柯昌虎,嚴 慧,趙 陽,朱 軍,李志浩
(1.湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院,湖北十堰 442008;2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院(西北醫(yī)院),西安 710004)
人口老齡化在全世界呈不可逆的趨勢,是人類正面臨的一個共同難題。目前,中國65 歲及以上人口比重達13.50%[1],即將步入中度老齡化階段,人口老齡化程度已明顯高于世界平均水平(9.3%)。衰老是生物體的結構和功能隨著年齡的增長而下降的一種生理性現(xiàn)象,與炎癥反應、應激反應、能量代謝、內(nèi)分泌等有關,已成為糖尿病、癌癥、心血管疾病等人類疾病的主要危險因素[2]。衰老問題是社會問題,也是重要的生物醫(yī)學問題。如何有效延緩衰老進程,提高健康整體水平,應對老齡化帶來的挑戰(zhàn),成為當下人們思考和關注的熱點問題。中醫(yī)藥在預防保健方面優(yōu)勢明顯,中藥及復方可以有效延緩衰老,干預老年性疾病發(fā)生發(fā)展過程[3]。
黃精(PolygonatiRhizoma)始載于《名醫(yī)別錄》,自古以來作為養(yǎng)生佳品,是一味藥食同源的藥材,廣泛用于臨床配方、中成藥生產(chǎn)以及古法九制后作為功能性食品及藥膳原料等。藥用黃精來源于百合科植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖,具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效[4]?,F(xiàn)代研究表明,黃精主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類、生物堿類、植物甾醇類等化學成分[5],具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抑菌抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗骨質(zhì)疏松等多方面的藥理作用[6],臨床上用于治療動脈粥樣硬化、卵巢功能減退、糖尿病并發(fā)癥、原發(fā)性高血壓、慢性胃炎、改善心腎及肝腎功能等。研究發(fā)現(xiàn),黃精可以通過調(diào)控BDNF-TrkB 信號途徑,顯著上調(diào)突觸可塑性相關蛋白的表達,改善自然衰老大鼠海馬和皮層神經(jīng)元損傷,進而改善自然衰老大鼠認知功能障礙[7];可以通過降低ROS水平來延緩傳代培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞的衰老進程并保護其功能[8];可以通過抑制ATM/ATR 通路,調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞的細胞周期,干預內(nèi)皮祖細胞的老化進程[9]。黃精中功能性成分多糖可以通過調(diào)節(jié)大鼠Klotho-FGF23內(nèi)分泌軸、緩解氧化應激、平衡鈣磷代謝發(fā)揮抗衰老作用[10];可以通過抑制氧化應激來減輕D-半乳糖誘導的心臟衰老[11];可以清除自由基,增加抗氧化酶活性,能夠改善D-Gal模型小鼠學習記憶的能力[12]。雖然黃精具有良好的抗衰老作用,但其抗衰老的藥效物質(zhì)成分尚無系統(tǒng)報道,發(fā)揮療效的具體機制亦不明確。本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法,構建黃精有效成分-靶點-衰老作用網(wǎng)絡,探討其抗衰老的物質(zhì)基礎及可能的分子作用機制,為臨床治療衰老及保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。
通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集黃精的化學成分,以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18 兩個指標作為篩選條件獲取候選成分[13],在PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取相關成分的SMILES 格式,未檢索到的化合物通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載成分的mol2 格式文件,然后轉化為SMILES格式文件。通過Swiss target prediction 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)導入SMILES 文件獲取成分的靶點,取Probability 大于0 的靶點。
以“aging”為檢索詞,分別在GeneCards(https://www. genecards. org/)、OMIM(https://omim. org/)、DiGSeE(http://210.107.182.61/geneSearch/)、HAGR(https://genomics.senescence.info/)數(shù)據(jù)庫中篩選衰老相關靶點,其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫中提取關聯(lián)性評分大于10 的基因。在Venny 2.1 在線平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)分別錄入黃精與衰老的靶點,繪制韋恩圖,獲取二者的共有靶點。
使用Cytoscape 3.8.2 軟件上傳成分及靶點信息,構建“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網(wǎng)絡圖,使用Network Analyzer 功能以節(jié)點度值(Degree)為拓撲指標進行分析。在網(wǎng)絡中,節(jié)點分別代表藥物、成分、靶點和疾病,邊表示任意兩者之間的互作關系。
在STRING 在線平臺數(shù)據(jù)庫(https://www.stringdb.org/)中,點擊Multiple proteins 上傳共有靶點,設置Organism 類型為“Homo sapiens”,選擇交互作用大于0.4 的靶點,下載TSV 格式數(shù)據(jù)文件,導入Cytoscape 3.8.2 軟件中進行拓撲分析,構建蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡可視化。
利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO 功能與KEGG 通路富集分析,主要由以下4步進行。第一步,上傳黃精的有效作用靶點;第二步,Select Identifier 設置為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,并限定物種為“Homo Sapiens”;第三步,List Type 設置為“Gene List”;第四步,提交數(shù)據(jù)獲取結果。以P<0.01 為閾值進行篩選,探討黃精抗衰老的生物學過程和信號通路。
從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載活性成分2D 結構的sdf文件,使用Open Babel 軟件將其轉化為mol2 格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中獲得蛋白受體的3D 結構,運用PyMOL 軟件對蛋白去水、去除蛋白結構中小分子配體,保存pdb 文件格式。使用AutoDock 工具將蛋白和活性成分進行分子對接,再使用PyMOL 軟件對成分-蛋白對接結果進行可視化分析。結合自由能小于0,則表明藥物成分的分子和配體受體可以自發(fā)結合,結合打分值越低則形成的復合物越穩(wěn)定。
檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到黃精的化學成分114個,以OB≥30%和DL≥0.18 作為指標共篩選出活性成分12 個,結果見表1。將各個成分的SMILES 格式導入Swiss target prediction 數(shù)據(jù)中查找成分靶點,取Probability 大于0,合并去重共得到318 個靶點。
續(xù)表1
使用GeneCards、OMIM、DiGSeE、HAGR 數(shù)據(jù)庫篩選衰老靶點,合并去重后共獲得506 個靶點。使用Venny 在線工具對黃精靶點和衰老靶點進行交集分析,繪制出韋恩圖,如圖1 所示,二者取匹配后得到黃精和衰老共有靶點81 個。
圖1 黃精和衰老的靶點韋恩圖
將黃精活性成分與共有靶點等信息輸入到Cytoscape 3.8.2 軟件中,繪制“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡,如圖2 所示。共有95 個節(jié)點、302條邊,圖中黃色六邊形代表黃精,綠色正方形代表中藥的核心成分,藍色圓形代表靶點,紅色菱形代表疾病。對網(wǎng)絡圖進行拓撲分析,degree平均值為6.357 9,其中degree 排名前5 位的成分是黃芩素(degree=31)、4′,5-二羥基黃酮(degree=30)、甘草素(degree=28)、(2R)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-苯并四氫吡喃-4-酮(degree=28)、zhonghualiaoine 1(degree=25),可能是黃精抗衰老的關鍵活性成分。
在STRING 數(shù)據(jù)庫中錄入黃精和衰老共有靶點,選取置信度>0.4 的網(wǎng)絡數(shù)據(jù),得到黃精抗衰老的靶點蛋白相互作用信息數(shù)據(jù),導入Cytoscape 3.8.2 軟件中進行PPI可視化分析,網(wǎng)絡中共有81 個節(jié)點,共有910 條邊,degree 平均值為22.469 1,大于平均值靶點的有34 個,結果如圖3 所示。Degree 排名前5位的靶點是EGFR(degree=60)、VEGFA(degree=57)、HIF1A(degree=51)、ESR1(degree=51)、STAT3(degree=51),其可能在抗衰老中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對篩選的基因進行GO 功能富集分析(P<0.01),結果共有227 條生物學過程,其中生物過程(BP)164 條,主要涉及蛋白質(zhì)自磷酸化、細胞增殖的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等;細胞組分表達過程(CC)25 條,主要涉及核質(zhì)、胞漿、受體復合物、小窩、線粒體等;分子功能相關的過程(MF)38 條,主要涉及酶結合、ATP 結合、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、蛋白質(zhì)結合等。分別選取BP、CC、MF 的前10 個條目進行氣泡圖展示,結果見圖4,其中橫軸為富集因子,縱軸為GO 功能名稱,表明黃精可以通過參與調(diào)控多種生物學過程而發(fā)揮抗衰老作用。
圖4 黃精抗衰老的GO 功能富集分析
對篩選的基因進行KEGG 通路富集分析(P<0.01),共獲得79 條信號通路,主要涉及癌癥途徑(30個靶點)、癌癥中的蛋白多糖(21 個靶點)、HIF-1 信號通路(15 個靶點)、Ras 信號通路(20 個靶點)、癌癥的中樞碳代謝(13 個靶點)、PI3K-Akt 信號通路(23個靶點)、FoxO 信號通路(16 個靶點)、Rap1 信號通路(18 個靶點)、催乳素信號通路(12 個靶點)、ErbB信號通路(12 個靶點)、胰島素信號通路(14 個靶點)等。選擇前20 條進行氣泡圖展示,結果如圖5 所示,其中橫軸為富集因子,縱軸為通路名稱,表明黃精的有效成分和抗衰老靶點可能分布于不同的通路中,可通過多種通路達到抗衰老的作用。
圖5 黃精抗衰老的KEGG 通路富集分析
從PDB 數(shù)據(jù)庫中篩選受體EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 的蛋白三維結構,將其分別與配體黃芩素(C4)、4′,5 -二羥基黃酮(C1)、甘草素(C2)、(2R)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-苯并四氫吡喃-4-酮(C3)、zhonghualiaoine 1(C11)在AutoDock中進行分子對接,結合能小于-20.93 kJ/mol 表示可以形成穩(wěn)定的對接結構[14],5 個活性成分與5 個靶點之間均能產(chǎn)生穩(wěn)定的結合,對接結合能見圖6。受體ESR1 與配體的結合能均小于-20.93 kJ/mol,使用PyMOL 軟件進行可視化分析,結果顯示,ESR1 與C4通過氨基酸殘基ALA318、ASP321、ARG363 產(chǎn)生6個氫鍵作用,與C1 通過氨基酸殘基GLY521、LEU387 產(chǎn)生2 個氫鍵作用,與C2 通過氨基酸殘基GLU353、ARG394 產(chǎn)生2 個氫鍵作用,與C3 通過氨基酸殘基GLY521 產(chǎn)生1 個氫鍵作用,與C11 通過氨基酸殘基HIS305 產(chǎn)生3 個氫鍵作用(圖7)。
圖6 對接結合能熱圖
圖7 分子對接圖
衰老是生理功能不可逆轉地逐漸衰退,表現(xiàn)出抵抗感染的能力下降、對疫苗的反應減弱、癌癥發(fā)病率增加、自身免疫和結構性低度炎癥的發(fā)病率升高等,會引起各種癌癥、心血管疾病、代謝性疾病等諸多與年齡相關的疾病,從而給家庭和整個社會帶來了沉重的心理和經(jīng)濟負擔[15]。因此,尋找抗衰老藥物對延緩生理性衰老和治療衰老相關疾病都至關重要。中醫(yī)藥干預衰老以整體觀念、辨證論治為特點,在延緩衰老方面作用明顯?!侗阕印分杏涊d黃精“得坤土之氣,獲天地之精”,被美譽為“仙人余糧”,《本草綱目》稱黃精“補諸虛、填精髓,平補氣血而潤”。黃精對肺、脾、腎都能補益,藥用食用均可以防衰延年。現(xiàn)代藥理研究也表明黃精具有良好的延緩衰老等藥理作用,但其化學成分復雜,治療衰老分子機制尚未明確,本研究采用網(wǎng)絡藥理學對黃精治療衰老的機制進行分析,并利用分子對接技術進行驗證。
以生物利用度和類藥性為考察指標,從黃精中篩選出黃芩素、4′,5-二羥基黃酮、甘草素、(2R)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-苯并四氫吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等活性成分。其中,黃芩素屬于黃酮類活性成分,能夠有效清除自由基,起到抗氧化劑作用,并應用于治療與氧化應激相關的多種疾病,可以通過降低果蠅體內(nèi)活性氧、丙二醛、氧化型谷胱甘肽等3 種物質(zhì)的含量,減輕氧化應激水平,從而延長果蠅壽命[16];可以通過調(diào)控氨基酸代謝、核苷酸代謝和糖代謝等途徑延緩大鼠衰老[17];可以提高衰老大鼠心肌抗氧化能力,抑制其下游p53/p21Cip1/Waf1信號通路,延緩成年SD 大鼠的心肌衰老[18];可以顯著抑制SAMP8 小鼠大腦皮層中IL-6、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子的釋放,明顯改變6 個菌屬的豐度,通過抑制皮層促炎細胞因子和調(diào)節(jié)腸道菌群,改善小鼠的衰老狀態(tài)和認知功能[19];可以通過抑制SASP,抑制JAK2/STAT1/NF-κB 通路和調(diào)節(jié)亮氨酸代謝,在H2O2誘導的衰老星形膠質(zhì)細胞中發(fā)揮保護和抗衰老作用[20]。甘草素屬于雙氫黃酮類成分,具有抗炎、抗氧化以及神經(jīng)保護作用,能夠改善學習記憶功能,有助于延緩衰老。生物體內(nèi)自由基過量累積會加速機體老化,甘草素可以通過抽氫反應捕獲體內(nèi)·OH、·OOH 和·OOCl3C 3 種活性氧自由基,發(fā)揮清除自由基作用[21]。甘草素還具有雌激素樣作用,通過上調(diào)ERβ 水平,對抗Aβ 毒副作用,可以消除去卵巢APP/PS1 雙轉基因小鼠腦內(nèi)老年斑[22]。
經(jīng)黃精和衰老共有靶點交集篩選出EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶點。其中表皮生長因子(EGF)是EGFR 最重要的配體之一,影響細胞的增殖、分化等過程,以EGF 激活EGFR 能夠誘導細胞衰老[23]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)參與血管生成,在控制血管通透性、維持心血管活性及微血管密度等方面發(fā)揮重要的作用。通過基因手段保持循環(huán)中的VEGF 水平能夠維持衰老過程中的血管穩(wěn)態(tài),提供全面的衰老保護,減輕各種年齡相關疾病,例如年齡相關的體重增加、肝脂肪變性、骨質(zhì)疏松、炎癥和腫瘤。提升小鼠體內(nèi)VEGF 水平,能夠顯著延長小鼠壽命,雄性小鼠延壽48%、雌性小鼠延壽39%[24]。缺氧誘導因子1A(HIF1A/HIF1α)信號在急性缺氧應激中,對維持細胞存活具有非常重要的意義。長期慢性的缺氧以及病理性應激條件下,HIF-1α 信號會通過誘導組蛋白賴氨酸去甲基化酶來破壞染色質(zhì)的穩(wěn)定性,從而引起細胞衰老和組織纖維化。同時,細胞衰老提供的炎性微環(huán)境又會進一步刺激HIF-1α 誘導的組蛋白賴氨酸去甲基化酶的表達,從而陷入一個惡性循環(huán)[25]。雌激素受體α(ESRα)參與衰老過程中的生物過程,有助于維持心血管、代謝、認知、下丘腦和邊緣功能等生物功能,ERα 基因(ESR1)的DNA 甲基化變化在調(diào)節(jié)ERα 水平中起直接作用,老年女性E2 水平下降與ESR1 基因CpGI 低甲基化的降低有關[26]。信號轉導與轉錄激活子3(STAT3)作為JAK/STATs 通路的重要成員,廣泛參與免疫調(diào)節(jié)、衰老等過程。研究發(fā)現(xiàn),STAT3通路及自噬激活參與血管緊張素II誘導的小鼠腎小管上皮細胞衰老過程,氯沙坦作用可抑制STAT3 的激活、抑制自噬過度激活并延緩小鼠腎小管上皮細胞衰老[27]。
經(jīng)GO 功能分析獲取蛋白質(zhì)自磷酸化、細胞增殖的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控等生物學過程。經(jīng)KEGG 通路分析獲取癌癥途徑、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1、Ras、癌癥的中樞碳代謝、PI3K-Akt、FoxO、Rap1 等信號通路。其中,HIF-1 在機體對低氧濃度或缺氧應答中至關重要,能夠激活多種靶基因的轉錄,調(diào)控生長發(fā)育、生理應激及病理狀態(tài)過程,可以通過發(fā)揮抗衰老功能,延長maa-1 缺陷蠕蟲的壽命[28]。Ras 通過下游通路激活p53 從而誘導衰老,通過非依賴p53 的途徑產(chǎn)生OIS,同時可以通過失活C/EBPβ 逃逸衰老,K-Ras 也可以通過抑制p53 的活性逃逸衰老[29]。PI3K-Akt 信號通路參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等過程,激活PI3K-Akt 通路可以促進細胞系的生長和增殖,同時AKT 表達水平的升高可以保護細胞對抗衰老和凋亡。研究發(fā)現(xiàn),胰島素樣生長因子1(IGF-1)經(jīng)PI3K-Akt 通路調(diào)控2 型糖尿病患者骨髓間充質(zhì)干細胞衰老及成骨分化[30];外源性硫化氫可以激活PI3K/Akt/eNOS 信號通路,改善H2O2誘導的內(nèi)皮細胞衰老[31]。哺乳動物的FoxO 家族包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4 和FoxO6,其中FoxO1 參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞內(nèi)氧化應激機體能量代謝及眾多生物學過程,miR-96-5p 可通過負調(diào)控FoxO1 調(diào)節(jié)成骨細胞的衰老、凋亡和成骨分化,從而影響成骨細胞的衰老過程[32]。FoxO3a 變異與許多種群的壽命有關,在皮膚角質(zhì)形成細胞及成纖維細胞中均可表達,是PI3K/AKT 通路的關鍵靶點,PI3K/Akt/FoxO3a 通路激活可以逆轉TNF-α 引起的GNRH1 基因抑制和NF-κB 激活,有助于防止衰老相關的下丘腦GnRH 釋放減少[33]。FoxO4 是胰島素/胰島素樣生長因子信號通路的靶點和活性氧的調(diào)節(jié)因子,與細胞衰老和組織穩(wěn)態(tài)密切相關。靶向抑制FoxO4 的表達可有效延緩人臍帶間充質(zhì)干細胞的衰老[34]。調(diào)控蛋白Rap1 與衰老密切相關,Rap1缺陷會加劇端粒磨損,通過激活p53,從而抑制PPARα 的表達,小鼠心臟出現(xiàn)衰老相關表型以及脂肪酸代謝降低,Rap1/p53/PPARα 信號可能是預防/減輕心臟衰老的治療靶點[35]。在低劑量化療藥物誘導的胃癌細胞衰老過程中,可見Rap1 表達升高,且促進了SASP 相關因子的表達[36]。最后,通過AutoDock 分子對接發(fā)現(xiàn)黃芩素、4′,5-二羥基黃酮、甘草素、(2R)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-苯并四氫吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等成分與EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶點相互作用,表明黃精具有抗衰老的功效。
綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合分子對接的方法對黃精抗衰老的物質(zhì)基礎和作用機制進行探索,從分子水平對其作用機制進行系統(tǒng)分析,黃精中黃芩素、4′,5-二羥基黃酮、甘草素等活性成分可以通過多靶點、多途徑抗衰老,從而為其分子機制的深入研究、臨床應用以及保健產(chǎn)品開發(fā)研究提供思路。