhì)的穩(wěn)定性，從而引起細胞衰老和組織纖維化。同時，細胞衰老提供的炎性微環(huán)境又會進一步刺激HIF-1α 誘導的組蛋白賴氨酸去甲基化酶的表達，從而陷入一個惡性循環(huán)［25］。雌激素受體α（ESRα）參與衰老過程中的生物過程，有助于維持心血管、代謝、認知、下丘腦和邊緣功能等生物功能，ERα 基因（ESR1）的DNA 甲基化變化在調(diào)節(jié)ERα 水平中起直接作用，老年女性E2 水平下降與ESR1 基因CpGI 低甲基化的降低有關［26］。信號轉導與轉錄激活子3（STAT3）作為JAK/STATs 通路的重要成員，廣泛參與免疫調(diào)節(jié)、衰老等過程。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3通路及自噬激活參與血管緊張素II誘導的小鼠腎小管上皮細胞衰老過程，氯沙坦作用可抑制STAT3 的激活、抑制自噬過度激活并延緩小鼠腎小管上皮細胞衰老［27］。

經(jīng)GO 功能分析獲取蛋白質(zhì)自磷酸化、細胞增殖的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控等生物學過程。經(jīng)KEGG 通路分析獲取癌癥途徑、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1、Ras、癌癥的中樞碳代謝、PI3K-Akt、FoxO、Rap1 等信號通路。其中，HIF-1 在機體對低氧濃度或缺氧應答中至關重要，能夠激活多種靶基因的轉錄，調(diào)控生長發(fā)育、生理應激及病理狀態(tài)過程，可以通過發(fā)揮抗衰老功能，延長maa-1 缺陷蠕蟲的壽命［28］。Ras 通過下游通路激活p53 從而誘導衰老，通過非依賴p53 的途徑產(chǎn)生OIS，同時可以通過失活C/EBPβ 逃逸衰老，K-Ras 也可以通過抑制p53 的活性逃逸衰老［29］。PI3K-Akt 信號通路參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等過程，激活PI3K-Akt 通路可以促進細胞系的生長和增殖，同時AKT 表達水平的升高可以保護細胞對抗衰老和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子1（IGF-1）經(jīng)PI3K-Akt 通路調(diào)控2 型糖尿病患者骨髓間充質(zhì)干細胞衰老及成骨分化［30］；外源性硫化氫可以激活PI3K/Akt/eNOS 信號通路，改善H2O2誘導的內(nèi)皮細胞衰老［31］。哺乳動物的FoxO 家族包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4 和FoxO6，其中FoxO1 參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞內(nèi)氧化應激機體能量代謝及眾多生物學過程，miR-96-5p 可通過負調(diào)控FoxO1 調(diào)節(jié)成骨細胞的衰老、凋亡和成骨分化，從而影響成骨細胞的衰老過程［32］。FoxO3a 變異與許多種群的壽命有關，在皮膚角質(zhì)形成細胞及成纖維細胞中均可表達，是PI3K/AKT 通路的關鍵靶點，PI3K/Akt/FoxO3a 通路激活可以逆轉TNF-α 引起的GNRH1 基因抑制和NF-κB 激活，有助于防止衰老相關的下丘腦GnRH 釋放減少［33］。FoxO4 是胰島素/胰島素樣生長因子信號通路的靶點和活性氧的調(diào)節(jié)因子，與細胞衰老和組織穩(wěn)態(tài)密切相關。靶向抑制FoxO4 的表達可有效延緩人臍帶間充質(zhì)干細胞的衰老［34］。調(diào)控蛋白Rap1 與衰老密切相關，Rap1缺陷會加劇端粒磨損，通過激活p53，從而抑制PPARα 的表達，小鼠心臟出現(xiàn)衰老相關表型以及脂肪酸代謝降低，Rap1/p53/PPARα 信號可能是預防/減輕心臟衰老的治療靶點［35］。在低劑量化療藥物誘導的胃癌細胞衰老過程中，可見Rap1 表達升高，且促進了SASP 相關因子的表達［36］。最后，通過AutoDock 分子對接發(fā)現(xiàn)黃芩素、4′，5-二羥基黃酮、甘草素、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等成分與EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶點相互作用，表明黃精具有抗衰老的功效。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合分子對接的方法對黃精抗衰老的物質(zhì)基礎和作用機制進行探索，從分子水平對其作用機制進行系統(tǒng)分析，黃精中黃芩素、4′，5-二羥基黃酮、甘草素等活性成分可以通過多靶點、多途徑抗衰老，從而為其分子機制的深入研究、臨床應用以及保健產(chǎn)品開發(fā)研究提供思路。