翟洪穩(wěn)，馬紅玉，馬俊美，曹梅榮，王 敬，王 娟，李 強

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，國家市場監(jiān)管重點實驗室（特殊食品監(jiān)管技術），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北 石家莊 050091）

特殊醫(yī)學用途配方食品（以下簡稱特醫(yī)食品）是為了滿足各種特定疾病人群對營養(yǎng)素或膳食的特殊需要，專門加工配制而成的配方食品[1-2]。二十世紀八九十年代，特醫(yī)食品開始廣泛使用于歐美國家臨床治療中，此后，特醫(yī)食品進入快速發(fā)展階段。至2015年，特醫(yī)食品在歐美發(fā)達國家年消費約為400～500億 美元，年增長速率為4.5%[3]。特醫(yī)食品在我國起步晚，近年來，市場占有率增速明顯，平均年增長速率超過37%[4]。GB 25596—2010《特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品通則》、GB 29922—2013《特殊醫(yī)學用途配方食品通則》及GB 29923—2013《特殊醫(yī)學用途配方食品良好生產規(guī)范》規(guī)范了不同類別特醫(yī)食品中營養(yǎng)元素、多種維生素和礦物質等不可缺少的營養(yǎng)成分[5-8]。其中VA、VD（VD2和VD3）和VE（α-、β-、γ-和δ-VE）是機體維持正常代謝和機能所必需的脂溶性維生素[7]。VA又叫視黃醇，可促進眼內色素形成，防止夜盲癥，同時還可以促進機體正常生長發(fā)育、保持代謝平衡和增強免疫力等[9]；缺乏會引起夜盲癥、干眼病、免疫功能異常等各種疾病[10]。VD是固醇類衍生物，具有調節(jié)鈣和磷代謝、維持骨骼和牙齒健康、免疫調控和促進機體內多種細胞增殖等功能，其在母乳中主要以VD3和25-OH VD3的形式存在[11]；人體內缺少可導致佝僂病、骨軟化癥及骨質疏松[12]。VE又叫生育酚，一類具有生物活性的酚類物質，包含α-、β-、γ-、δ-生育酚4 種同分異構體。VE是最主要的抗氧化劑之一，可降低衰老速率，維持生殖器官正常功能，對機體認知功能和神經發(fā)育有重要作用[13]；缺乏VE會導致新生兒溶血性貧血[14]。特醫(yī)食品中需強化VA、VD、VE，但添加量要在規(guī)定范圍內，不能過高也不能過低。因此，檢測特醫(yī)食品中VA、VD、VE的含量具有重要意義。

為確保維生素在特醫(yī)食品運輸和貯存過程中的穩(wěn)定性，VA和VE主要是以醋酸酯或棕櫚酸酯的狀態(tài)，采用微膠囊化技術添加到嬰幼兒特醫(yī)食品中；VD3通常被制成水可分散性的微粒。因此，食品檢驗檢測過程中，VA、VD、VE定量過程復雜，難度較大[15]。目前，VA、VD、VE的研究主要針對乳粉、奶制品等基質，有液相色譜法[16-19]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[20-23]等，但是針對于特醫(yī)食品基質的研究較少。VA、VD、VE的測定方法需通過高溫皂化除去樣品中脂肪并且將維生素醋酸酯等水解，利用石油醚液液萃取，旋轉蒸發(fā)濃縮后進行含量檢測；復雜的前處理過程，容易造成目標物的降解和損失。其中由于VD含量較低，還需利用正向制備色譜進一步凈化才能進行檢測，不能實現(xiàn)VA、VE和VD的同時測定，實際工作中樣品的分析效率低。二維液相色譜是將兩個具有不同分離機理的色譜柱串聯(lián)組合，通過濃縮、捕集或切割后將一個或所有組分從一維柱轉移到二維柱進一步分析。與普通液相色譜相比，二維液相色譜能夠顯著提高峰容量，可以在線聯(lián)用多個色譜體系，提高色譜分離能力，適用于復雜基質樣品和痕量樣品的分析，這為復雜體系中VA、VD、VE的同時測定提供了新的思路[24-25]。相關文獻[26-29]對二維液相色譜法測定乳粉中的VA、VD、VE進行了大量研究，利用一維系統(tǒng)使VA和4 種VE異構體得到分離，通過中心切割使VD進入二維色譜柱，進一步分離得到VD2和VD3，從而實現(xiàn)7 種脂溶性維生素的同時測定。雖然二維液相色譜法在一定程度上提高了分析檢測速率，但仍需皂化、有機溶劑萃取、旋蒸濃縮等繁復的前處理過程。

本實驗在二維液相色譜法的基礎上，增加在線前處理模塊，樣品經過簡單的高溫皂化處理后，經固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）泵進樣，利用在線固相萃?。╫nline-SPE）柱凈化提取，然后進入二維液相色譜系統(tǒng)對VA、VD、VE分離測定（圖1）。整個過程前處理過程簡單，只需一次進樣便可完成7 種脂溶性維生素的定量分析，不僅提高了檢測效率，而且保證了樣品回收率。本方法具有方便、快速、精確等優(yōu)點，旨在為特醫(yī)食品中VA、VD、VE的測定提供技術支撐。

圖1 online-SPE-二維液相色譜系統(tǒng)流路示意圖Fig.1 Flow chart of on-line solid phase extraction coupled with twodimensional liquid chromatography

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品VA（純度99.30%）、α-VE（純度98%）、β-VE（純度98%）、δ-VE（純度90.00%）、γ-VE（純度≥96%）美國Sigma公司；標準品VD2（純度98.30%）、VD3（純度98.84%）德國Dr.Ehrensorfer公司。

L-抗壞血酸（純度＞99.0%）、2,6-二叔丁基對甲酚（純度＞99.0%）阿拉丁試劑（上海）有限公司；KOH（優(yōu)級純）天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇、無水乙醇、異丙醇、乙腈（均為色譜純）美國Thermo Fisher科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜系統(tǒng)（包括可變波長檢測器、二極管陣列檢測器、兩個四元泵、一個二元泵（圖1））美國Aglient公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；電子天平 美國Mettler Toledo公司；離心機、Milli-Q純水機 德國Merck公司；渦旋振蕩器德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品配制

維生素用無水乙醇配成不同質量濃度的標準溶液。VA（0.50 mg/mL），VD2、VD3（均為0.10 mg/mL），α-、β-、γ-、δ-VE（均為1.0 mg/mL）標準儲備液，于-20 ℃冰箱中避光保存。臨用前參照GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測定》附錄B對儲備液進行濃度校正。

取上述校準后標準品溶液適量，用50%乙醇溶液稀釋成系列標準混合工作溶液，具體質量濃度如表1所示。

表1 VA、VD、VE工作曲線Table 1 Preparation of standard solutions of VA,VD and VE μg/mL

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL聚丙烯管中，加入10 mL溫水（40 ℃），渦旋混勻，加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g 2,6-二叔丁基對甲酚，再加入20 mL無水乙醇和10 mL KOH溶液（質量分數50%），渦旋振蕩1 min，皂化30 min（80 ℃水?。?，過程中不斷振搖。皂化后冷卻至室溫，用體積分數50%乙醇溶液定容至50 mL。離心10 min（4 ℃、10000 r/min），取上層清液1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后，待測。

1.3.3 色譜條件

online-SPE柱：PLRP-S（4.6 mm×12.5 mm，15～20 μm）；流動相：A相為水，B相為乙腈，C相為甲醇，D相為異丙醇。一維色譜柱：Poroshell 120 PFP（4.6 mm×100 mm，4.0 μm）；流動相：A相為水，B相為甲醇；二維色譜柱：Zorbax Eclipse PAH（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），流動相：A相為乙腈，B相為甲醇；進樣量：50 μL。流動相梯度洗脫見表2。閥切換步驟和位置見表3。高效液相色譜系統(tǒng)流路示意圖見圖1。

表2 online-SPE-二維液相色譜梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for on-line solid phase extraction coupled with 2D-LC

表3 閥切換過程和位置Table 3 Valve switching programs and positions

2 結果與分析

2.1 online-SPE條件的優(yōu)化

近年來，二維液相色譜測定乳粉中的脂溶性維生素得到充分研究，方法也日趨成熟，但此類方法仍需經過液液萃取，凈化，旋蒸濃縮等步驟，樣品回收率的穩(wěn)定性較差[26-29]。本實驗旨在利用SPE代替液液萃取及凈化等過程，并利用六通閥切換實現(xiàn)在線上樣、轉移和平衡等步驟，提高回收率并保證其穩(wěn)定性[30-31]（圖1A、B）。因此，不僅需要選擇適宜的SPE柱，上樣及轉移過程也必須得到關注。

本方法前處理過程參照GB 5009.82—2016皂化步驟，皂化液為強堿性，直接進入儀器分析，分別選取C18和PLRP-S兩種online-SPE柱進行考察，比較其凈化效果。分別用體積分數60%甲醇、80%甲醇、60%乙醇、80%乙醇溶液將樣品從自動進樣器引入SPE柱，當80%甲醇作為上樣溶劑時，SPE柱對于脂溶性維生素具有較好的富集作用。選用60%、70%、80%甲醇溶液進行洗脫轉移，發(fā)現(xiàn)70%甲醇溶液具有較好的凈化效果。同時比較兩種SPE柱發(fā)現(xiàn)，PLRP-S柱的凈化效果更好，PLRP-S柱采用聚合物填料，具有良好的化學穩(wěn)定性，對于堿性皂化液耐受性更強[31]。此外，使用乙腈-異丙醇（50∶50，V/V）溶液和甲醇-水（80∶20，V/V）溶液對SPE柱進行淋洗，除去殘留的無機鹽、蛋白質、脂肪酸和其他非皂化物等雜質成分[32]。綜上考慮，選取PLRP-S柱作為online-SPE柱，甲醇-水（80∶20，V/V）溶液上樣，乙腈-異丙醇（50∶50，V/V）溶液和甲醇-水（80∶20，V/V）溶液淋洗去除雜質，甲醇-水溶液（70∶30，V/V）洗脫轉移，后進入一維色譜柱進行分析，具體梯度洗脫和閥切換程序見表2。

2.2 色譜分析條件的優(yōu)化

二維液相色譜是將兩個不同分離效果的色譜柱串聯(lián)組合，采用中心切割原理，將一維柱上未完全分離的目標物轉移到二維色譜柱上進一步凈化分析，適用于多干擾物的復雜基質樣品，在食品檢測中也得到了廣泛應用[24]。特醫(yī)食品中VD因含量較低，且雜質干擾嚴重，經一維色譜柱無法得到峰形良好的目標峰，需要二維色譜柱進一步分離測定（圖1C）。另外，VE的4 種同分異構體中，α-生育酚活性最高，其含量測定方法研究較多[33-34]，近期有文獻表明，其余異構體也有重要的生物活性作用[35]，故需建立一種準確分離4 種異構體的測定方法。因此，建立色譜分析條件時，需要充分考慮以上因素。

建立二維液相色譜條件時，需要充分考慮到流動相的兼容性，因此不能采用GB 5009.82—2016中先經正相色譜分離凈化，再利用反相色譜分析的條件。目前，二維液相色譜均采用反相色譜法，VA和4 種VE在特醫(yī)食品中含量較高，直接在一維色譜柱上完成測定，但需重點關注同分異構體的有效分離。本實驗嘗試了C8、C18、PFP三種色譜柱用于一維液相分離，結果發(fā)現(xiàn)C8、C18柱均不能將β-、γ-VE有效分離，而PFP柱因其五氟苯基硅烷鍵合相的存在，對于β-、γ-VE同分異構體的分離效果良好（一維色譜圖見圖2），因此選用Poroshell 120 PFP柱作為一維色譜柱[33]。另外，VD在樣品中含量低，利用一維色譜系統(tǒng)凈化除去部分干擾成分，將其轉移至二維系統(tǒng)進行定量分析，此時準確判斷切割時間窗口尤為關鍵，太窄不能保證全部目標物被轉移，太寬則會帶入過多干擾物質（圖1C）。實驗過程中，先以高濃度標準品注入色譜系統(tǒng)中，連續(xù)進樣，準確定位其色譜峰的保留時間，確定閥切換時間，從而保證實際樣品中VD被完整地切割至二維分析柱中（二維色譜圖見圖3）。VD主要包括VD2和VD3，均屬于開環(huán)甾體類，兩種化合物結構類似，性質接近，較難實現(xiàn)基線分離。二維系統(tǒng)選擇Zorbax Eclipse PAH色譜柱，該色譜柱適用于芳香烴類化合物的分離，研究發(fā)現(xiàn)其可以有效地分離VD2和VD3，此外該色譜柱與一維色譜柱兼容性良好。

圖2 VA和4 種VE標準品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of VA and VE standards

2.3 方法線性范圍、定量限

對上述優(yōu)化條件進行方法學考察。結果表明，7 種維生素在其質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.997。將混合標準溶液加入空白基質中，經前處理后以RSN=10計算各組分的定量限，得出VA、VD、VE定量限分別為5.35、0.298 μg/100 g和53.5 μg/100 g（表4）。

表4 方法的線性范圍、校準曲線及定量限Table 4 Regression equations,linearity ranges and quantification limits of VA,VD and VE

2.4 方法回收率、精密度考察結果

以乳清粉作為空白樣品，加入VA、VD和VE的標準溶液，分低、中、高3 個水平，每個添加水平重復做6 個樣品。按1.3.2節(jié)皂化后，利用online-SPE-二維液相色譜法測定方法的回收率和精密度，結果見表5。7 種脂溶性維生素的加標回收率在84.4%～109.0%之間，相對標準偏差為0.34%～6.55%，所建方法各項性能參數滿足檢測需求。

表5 VA、VD和VE的加標回收率和精密度Table 5 Recoveries and precision for VA,VD and VE

2.5 實際樣品測定及與標準方法比較

為進一步驗證本方法對特醫(yī)食品的適用性，選擇3 種類型的配方粉，利用本方法和二維液相色譜法[15]分別測定其維生素含量，測定結果如表6所示。應用t檢驗對兩組測定結果進行比較，兩組數據無顯著差異，表明本方法適用于特醫(yī)食品中VA、VD和VE的測定。

表6 本方法與二維液相色譜法測定結果對比Table 6 Comparison of results from this method and conventional 2D-LC

3 結論

采用online-SPE-中心切割二維液相色譜法同時測定特醫(yī)食品中7 種脂溶性維生素的含量。利用閥切換在線控制SPE柱代替GB 5009.82—2016中提取凈化等復雜步驟，操作簡單、自動化程度高，極大的簡化了前處理過程，此外，基于二維液相色譜原理，一次進樣即可同時完成脂溶性VA、VD2、VD3及α-、β-、γ-、δ-VE的分離測定，經方法學驗證表明，本方法回收率高，靈敏度和精密度良好，可滿足批量樣品檢測需求。此外，online-SPE為VK、β-胡蘿卜素等其他脂溶性維生素的測定，提供了新的解決思路。