劉士偉,劉勝楠,米倩雯,陰 裴,薛婷芳,于曉然,孟星堅(jiān),王麗娜,畢云楓,*
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)
人參為五加科人參屬草本植物,主要分布于亞洲大陸東部的山林地帶,在我國(guó)的東北地區(qū)常見(jiàn),被譽(yù)為東北三寶之一。人參中富含多種成分,包括人參皂苷[1-2]、多糖、多肽、氨基酸[3]、酚酸、揮發(fā)油、甾醇、炔醇及維生素等[4],不同人參成分的性質(zhì)及藥理活性也各不相同。人參中天然皂苷Rb1、Rc、Rb2、Re和Rg1占人參皂苷總含量的70%~80%,但這些皂苷極性較大,不利于人體吸收,而人參中的稀有人參皂苷卻具有較高的藥理活性。大量研究表明稀有人參皂苷具有抗疲勞、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、增強(qiáng)免疫力[7]、抗炎[8]、輔助降低血糖、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[9]等作用。人參于2012年被批準(zhǔn)為新資源食品,對(duì)于人參發(fā)酵的研究成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。人參發(fā)酵的主要目的是使人參皂苷通過(guò)微生物酶的作用轉(zhuǎn)化生成某些稀有人參皂苷。微生物轉(zhuǎn)化法因其特異性強(qiáng)、節(jié)約成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛使用于稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化[10]。夏晚霞等[11]篩選出發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷的乳酸菌,并分析發(fā)酵過(guò)程中人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化路徑,證實(shí)發(fā)酵過(guò)程中常見(jiàn)皂苷向稀有皂苷的轉(zhuǎn)化,使得稀有皂苷含量提高。陳旸等[12]探究發(fā)酵對(duì)中間產(chǎn)物人參皂苷Rd的轉(zhuǎn)化作用,結(jié)果表明其轉(zhuǎn)化機(jī)制為Rb1→Rd→Rg3,發(fā)酵后人參皂苷Rd含量顯著提高。與之相比,使用人參粗提取物進(jìn)行發(fā)酵,可以最大程度利用微生物分泌的酶分解消耗掉糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),提高人參皂苷純度,同時(shí)得到更多種類(lèi)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,也顯著提高了稀有皂苷轉(zhuǎn)化率。
本實(shí)驗(yàn)以人參提取物(ginseng extract,GE)為研究對(duì)象,采用益生菌植物乳桿菌對(duì)GE進(jìn)行發(fā)酵,通過(guò)高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對(duì)稀有人參皂苷成分進(jìn)行定性和定量分析,測(cè)定并分析GE與發(fā)酵后人參提取物(fermented ginseng extract,F(xiàn)GE)中活性成分含量的變化,同時(shí)對(duì)GE與FGE的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。
干參、黑參購(gòu)于通化市人參交易市場(chǎng),經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院教授鑒定均為五加科植物人參;植物乳桿菌B1由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品新資源團(tuán)隊(duì)篩選并鑒定。
人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(Rh1、Rg2、Rd、Rk3、Rh4、Rg3、PPT、Ck、Rk1、Rg5、Rh2、PPD)成都曼思特生物科技有限公司;β-胡蘿卜素、亞油酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇(均為色譜純)賽默飛世爾科技有限公司;苯酚、濃硫酸、冰乙酸 北京化工廠有限責(zé)任公司;過(guò)硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸 成都科隆化學(xué)品有限公司;其他試劑均為分析純。
HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;FLEXARTM型HPLC儀 美國(guó)Perkin Elmer有限公司;DGL-50B型滅菌鍋 中國(guó)力辰科技有限公司;UV-2600I型可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津(中國(guó))有限公司;GRP-9160型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海深信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TG16高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。
1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵制備FGE
將干參以料液比1∶10分別用水和70%乙醇溶液在85 ℃提取2 h,將得到的人參提取液濃縮干燥后得到的粉末即為GE。將實(shí)驗(yàn)室保存的植物乳桿菌B1在37 ℃活化,將一定比例GE與無(wú)菌水加入到已滅菌的發(fā)酵罐中,隨后加入在MRS培養(yǎng)基中活化好的植物乳桿菌使得乳桿菌終濃度為4%,活菌數(shù)達(dá)到3.15×108CFU/mL,37 ℃恒溫發(fā)酵6 d。測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的pH值,使用0.1 mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定,確定可滴定酸度,在發(fā)酵完成后將發(fā)酵液真空冷凍干燥,得到的粉末即為FGE。
1.3.2 HPLC法分析樣品的制備
取適量GE、FGE、黑參粉分別過(guò)60 目篩,然后加入2 倍體積乙酸乙酯渦旋振蕩,充分混勻進(jìn)行萃取,5000 r/min離心5 min后吸取上清液,再次重復(fù)以上操作,將2 次上清液于85 ℃水浴加熱直至蒸干,然后加入等體積的色譜甲醇,充分溶解,0.22 μm濾膜過(guò)濾,濾液用于HPLC檢測(cè)。
1.3.3 GE與FGE中活性物質(zhì)含量的測(cè)定
1.3.31 總酚含量的測(cè)定
使用沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,參考白周亞等[13]方法采用福林-酚比色法測(cè)定總酚含量。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),于750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.94729x+0.01119,R2=0.9993,總酚含量以每克干物質(zhì)中沒(méi)食子酸的質(zhì)量表示。
1.3.32 多糖含量測(cè)定
使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,參考李萬(wàn)從等[14]方法采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=7.95657x-0.00716,R2=0.9993,多糖含量以每克干物質(zhì)中葡萄糖的質(zhì)量表示。
1.3.33 總黃酮含量測(cè)定
使用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品,參考Kim等[15]方法采用氯化鋁比色法測(cè)定總黃酮含量。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=2.81714x-0.00745,R2=0.9991,總黃酮含量以每克干物質(zhì)中蘆丁的質(zhì)量表示。
1.3.34 總皂苷含量測(cè)定
使用人參皂苷Re作為標(biāo)準(zhǔn)品,參考杜金鳳等[16]方法采用香草醛-冰醋酸法測(cè)定總皂苷含量。以人參皂苷Re質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),于465 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=2.97523x+0.01902,R2=0.9995,總皂苷含量以每克干物質(zhì)中皂苷Re的質(zhì)量表示。
1.3.4 人參皂苷成分的鑒定及定量分析
用HPLC對(duì)1.3.2節(jié)中制得樣品液進(jìn)行稀有人參皂苷成分鑒定,HPLC條件參考李秋陽(yáng)等[17]方法,色譜柱:采用PerkinElmer C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸鹽水溶液(B);檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm,流速:1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫35 ℃,進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫步驟:0~5 min,18% A,82% B;5~20 min,21% A,79% B;20~22 min,21%~26% A,79%~74% B;22~26min,26%~32% A,74%~68% B;26~46 min,32%~33.8% A,68%~66.2% B;46~51 min,33.8%~38% A,66.2%~62% B;51~57.7min,38%~49% A,62%~51% B;57.7~58 min,49%~49.1% A,51%~50.9% B;58~62 min,49.1% A,50.9% B;62~63 min,49.1%~50.6% A,50.9%~49.4% B;63~68 min,50.6%~59.6% A,49.4%~40.4% B;68~69.8 min,59.6%~65% A,40.4%~35% B;69.8~77 min,65% A,35% B;77~94min,65%~85% A,35%~15% B;94~120 min,18% A,82% B。根據(jù)人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量計(jì)算出樣品中稀有皂苷的含量,按照每克提取物中的稀有皂苷質(zhì)量表示,單位為mg/g。
1.3.5 抗氧化活性測(cè)定
1.3.51 DPPH自由基清除能力測(cè)定
參考Chen Fang等[18]方法對(duì)DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL),以抗壞血酸(VC)作為陽(yáng)性對(duì)照。于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率:
式中:A0為1 mL DPPH自由基溶液+1 mL雙蒸水吸光度;A1為1 mL DPPH自由基溶液+1 mL樣品吸光度;A2為1 mL無(wú)水乙醇+1 mL樣品吸光度。
1.3.52 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定
參考Cho等[19]方法并稍作修改,配制不同濃度發(fā)酵前后樣品溶液(同1.3.5.1節(jié)),以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,按式(2)計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率:
式中:A0為4 mL ABTS陽(yáng)離子自由基乙醇溶液+1 mL雙蒸水的吸光度;A1為4 mL ABTS陽(yáng)離子自由基乙醇溶液+1 mL樣品的吸光度;A2為4 mL雙蒸水+1 mL樣品的吸光度。
1.3.53 羥自由基清除能力測(cè)定
參考Ganguly[20]和趙磊[21]等方法,配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液(同1.3.5.1節(jié)),以VC作為陽(yáng)性對(duì)照,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式(3)計(jì)算羥自由基清除率:
式中:A0為乙醇-水楊酸溶液+FeSO4溶液+H2O2溶液+雙蒸水的吸光度;A1為乙醇-水楊酸溶液+FeSO4溶液+H2O2溶液+樣品的吸光度;A2為乙醇-水楊酸溶液+FeSO4溶液+雙蒸水+樣品的吸光度。
1.3.54 還原力測(cè)定
參考李青等[22]方法,配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液(同1.3.5.1節(jié)),以VC為陽(yáng)性對(duì)照。以蒸餾水代替FeCl3溶液作為空白調(diào)零,以去離子水為參比,于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。
1.3.55β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)
參考Park等[23]方法,配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液(同1.3.5.1節(jié)),以2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(butylated hydroxytoluene,BHT)為陽(yáng)性對(duì)照,于470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照,按式(4)計(jì)算β-胡蘿卜素和亞油酸偶聯(lián)自氧化的抑制率:
式中:A1和分別為加入樣品后0 h和6 h的吸光度;A0和分別為空白對(duì)照組0 h和6 h的吸光度。
1.3.56 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定
參考Jung等[24]采用硫氰酸鐵法評(píng)估抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液(同1.3.5.1節(jié)),以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,按式(5)計(jì)算對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率:
式中:A0為第0小時(shí)樣品的吸光度;A1為第72小時(shí)樣品的吸光度。
如圖1所示,植物乳桿菌發(fā)酵GE過(guò)程中,pH值由6.61降至3.31,可滴定酸度由0.24%升至2.81%。因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸,使產(chǎn)物的pH值降低,可滴定酸度增加[25]。
圖1 植物乳桿菌發(fā)酵GE過(guò)程中pH值與可滴定酸度的變化Fig.1 Changes in pH and titratable acidity in GE during the fermentation process
如圖2 所示,與G E 相比,F(xiàn) G E 總酚的含量由11.775 mg/g提高到16.400 mg/g,提高了39.28%。這是由于在發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化,影響了酚類(lèi)物質(zhì)的釋放,微生物把復(fù)雜的大分子酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類(lèi)物質(zhì),使總酚含量增加[26]。這與之前研究[27],由釀酒酵母發(fā)酵黑參中總酚含量高于生參和黑參的結(jié)果相似。
圖2 發(fā)酵對(duì)GE中總酚、多糖、總黃酮和總皂苷含量影響Fig.2 Effect of fermentation on the contents of total phenols,polysaccharides,total flavonoids and total saponins in GE
多糖的含量從630 mg/g降低到350 mg/g,降低了44.44%。這是由于發(fā)酵的進(jìn)行,微生物不斷生長(zhǎng),多糖作為微生物進(jìn)行增殖和合成代謝的重要來(lái)源被不斷的消耗。因此多糖含量的降低與微生物的生長(zhǎng)利用有關(guān)。
總黃酮的含量從2.36 mg/g提高到4.18 mg/g,提高了79.01%。根據(jù)微生物的生長(zhǎng)代謝特點(diǎn),推測(cè)造成總黃酮含量提升可能是由于發(fā)酵過(guò)程中微生物分泌的酶類(lèi)破壞了植物細(xì)胞壁,從而提高了FGE中總黃酮的含量。
總皂苷的含量從250.1 mg/g降低到156.2 mg/g,降低了37.54%。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),總皂苷含量降低,是由于人參中天然皂苷發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)化成了稀有人參皂苷所連糖基被水解掉,分子質(zhì)量降低所致。
通過(guò)HPLC法對(duì)樣品的稀有人參皂苷生成情況進(jìn)行對(duì)比分析,圖3為HPLC測(cè)定色譜圖的對(duì)比。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算出樣品中稀有人參皂苷的含量,結(jié)果如表1所示,經(jīng)過(guò)發(fā)酵,人參皂苷含量與種類(lèi)發(fā)生改變。發(fā)酵前,不含有Rk3、Rh4、Rg5等稀有人參皂苷,發(fā)酵后,生成了上述稀有人參皂苷,且與黑參中稀有皂苷含量對(duì)比,發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵生成稀有人參皂苷的含量高于黑參。夏晚霞等[11]和趙彩秀[28]根據(jù)研究結(jié)果推測(cè),二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化路徑為Rb1/Rb2→Rd→Rg3→Rh2、Rb1/Rc→Rd→Rg1、Rb1→Rd→Rg3→Ck、Rg3→Rg5+Rk1。參考劉偉等[29]三醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化機(jī)理圖,結(jié)合表1稀有皂苷含量結(jié)果,可以推測(cè)出人參皂苷的轉(zhuǎn)化路徑,二醇型人參皂苷為Rb1、Rb2、Rc→Rd→Rg3→Rg5+Ck+Rh2+Rk1→PPD(圖4A),三醇型人參皂苷為Rg1、Re→Rh1+Rg2→Rh4+Rk3→PPT(圖4B)。
表1 發(fā)酵前后稀有人參皂苷含量對(duì)比Table 1 Comparison of rare ginsenoside contents before and after fermentation mg/g
圖3 HPLC色譜圖對(duì)比結(jié)果Fig.3 Comparison results of HPLC chromatograms
圖4 二醇型人參皂苷(A)和三醇型人參皂苷(B)轉(zhuǎn)化路徑Fig.4 Transformation pathways of diol ginsenosides (A) and triol ginsenosides (B)
GE中主要二醇型人參皂苷為Rb1、Rc、Rb2,經(jīng)發(fā)酵生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為稀有人參皂苷Rg3、Ck、Rk1、Rg5和Rh2,這幾種稀有人參皂苷的含量分別增加了1.8075、0.7706、0.7348、1.3648 mg/g和1.4796 mg/g。GE中主要三醇型人參皂苷為Rg1和Re,經(jīng)發(fā)酵生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為稀有人參皂苷Rh1、Rg2、Rk3和Rh4,這幾種稀有人參皂苷的含量分別增加了2.0996、0.8271、0.9493 mg/g和3.3924 mg/g。菌體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶能夠?qū)E中人參二醇型皂苷的C3和C20位、三醇型皂苷的C6和C20位的糖基結(jié)構(gòu)進(jìn)行水解,使天然人參皂苷失去糖基,轉(zhuǎn)化為稀有皂苷和苷元。
2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力
DPPH自由基清除活性測(cè)定原理為紫色DPPH自由基被抗氧化劑還原為淡黃色聯(lián)氨[30]。如圖5A所示,GE和FGE都對(duì)DPPH自由基有清除能力。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~20.0 mg/mL時(shí),GE對(duì)DPPH自由基的清除率為3.43%~65.18%,F(xiàn)GE為14.64%~86.18%。與之相比,陽(yáng)性對(duì)照VC的DPPH自由基清除率為83.15%~95.53%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加,GE和FGE的DPPH自由基清除率均有明顯提升,在同一質(zhì)量濃度下,F(xiàn)GE的DPPH自由基清除率比GE更高,且發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05),說(shuō)明發(fā)酵能夠提升對(duì)DPPH自由基的清除能力。
圖5 GE及FGE在不同質(zhì)量濃度下3 種自由基清除活性Fig.5 Three free radical scavenging activities of GE and FGE at different concentrations
2.4.2 對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力
如圖5B所示,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~20.0 mg/mL時(shí),GE對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力為1.73%~64.75%,F(xiàn)GE為4.43%~81.24%。與之相比,陽(yáng)性對(duì)照VC的ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率為99.05%~99.35%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加,GE和FGE的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均有明顯提升,在同一質(zhì)量濃度下,F(xiàn)GE的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率比GE更高,且發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05)。
2.4.3 對(duì)羥自由基的清除能力
如圖5C所示,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~20.0 mg/mL時(shí),GE對(duì)羥自由基的清除能力為22.29%~68.14%,F(xiàn)GE為35.17%~82.29%。與之相比,陽(yáng)性對(duì)照VC的羥自由基清除率為97.35%~99.37%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加,GE和FGE的羥自由基清除率均有明顯提升,在同一質(zhì)量濃度下,F(xiàn)GE的羥自由基清除率比GE更高,且發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05)。
由于發(fā)酵提高了黃酮和酚類(lèi)活性物質(zhì)的含量,并將天然人參皂苷轉(zhuǎn)化成了大量具有高抗氧化性的稀有人參皂苷。樣品中稀有皂苷的含量越高,清除自由基能力越強(qiáng),抗氧化能力越強(qiáng),這也是FGE清除3 種自由基能力高于GE的原因,但同時(shí)多糖含量、分子質(zhì)量下降也會(huì)影響自由基清除效果。
2.4.4 總還原能力測(cè)定
總還原能力的測(cè)定原理是將鐵氰化鉀的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵,二價(jià)鐵進(jìn)一步和三氯化鐵反應(yīng)生成在700 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰的普魯士藍(lán),吸光度越高則表示樣品的還原能力越強(qiáng)[31]。如圖6所示,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~20.0 mg/mL時(shí)GE吸光度為0.0741~0.6411,F(xiàn)GE為0.0821~0.9244。與之相比,陽(yáng)性對(duì)照VC的吸光度為2.0145~4.2041。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加,GE和FGE的還原能力均有明顯提升,在同一質(zhì)量濃度下,F(xiàn)GE的吸光度高于GE,且發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05)。這是由于在發(fā)酵過(guò)程中形成了能夠與自由基反應(yīng)穩(wěn)定的還原劑,提高了還原能力。
2.4.5 對(duì)β-胡蘿卜素與亞油酸偶聯(lián)自氧化的抑制作用
β-胡蘿卜素是一種多烯橘黃色素,被氧化時(shí)易褪色,乳化液中的亞油酸會(huì)自動(dòng)氧化,生成的自由基可以與β-胡蘿卜素反應(yīng),使β-胡蘿卜素顏色衰減,抗氧化劑可以減緩β-胡蘿卜素顏色衰減的速度[32],因此該實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)定抗氧化能力,并確定對(duì)亞油酸和β-胡蘿卜素偶聯(lián)自氧化的抑制作用。如圖7所示,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~20.0 mg/mL時(shí),GE的抑制率為0.98%~75.76%,F(xiàn)GE的抑制率為4.04%~81.19%。與之相比,陽(yáng)性對(duì)照BHT的抑制率為89.54%~99.69%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加,GE和FGE的抑制率均有明顯提升,在同一質(zhì)量濃度下,F(xiàn)GE的抑制率高于GE,且發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明發(fā)酵能夠提高對(duì)亞油酸和β-胡蘿卜素偶聯(lián)自氧化的抑制作用,F(xiàn)GE可作為天然抗氧化劑。
2.4.6 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用
如圖8所示,在0.5~20.0 mg/mL下GE和FGE的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率分別為28.43%~86.59%和47.58%~92.58%。與之相比,陽(yáng)性對(duì)照BHT的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率為83.65%~94.11%。結(jié)果表明,F(xiàn)GE的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率高于GE,在同一質(zhì)量濃度下,F(xiàn)GE脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率比GE更高,且發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05)。這是由于產(chǎn)生的稀有人參皂苷能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性、增加抗氧化酶[33],并且酚類(lèi)化合物能夠與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用,與脂類(lèi)氧化生成的羰基化合物發(fā)生反應(yīng)[34],使FGE具有更強(qiáng)的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力。
圖8 GE及FGE在不同質(zhì)量濃度下脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的對(duì)比Fig.8 Comparison of inhibition of lipid peroxidation by GE and FGE at different concentrations
人參皂苷是人參的主要功能性成分,利用微生物產(chǎn)生的葡萄糖苷酶的去糖基化作用,可將其轉(zhuǎn)化為功能更強(qiáng)的稀有人參皂苷。植物乳桿菌發(fā)酵GE對(duì)pH值、可滴定酸度、總酚、多糖、總黃酮、皂苷含量、人參皂苷成分和抗氧化效果影響顯著。總酚和總黃酮的含量增加,經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn),皂苷組成發(fā)生變化,天然人參皂苷經(jīng)過(guò)水解作用,轉(zhuǎn)化為稀有皂苷和苷元,如Ck、Rk1、Rh4、Rg5等。通過(guò)不同的方法評(píng)估發(fā)酵對(duì)抗氧化活性影響,F(xiàn)GE對(duì)3 種自由基具有明顯的清除作用,均呈劑量依賴(lài)性增加,其中FGE對(duì)亞油酸的自氧化有著更強(qiáng)的抑制作用。本研究證明,發(fā)酵GE能夠產(chǎn)生稀有人參皂苷,能夠提高抗氧化能力的同時(shí)抑制脂質(zhì)氧化。因此,F(xiàn)GE可作為潛在的天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和藥品工業(yè)中。