盧 璇，張 茜，趙宇軒，易宇文，唐俊妮，鄧 靜，楊發(fā)龍，朱成林,*

（1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610100）

牛乳是最受歡迎的天然飲品之一，因其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被稱為“白色血液”。牛乳中含有水、蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、無(wú)機(jī)鹽等多種成分。在新冠肺炎疫情背景下，居民對(duì)牛乳營(yíng)養(yǎng)保健的認(rèn)可較之前有大幅度提升，認(rèn)為乳制品對(duì)于提升機(jī)體抵抗力有一定作用[1]。國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布了合理營(yíng)養(yǎng)膳食和每天食用牛乳的科學(xué)飲食指導(dǎo)，并將其作為提高免疫力、防控與救治新冠肺炎的重要途徑[2]。因此，我國(guó)乳制品消費(fèi)迎來(lái)新的發(fā)展機(jī)遇，消費(fèi)需求呈現(xiàn)蓬勃的增長(zhǎng)趨勢(shì)。近年來(lái)我國(guó)乳業(yè)發(fā)展迅速，但由于疾病、遺傳、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)等因素的影響，奶牛普遍存在乳產(chǎn)量低和乳品質(zhì)不合格等問(wèn)題，不利于我國(guó)奶業(yè)的持續(xù)壯大發(fā)展。奶牛乳房炎是全世界奶牛業(yè)中最常見(jiàn)、治療最昂貴、造成損失最大的疾病之一，嚴(yán)重影響牛乳營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。臨床乳房炎在我國(guó)發(fā)病率高，更有不良商家在健康原料乳中摻雜乳房炎牛乳，不僅嚴(yán)重影響乳制品的風(fēng)味品質(zhì)，更對(duì)消費(fèi)者的健康影響極大。

代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)代謝物進(jìn)行定量分析并尋找代謝物與生理病理變化關(guān)系的一種新型研究方式。代謝組學(xué)在小分子代謝物水平將細(xì)胞、組織和生物體整個(gè)過(guò)程進(jìn)行聯(lián)系[3]。代謝物與乳成分之間的關(guān)系可以幫助理解乳品的品質(zhì)特性，并且可以突出生物標(biāo)記物小分子的特征。在代謝組學(xué)研究手段中，核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）以其穩(wěn)定、可靠、無(wú)損和樣品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，較為廣泛地應(yīng)用于代謝組學(xué)分析，并已被證明可以快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)牛乳中小分子代謝物的變化規(guī)律[4]。Klein等[5]利用基于核磁共振氫譜的代謝組學(xué)技術(shù)研究奶牛泌乳階段的生理變化和潛在生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)3-羥基丁酸可作為酮癥的標(biāo)志物。Maher等[6]采用1H NMR技術(shù)研究牛乳與奶牛血清代謝產(chǎn)物的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血清中三甲胺水平與牛乳中三甲胺水平高度相關(guān)。孫雨航等[7]應(yīng)用1H NMR技術(shù)鑒定乳熱癥奶牛血清內(nèi)的差異性標(biāo)志代謝產(chǎn)物，從小分子物質(zhì)、能量代謝的角度探究乳熱癥奶牛體內(nèi)的代謝變化。

電子鼻和電子舌統(tǒng)稱智能感官，是一種模擬人類味覺(jué)和嗅覺(jué)的仿生儀器。電子鼻和電子舌可以對(duì)樣品的香氣物質(zhì)和滋味信息進(jìn)行對(duì)比分析，快速分析復(fù)雜的揮發(fā)性氣體混合物，并用于牛乳的區(qū)分和檢測(cè)[8]。Tong Lingjun等[9]采用電子鼻和感官評(píng)價(jià)比較不同預(yù)熱處理脫脂牛乳的風(fēng)味變化，發(fā)現(xiàn)采用適宜的預(yù)熱溫度能使脫脂牛乳香味、甜味等感官屬性增強(qiáng)。郭奇慧等[10]利用電子鼻對(duì)不同原乳進(jìn)行氣味分析，結(jié)果表明，電子鼻可以區(qū)分優(yōu)質(zhì)原乳和異味原乳。毋思敏等[11]利用電子鼻、電子舌技術(shù)分析鮮牛乳在不同貯藏溫度下的品質(zhì)變化情況，并建立了牛乳貨架期預(yù)測(cè)模型。許凌云等[12]應(yīng)用電子鼻結(jié)合電子舌技術(shù)分析不同熱處理對(duì)牛乳風(fēng)味的差異。

本研究以健康牛乳與臨床乳房炎牛乳為研究對(duì)象，采用代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合智能感官比較樣品的風(fēng)味和滋味物質(zhì)差異，旨在為鑒別健康牛乳和臨床乳房炎牛乳提供數(shù)據(jù)支持，為原料乳質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而提高乳制品的風(fēng)味品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康牛乳樣品和乳房炎牛乳樣品均來(lái)自四川成都某奶牛養(yǎng)殖牧場(chǎng)。采集產(chǎn)后150 d的健康牛乳和乳房炎牛乳各100 mL，在4 ℃冷藏，并在2 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。

三氯甲烷（CHCl3）、磷酸鹽緩沖液、疊氮化鈉（NaN3）（均為分析純）西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；2,2,3,3-D4-3-(三甲基硅基)-丙酸鈉鹽（2,2,3,3-D4-3-(trimethylsilyl group)-sodium propionate，TSP）、氘代水（D2O）美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE Ⅲ型NMR波譜儀 德國(guó)Bruker公司；4000乳成分分析儀 丹麥FOSS公司；FOX 4000電子鼻、α-ASTREE型電子舌 法國(guó)Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 乳成分分析

采用乳成分分析儀測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、非脂乳固體含量、密度、乳糖含量、固形物含量、摻水率、溫度、冰點(diǎn)。乳成分分析儀使用前預(yù)熱3 h。

1.3.2 電子鼻分析

準(zhǔn)確吸取樣品1 mL，置于10 mL頂空瓶，密封、編號(hào)。分析條件：手動(dòng)進(jìn)樣，頂空溫度75 ℃，加熱時(shí)間5 min，載氣流量150 mL/s，進(jìn)樣量2000 μL，進(jìn)樣速率2000 μL/s；數(shù)據(jù)采集時(shí)間120 s，時(shí)間延遲180 s。每個(gè)樣品平行測(cè)試5 次，取傳感器后3 次在120 s時(shí)獲得的穩(wěn)定信號(hào)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.3 電子舌分析

自動(dòng)進(jìn)樣，數(shù)據(jù)采集時(shí)間2 min，每個(gè)樣品平行檢測(cè)5 次，取傳感器后3 次在2 min時(shí)采集的穩(wěn)定信號(hào)作為分析數(shù)據(jù)。

1.3.41H NMR分析

量取0.7 mL牛乳樣品于2 mL EP管中，加入0.8 mL CHCl3，旋渦混合3 min，在4 ℃、14000 r/min離心15 min，去除樣品中的脂肪。取0.5 mL上清液，添加10 mmol/L TSP重水溶液0.2 mL，用作NMR化學(xué)位移參考。利用磷酸鹽緩沖液調(diào)整溶液pH值為7.00±0.02，并添加10 μL 2 mmol/L NaN3溶液，以避免微生物繁殖。最后每個(gè)樣品在14000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。

參考葉婷婷等[13]的方法并適當(dāng)優(yōu)化，確定1H NMR譜測(cè)定條件：載波頻率600.13 MHz，檢測(cè)溫度298 K，譜寬1×107，弛豫時(shí)間5 s，獲取數(shù)據(jù)點(diǎn)32000，掃描次數(shù)32，同時(shí)通過(guò)預(yù)飽和CPMG序列抑制水信號(hào)，回波數(shù)量400。NMR光譜處理和標(biāo)峰借助Topspin（3.5）和Chenomx（8.4）軟件完成。在計(jì)算各化合物峰值時(shí)采用全局光譜去卷積算法對(duì)重疊區(qū)域進(jìn)行反卷積，以對(duì)在擁擠光譜區(qū)域出現(xiàn)共振的化合物進(jìn)行絕對(duì)定量。在1H NMR譜中信號(hào)面積與樣品中存在的質(zhì)子數(shù)呈正比，分別對(duì)1H NMR譜圖中單個(gè)信號(hào)進(jìn)行積分，并通過(guò)與內(nèi)標(biāo)信號(hào)比較，計(jì)算極性和非極性組分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用R 語(yǔ)言進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳成分分析結(jié)果

如表1和圖1所示，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)、密度、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、冰點(diǎn)4 個(gè)指標(biāo)P值均小于0.05，具有顯著差異，與健康組相比，乳房炎組牛乳脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低（P＜0.05）。脂肪在體細(xì)胞數(shù)量較多的牛乳中顯著下降，可能是由于乳房發(fā)炎期間乳腺細(xì)胞合成和分泌能力下降。王化江等[14]發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞數(shù)量增多會(huì)顯著降低乳脂肪含量，且游離脂肪酸含量增加，會(huì)產(chǎn)生不同程度的澀味和苦味。而密度、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和冰點(diǎn)在乳房炎牛乳中均顯著上升（P＜0.05）。乳房炎牛乳中蛋白質(zhì)含量增加，可能是由于奶?；既榉垦缀髸?huì)增加乳房毛細(xì)血管的通透性，從而使蛋白含量增加。其余指標(biāo)在兩種牛乳間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 顯著性差異指標(biāo)箱線圖Fig.1 Box plots of significantly differential indicators

表1 乳房炎牛乳和健康乳成分含量及變化趨勢(shì)Table 1 Comparison of chemical composition between mastitic milk and normal milk

2.2 電子鼻分析結(jié)果

由圖2可知，電子鼻可以有效區(qū)分臨床乳房炎牛乳和健康牛乳樣品，PC1貢獻(xiàn)率達(dá)92.7%，可以很好地反映樣品的整體信息。電子鼻的18 個(gè)傳感器對(duì)兩種牛乳的風(fēng)味化合物皆有響應(yīng)，并且響應(yīng)值各不相同。除LY2/LG傳感器響應(yīng)強(qiáng)度差異不顯著，其余17 個(gè)傳感器對(duì)兩種牛乳的響應(yīng)值均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。在健康牛乳中，T70/2、T40/2傳感器有顯著響應(yīng)，對(duì)應(yīng)香氣增加。在乳房炎牛乳中，P30/1、LY2/gCT、P40/2、LY2/G等傳感器具有顯著響應(yīng)，對(duì)應(yīng)的不愉快臭味增加。結(jié)合傳感器對(duì)應(yīng)參考化合物的風(fēng)味特征（表2）可知，奶?；既榉垦缀?，其分泌的乳汁不新鮮，存在一定的刺激性氣味，加工價(jià)值降低。

圖2 健康和乳房炎牛乳的電子鼻PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 PCA score plot (A) and loading plot (B) of electronic nose data for normal and mastitic milk

表2 不同傳感器對(duì)應(yīng)的參考化合物[15]Table 2 Flavor characteristics of reference compounds from different sensors

2.3 電子舌分析結(jié)果

由電子舌PCA圖（圖3）可知，乳房炎組和健康組牛乳滋味不同，有明顯區(qū)分，PC1貢獻(xiàn)率為67%，所占權(quán)重大，PC2貢獻(xiàn)率為33%。所用傳感器包括CTS（咸）、NMS（鮮）、AHS（酸）、SCS（苦）、ANS（甜）5 個(gè)專一屬性和2 個(gè)綜合屬性（PKS、CPS）。健康牛乳中ANS傳感器有顯著響應(yīng)，乳房炎牛乳中SCS傳感器響應(yīng)強(qiáng)度較高。其余傳感器探頭響應(yīng)強(qiáng)度有差異但不顯著。

圖3 健康和乳房炎牛乳的電子舌PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.3 PCA score plot (A) and loading plot (B) of electronic tongue data for normal and mastitic milk

2.4 1H NMR分析結(jié)果

采用1H NMR對(duì)健康牛乳和乳房炎牛乳中的小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，在其1H NMR譜中每種代謝物均有其對(duì)應(yīng)的特征峰。參考前人的研究[16-18]及Chenomx化學(xué)物標(biāo)準(zhǔn)峰數(shù)據(jù)庫(kù)，如圖4所示，利用基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)從牛乳樣本中共精確定性和定量54 種分子，主要為氨基酸、有機(jī)酸、碳水化合物、核苷、核苷酸及其衍生物等化合物。

圖4 乳房炎牛乳1H NMR波譜圖Fig.4 1H NMR spectra of mastitic milk

由圖5可知，23 種定量分子在兩組間差異顯著（P＜0.05），分別是乳酸、異亮氨酸、醋酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、3-羥基丁酸、乙酰肉堿、組氨酸、丙二酸鹽、二甲基砜、麥芽糖、胞嘧啶核苷、三甲胺氮氧化物、肌酸、膽堿、檸檬酸、延胡索酸酯、順烏頭酸、2-氧戊二酸鹽、肌酸酐、乳糖、甘氨酸。

圖5 健康和乳房炎牛乳中顯著差異分子的含量對(duì)比Fig.5 Comparison of contents of significantly differential molecules in normal and mastitic milk

乳酸、異亮氨酸、醋酸、亮氨酸、3-羥基丁酸、精氨酸、纈氨酸在乳房炎牛乳中含量較高，其中4 種屬于氨基酸類，其余3 種屬于有機(jī)酸類。研究表明，在臨床乳房炎牛乳樣中，游離氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、纈氨酸）含量明顯增加[19]。氨基酸含量顯著增加的原因可能是較高的病原特異性發(fā)酵和蛋白質(zhì)降解活性增強(qiáng)[20]。周常義等[21]根據(jù)氨基酸的呈味特性與味覺(jué)強(qiáng)弱，將纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸歸類于苦味氨基酸。因此，可以判斷乳房炎牛乳具有明顯的苦味。乳酸可以由牛乳中的微生物產(chǎn)生，也可以通過(guò)乳房炎癥后上皮細(xì)胞無(wú)氧呼吸產(chǎn)生[22]。研究表明，牛乳中的細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致獨(dú)特的代謝圖譜，表現(xiàn)為乳酸含量升高[23]。在本研究中，臨床乳房炎組的乳酸代謝水平顯著增加，與前人報(bào)道一致。醋酸是牛乳關(guān)鍵風(fēng)味成分，具有較強(qiáng)的酸味，在較高濃度下會(huì)產(chǎn)生異味[24]。丁酸在低濃度時(shí)具有奶香味，而含量過(guò)高時(shí)就會(huì)呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸臭味[25]。

與健康牛乳相比，乙酰肉堿、組氨酸、丙二酸鹽、二甲基砜、麥芽糖、胞嘧啶核苷、三甲胺氮氧化物、肌酸、膽堿、檸檬酸、延胡索酸酯、順烏頭酸、2-氧戊二酸鹽、肌酸酐、乳糖、甘氨酸在乳房炎牛乳中含量下降。這些分子主要參與能量和碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝。三羧酸循環(huán)是主要的代謝途徑，參與此代謝的化合物如檸檬酸、順烏頭酸、2-氧戊二酸鹽在乳房炎牛乳樣品中含量顯著減少。Thomas[26]的研究結(jié)果表明，奶牛患乳房炎后，碳水化合物和能量代謝均將下降。檸檬酸可與糖共同代謝，在酶的催化下經(jīng)多次轉(zhuǎn)化最終形成丙酮酸，而丙酮酸的消耗則可能會(huì)產(chǎn)生其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[27]。延胡索酸酯是三羧酸循環(huán)和尿素的中間產(chǎn)物。體細(xì)胞數(shù)量高的乳房炎牛乳中延胡索酸酯含量下降的原因可能是因?yàn)榧?xì)菌感染或酮癥導(dǎo)致三羧酸循環(huán)功能受損，影響能量代謝，從而引起延胡索酸酯從乳腺上皮分泌或泄漏到牛乳中[19]。甘氨酸是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的天然氨基酸，參與體內(nèi)多種代謝過(guò)程，是肝臟中合成肌酸的主要氨基酸。肌酸大部分以磷酸肌酸的形式存在于肌肉中，參與能量代謝。乳糖是牛乳中一種重要的碳水化合物，當(dāng)奶?；寂R床乳房炎后，乳腺細(xì)胞膜被破壞，血液成分流入牛乳中[28]。為維持滲透壓穩(wěn)定，乳糖含量下降。肉堿是機(jī)體內(nèi)一種氨基酸衍生物，參與體內(nèi)骨骼肌能量代謝、脂代謝、糖代謝等過(guò)程[29]。肉堿在中間代謝的主要功能是將長(zhǎng)鏈脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)骄€粒體基質(zhì)[30]，其前體物質(zhì)是賴氨酸和甲硫氨酸，因此肉堿的缺乏會(huì)導(dǎo)致氨基酸代謝譜異常[31]。肉堿在臨床乳房炎牛乳中含量下降的原因可能是能量代謝受損。

3 結(jié)論

利用基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合智能感官、乳成分分析儀，探究臨床乳房炎對(duì)牛乳理化特性、風(fēng)味和滋味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，電子鼻和電子舌能夠成功區(qū)分健康牛乳和乳房炎牛乳氣味和滋味的差異。采用1H NMR技術(shù)對(duì)健康牛乳和乳房炎牛乳的小分子物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，共分析鑒定出54 種化合物，其中23 種分子含量在兩組牛乳樣本中差異顯著。具體表現(xiàn)為乳房炎牛乳中氨基酸和有機(jī)酸的含量明顯增加，導(dǎo)致乳制品產(chǎn)生不愉悅的酸臭味。本研究為鑒別健康牛乳和臨床乳房炎牛乳提供數(shù)據(jù)支持，為原料乳質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，有助于提高乳制品的風(fēng)味品質(zhì)。