陳姎玲，潘小芳，徐 浩，陳 睿，霍麗妮，梁 燕

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

靈芝（Ganoderma lucidum）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，別稱瑞草、仙草、赤芝等，在中國存在兩千多年的藥用歷史，其中紫芝和赤芝的子實(shí)體被《中華人民共和國藥典（一部）》收錄藥用。靈芝是靈芝科靈芝屬藥食同源真菌，其味甘，性平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，具有止咳、平喘、補(bǔ)氣、安神等功效［1，2］，從古至今一直被用作促進(jìn)身體健康、永葆青春活力、延年益壽的良藥?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)靈芝具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、保肝護(hù)肝和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用［3-5］，其化學(xué)成分主要包含多糖類、三萜類、甾醇、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷類等活性成分［6］，目前已被廣泛用于藥品、保健品以及化妝品等領(lǐng)域［7］。由于傳統(tǒng)中藥化學(xué)成分較為復(fù)雜，且常具有多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，難以從整體對其藥理機(jī)制以及構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究。近年來，從多成分、多靶點(diǎn)的角度出發(fā)，利用大數(shù)據(jù)系統(tǒng)深度挖掘和揭示中藥的藥理作用機(jī)制逐漸成為一種新趨勢。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network pharmacology）是由Hopkins［8］首次提出概念，其基于系統(tǒng)生物學(xué)及藥理學(xué)范疇，通過構(gòu)建化合物與基因、蛋白靶點(diǎn)和疾病等之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體性和系統(tǒng)性角度分析中藥活性成分及相關(guān)藥理機(jī)制［9，10］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重藥物、靶點(diǎn)、疾病三者之間互相協(xié)同、互相作用，在一定程度上可以解決中藥及復(fù)方研究中多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用特點(diǎn)帶來的難題。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并結(jié)合分子對接技術(shù)，檢索靈芝中的關(guān)鍵活性成分并對其相關(guān)靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測分析，全面系統(tǒng)地對靈芝的主要活性成分及藥理作用機(jī)制進(jìn)行分析與挖掘，為科學(xué)研究活性成分、開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化功能性食品提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)

系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）、Swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺(tái)、DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.7.1 軟件、RCSB 平臺(tái)（https：//www.rcsb.org/）、SYBYL2.0 軟件。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)成分收集與活性成分篩選 通過重要系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)，檢索靈芝所含的化學(xué)成分，共得到靈芝的化學(xué)成分242 個(gè)，再以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥40% 及類藥性（drug-like，DL）≥0.18%為限制條件，篩選出靈芝的有效活性成分，這些成分可作為預(yù)測靈芝作用靶點(diǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2.2 潛在作用靶點(diǎn)的收集 將篩選得到靈芝的活性成分以SMILE 格式逐個(gè)導(dǎo)入Swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺(tái)，將研究對象設(shè)為“Homo sapiens”，預(yù)測并整理相關(guān)化合物的潛在作用靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)將用于進(jìn)一步構(gòu)建靶點(diǎn)-生物通路間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 GO 基因注釋及KEGG 富集分析 運(yùn)用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對上述靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。輸入靶點(diǎn)信息后限定靶基因名稱列表為“Human”，收集并整理數(shù)據(jù)，得到靶點(diǎn)在基因功能的富集情況和相關(guān)作用通路。

1.2.4 網(wǎng)絡(luò)圖譜構(gòu)建與分析 使用Cytoscape 3.7.1軟件將篩選得到的活性成分和靶點(diǎn)建立模型；根據(jù)DAVID 數(shù)據(jù)庫中的分析結(jié)果，構(gòu)建靈芝的活性成分-靶點(diǎn)-作用通路（Compound-Target-Pathways，CT-P）網(wǎng)絡(luò)圖?；诰W(wǎng)絡(luò)度（Degree）和介數(shù)（Betweenness）設(shè)置網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)的大小及顏色，以邊連接活性成分與靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)與通路間的作用關(guān)系，最終得到靈芝的活性成分、潛在的蛋白靶點(diǎn)以及通路的關(guān)系圖譜。

1.2.5 分子對接驗(yàn)證 通過RCSB 平臺(tái)（https：//www.rcsb.org/）篩選并下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，利用SYBYL 2.0 軟件對配體小分子進(jìn)行處理并構(gòu)建關(guān)鍵蛋白的活性口袋，將活性成分和靶蛋白進(jìn)行分子對接，得到對接后的對接得分（Total score），以預(yù)測二者的結(jié)合性能，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分的篩選

通過TCMSP 對靈芝化學(xué)成分進(jìn)行篩選，共獲得16 個(gè)活性成分，主要包括1 個(gè)多糖類化合物、8 個(gè)三萜類化合物及7 個(gè)甾體類化合物，分別為靈芝多糖B（MOL011172）、環(huán)氧靈芝醇B（MOL011172）、靈芝醛B（MOL011171）、Ganoderic aldehyde A（MOL011229）、靈芝酮醇（MOL011244）、赤芝醛A（MOL011266）、赤芝醛B（MOL011267）、赤芝醛C（MOL011268）、膽甾-7，22-二烯-3β-醇（MOL011137）、麥角甾-4，7，22-三烯-3，6-二酮（MOL011159）、（5R，10S，13R，14R，17R）-17-［（E，2R）-7-hydroxy-6-methylhept-5-en-2-yl］-4，4，10，13，14-pentamethyl-1，2，5，6，12，15，16，17-octahydrocyclopenta［a］phenanthren-3-one（MOL011251）、麥角甾-4，7，22-三烯-3，6-二酮（MOL011160）、麥角甾-7，22-二烯-3β-亞油酸酯（MOL011165）、麥角甾-7，9（11），22-三烯-3β，5α，6α-三醇（MOL011168）、過氧麥角甾醇（MOL011169）、麥角甾-7，22-二烯-3β-醇（MOL000282），它們均表現(xiàn)出較高的口服生物利用度和類藥性，所有化合物OB均在40%以上，大部分化合物的DL在0.80%以上（表1）。靈芝能有效治療急性腸炎、乳腺炎、肝炎等炎性疾病，多糖和三萜類化合物是靈芝抗炎的主要活性物質(zhì)［11］。此外，靈芝中的三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝護(hù)肝、降血脂和抗病毒等多種藥理功效［12］。靈芝多糖還能改善胰島細(xì)胞功能，抑制機(jī)體胰島素抵抗［13］，還能促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖隨后增強(qiáng)機(jī)體免疫力［14］，并在調(diào)節(jié)抗氧化功能方面存在重要作用［15］。林志彬［16］研究表明靈芝總甾醇以及靈芝多糖均可對抗缺氧再氧化過程對體外培養(yǎng)神經(jīng)元的損傷，從而保護(hù)神經(jīng)元的活性，由此表明，靈芝豐富的藥理活性可能與這些三萜類、甾體類及多糖類成分有關(guān)。

表1 靈芝的活性成分

2.2 活性成分靶點(diǎn)篩選及成分-靶點(diǎn)模型構(gòu)建

將篩選獲得的16 個(gè)活性成分導(dǎo)入Swiss targetprediction 網(wǎng)站，預(yù)測出人源基因的相關(guān)蛋白靶點(diǎn)總數(shù)為240 個(gè)，包括63 個(gè)不同的蛋白靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1 軟件將篩選的16 個(gè)活性成分連接上述靶點(diǎn)，繪制得到成分-靶點(diǎn)（C-T）網(wǎng)絡(luò)（圖1），共包含79 個(gè)節(jié)點(diǎn)（16 個(gè)活性成分和63 個(gè)潛在靶點(diǎn)）；左側(cè)節(jié)點(diǎn)代表活性成分，右側(cè)節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)，活性成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系以線連接。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)度和介數(shù)值與節(jié)點(diǎn)的重要性呈正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)的大小由其網(wǎng)絡(luò)度決定，網(wǎng)絡(luò)度越大，節(jié)點(diǎn)越大（表2），度數(shù)大的靶標(biāo)蛋白可能是靈芝活性成分的核心靶點(diǎn)。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

由圖1、表2 可以看出，不同的化合物均對應(yīng)不同靶點(diǎn)，其中，雄激素受體（Androgen receptor，AR）是靈芝中16 個(gè)活性成分的共有靶標(biāo)；類固醇生成相關(guān)靶點(diǎn)CYP17A1、CYP19A1 均對應(yīng)了靈芝的12 個(gè)活性成分；此外，有10 個(gè)活性成分均與重組人酪氨酰胺DNA 磷酸二酯酶1（TDP1）、重組人微管相關(guān)蛋白（MAPT）、肝X 受體（Liver X receptors，LXRs）（NR1H2、NR1H3）、糖皮質(zhì)激素受體（NR3C1）和鹽皮質(zhì)激素受體（NR3C2）等靶點(diǎn)相關(guān)。其中，AR 屬于核受體超家族中的類固醇受體，主要存在于靶細(xì)胞的核內(nèi)，張子彥等［17］報(bào)道表明AR 的變異與前列腺癌有關(guān)，還具有刺激骨髓造血的功能，廣泛用于再生性障礙性貧血的治療。類固醇生成相關(guān)蛋白CYP17A1 和CYP19A1，是細(xì)胞色素P450（CYP）的2個(gè)亞型，CYP17A1 和CYP19A1 的基因多態(tài)性與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［18-20］。NRIH2 和NRIH3是肝X 受體2 種同源亞型，LXRs 參與機(jī)體膽固醇代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪形成、糖原異生和炎癥等多種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)，與心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌肥厚、心肌纖維化等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［21］。此外，有研究證明LXRs 可通過調(diào)控一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲、誘導(dǎo)凋亡等，進(jìn)而影響前列腺癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、白血病等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［22］。NR3C1 及NR3C2 基因多態(tài)性與心血管疾病以及一些癌癥有關(guān)。TDP1 是一種關(guān)鍵酶，可通過水解30 個(gè)磷酸酪氨酸鍵來修復(fù)與拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topoisomerase I，TOPO-I）相關(guān)的DNA斷裂，因而TDP1 抑制劑常用來治療腫瘤［23］。MAPT基因是最早被發(fā)現(xiàn)與額顳葉癡呆有關(guān)的致病基因［24］。通過對靈芝中的活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的分析，靈芝中的靈芝多糖、三萜類及甾體類等活性成分發(fā)揮藥理作用可能與這些核心靶點(diǎn)有關(guān)。

2.3 GO 和KEGG 富集分析

DAVID 為線上生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫，幫助識(shí)別并獲取大量的基因或蛋白質(zhì)功能等信息［25］。為了闡明靈芝的藥理作用機(jī)制，將上述得到的63 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO 基因功能注釋分析和KEGG 通路富集分析，經(jīng)GO 注釋分析，共映射到116 個(gè)GO term，包括69 個(gè)生物過程（Biological process，BP）、16 個(gè)細(xì)胞組分（Cellular component，CC）和31 個(gè)分子功能（Molecular function，MF）。選擇P＜0.01，挑選出BP、CC、MF 共3 個(gè)部分最顯著富集的15 個(gè)GO term，如圖2 所示。其中，靈芝發(fā)揮藥理活性的生物過程與腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路（Adenylate cyclase-inhibiting G-protein coupled acetylcholine receptor signaling pathway）密切相關(guān)，而在細(xì)胞組分中與細(xì)胞連接（Cell junction）相關(guān)性最大，在分子功能中與蛋白激酶C 活性（Protein kinase cactivity）聯(lián)系緊密。通過KEGG 富集分析結(jié)果，靈芝的活性成分潛在的63 個(gè)藥效靶點(diǎn)共參與48 條信號(hào)通路，據(jù)此推測靈芝可通過多個(gè)靶點(diǎn)、不同生物通路協(xié)同發(fā)揮藥效。根據(jù)所得通路P大小，得到最顯著富集的通路15 條（圖3），其中包括Steroid hormone biosynthesis（類固醇激素生物合成）、Vascular smooth muscle contraction（血管平滑肌收縮）、Calcium signaling pathway（鈣信號(hào)通路）、Cholinergic synapse（膽堿能突觸）、Pancreatic secretion（胰腺分泌）、Inflammatory mediator regulation of TRP channels（炎癥介質(zhì)對TRP 通道的調(diào)節(jié)）、Insulin resistance（胰島素抵抗）、Aldosterone-regulated sodium reabsorption（醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收）、Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption（內(nèi)分泌等因素調(diào)節(jié)鈣再吸收）、Retrograde endocannabinoid signaling（逆行神經(jīng)信號(hào)）等信號(hào)通路。以上分析結(jié)果進(jìn)一步確定了與靈芝活性成分相關(guān)的作用通路，為其藥理作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了參考方向。

圖2 GO 富集分析（P＜0.01）

圖3 KEGG 通路富集分析

2.4 活性成分-靶點(diǎn)-通路（C-T-P）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)KEGG 通路富集分析結(jié)果，利用Cytoscape軟件中“Merge”工具建立靈芝“活性成分-靶點(diǎn)蛋白-通路”（C-T-P）網(wǎng)絡(luò)模型，從而更直觀地觀察三者之間的作用關(guān)系。如圖4 所示，16 個(gè)活性成分（方形內(nèi)圓節(jié)點(diǎn)）共對應(yīng)到37 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)（方形外圓節(jié)點(diǎn)），涉及相關(guān)信號(hào)通路15 條（V 形節(jié)點(diǎn)），節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)度越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越亮。根據(jù)C-T-P網(wǎng)絡(luò)模型可知，靈芝的活性成分可作用在多個(gè)靶點(diǎn)，對應(yīng)多條通路，其中網(wǎng)絡(luò)中連接度排名前5 的活性成分為 MOL011169、MOL011229、MOL011266、MOL011171、MOL011157，連接度排名前8 的通路為Calcium signaling pathway（鈣信號(hào)通路）、Cholinergic synapse（膽堿能突觸）、Vascular smooth muscle contraction（血管平滑肌收縮）、Steroid hormone biosynthesis（甾類激素生物合成）、Neuroactive ligand-receptor interaction（神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用）、Insulin resistance（胰島素抵抗）、Inflammatory mediator regulation of TRP channels（炎癥介質(zhì)對TRP 通道的調(diào)節(jié)）、Pancreatic secretion（胰腺分泌）。其中，鈣信號(hào)通路中重要因子發(fā)生差異表達(dá)與阿爾茨海默病密切相關(guān)［26］，血管平滑肌的收縮在多種血管病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［27］。胰島素抵抗與糖尿病有關(guān)，炎癥介質(zhì)對TRP 通道的調(diào)節(jié)涉及炎癥相關(guān)疾病，甾類激素生物合成可調(diào)控許多至關(guān)重要的生長發(fā)育過程，神經(jīng)活動(dòng)配體-受體的相互作用與老年癡呆等神經(jīng)類疾病有關(guān)，這些通路與靈芝具備的抗腫瘤、抗糖尿病、抗衰老和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用相關(guān)。

圖4 活性成分-作用靶點(diǎn)-通路（C-T-P）的網(wǎng)絡(luò)

2.5 分子對接驗(yàn)證

在藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域，常利用計(jì)算機(jī)模擬結(jié)合及化學(xué)參數(shù)的運(yùn)算技術(shù)實(shí)現(xiàn)受體-配體間的對接，進(jìn)而預(yù)測出小分子化合物和大分子蛋白靶點(diǎn)的親和能力及結(jié)合方式［28］。通過分子對接對GO 和KEGG 富集結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證，用Surflex-Dock 對接得分結(jié)果評價(jià)配體和受體的結(jié)合能力，分?jǐn)?shù)越高，則兩者結(jié)合穩(wěn)定性越好。當(dāng)對接得分高于4.25 分時(shí)，說明靈芝活性成分與靶點(diǎn)擁有一定的結(jié)合能力；當(dāng)對接得分高于5.00 分時(shí)，說明靈芝的活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合活性較好；當(dāng)對接得分高于7 分時(shí)，靈芝的活性成分與蛋白靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合能力［28］。分子對接結(jié)果（表3）表明，靈芝中60%以上的活性成分與其核心靶點(diǎn)能夠相互作用，且具有較好的結(jié)合活性，說明利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性較好。其中，麥角甾-7，22-二烯-3β-亞油酸酯與其關(guān)鍵靶點(diǎn)CYP17A1、HSD17B2、HSD11B1、HSD11B2、PTPM、PLA2G2A 等具有較高的結(jié)合能力，特別是與靶點(diǎn)HSD17B2的結(jié)合能力最高，其對接得分達(dá)12.169 7分。

圖5 麥角甾-7，22-二烯-3β-醇亞油酸酯與HSD17B2 的分子對接

為進(jìn)一步研究靈芝活性成分與潛在蛋白靶點(diǎn)的作用方式，以得分最高的化合物麥角甾-7，22-二烯-3β-亞油酸酯為代表，采用Ligplot 工具對其與靶點(diǎn)蛋白HSD17B2 的結(jié)合模式進(jìn)行分析。對接結(jié)果（圖5）表明，化合物整個(gè)甾體母核嵌入在活性口袋中，與Arg258、Leu262、Met47、Gly186、Pro187、Ser142、Lys159、Asn90、Thr140、Phe192、Gly92、Tyr155、Phe 226、Tyr218、Leu149、His221、Phe259、Val 225、Glu282 等多個(gè)氨基酸殘基形成了強(qiáng)烈的疏水作用，因而麥角甾-7，22-二烯-3β-醇亞油酸酯與HSD17B2 形成的復(fù)合物穩(wěn)定性較好，這也是該化合物與靶點(diǎn)HSD17B2 具備較好結(jié)合能力的原因。

3 小結(jié)

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過構(gòu)建C-T-P網(wǎng)絡(luò)，考察靈芝在不同信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)效應(yīng)，以期揭示其分子可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，靈芝中三萜類、甾體類及多糖類成分是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，它們主要作用于CYP17A1、CYP19A1、NR1H2、NRIH3、PRKCG、PRKCB、HSD17B2、NO1、NO2、NO3、HSD17B12、HSD11B1、HSD11B2 等37 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與血管平滑肌收縮、類固醇激素生物合成途徑、胰島素抵抗等15 個(gè)相關(guān)通路，這些靶點(diǎn)或通路與抗腫瘤、降糖、抗高血壓等多種藥理活性相關(guān)。本研究為促進(jìn)傳統(tǒng)藥物靈芝的多維藥理機(jī)制研究及其在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。