劉士偉，劉勝楠，米倩雯，陰 裴，薛婷芳，于曉然，孟星堅(jiān)，王麗娜，畢云楓,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

人參為五加科人參屬草本植物，主要分布于亞洲大陸東部的山林地帶，在我國(guó)的東北地區(qū)常見(jiàn)，被譽(yù)為東北三寶之一。人參中富含多種成分，包括人參皂苷[1-2]、多糖、多肽、氨基酸[3]、酚酸、揮發(fā)油、甾醇、炔醇及維生素等[4]，不同人參成分的性質(zhì)及藥理活性也各不相同。人參中天然皂苷Rb1、Rc、Rb2、Re和Rg1占人參皂苷總含量的70%～80%，但這些皂苷極性較大，不利于人體吸收，而人參中的稀有人參皂苷卻具有較高的藥理活性。大量研究表明稀有人參皂苷具有抗疲勞、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、增強(qiáng)免疫力[7]、抗炎[8]、輔助降低血糖、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[9]等作用。人參于2012年被批準(zhǔn)為新資源食品，對(duì)于人參發(fā)酵的研究成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。人參發(fā)酵的主要目的是使人參皂苷通過(guò)微生物酶的作用轉(zhuǎn)化生成某些稀有人參皂苷。微生物轉(zhuǎn)化法因其特異性強(qiáng)、節(jié)約成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛使用于稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化[10]。夏晚霞等[11]篩選出發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷的乳酸菌，并分析發(fā)酵過(guò)程中人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化路徑，證實(shí)發(fā)酵過(guò)程中常見(jiàn)皂苷向稀有皂苷的轉(zhuǎn)化，使得稀有皂苷含量提高。陳旸等[12]探究發(fā)酵對(duì)中間產(chǎn)物人參皂苷Rd的轉(zhuǎn)化作用，結(jié)果表明其轉(zhuǎn)化機(jī)制為Rb1→Rd→Rg3，發(fā)酵后人參皂苷Rd含量顯著提高。與之相比，使用人參粗提取物進(jìn)行發(fā)酵，可以最大程度利用微生物分泌的酶分解消耗掉糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提高人參皂苷純度，同時(shí)得到更多種類(lèi)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，也顯著提高了稀有皂苷轉(zhuǎn)化率。

本實(shí)驗(yàn)以人參提取物（ginseng extract，GE）為研究對(duì)象，采用益生菌植物乳桿菌對(duì)GE進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)稀有人參皂苷成分進(jìn)行定性和定量分析，測(cè)定并分析GE與發(fā)酵后人參提取物（fermented ginseng extract，F(xiàn)GE）中活性成分含量的變化，同時(shí)對(duì)GE與FGE的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干參、黑參購(gòu)于通化市人參交易市場(chǎng)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院教授鑒定均為五加科植物人參；植物乳桿菌B1由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品新資源團(tuán)隊(duì)篩選并鑒定。

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（Rh1、Rg2、Rd、Rk3、Rh4、Rg3、PPT、Ck、Rk1、Rg5、Rh2、PPD）成都曼思特生物科技有限公司；β-胡蘿卜素、亞油酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）賽默飛世爾科技有限公司；苯酚、濃硫酸、冰乙酸 北京化工廠有限責(zé)任公司；過(guò)硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸 成都科隆化學(xué)品有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FLEXARTM型HPLC儀 美國(guó)Perkin Elmer有限公司；DGL-50B型滅菌鍋 中國(guó)力辰科技有限公司；UV-2600I型可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津（中國(guó)）有限公司；GRP-9160型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海深信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TG16高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵制備FGE

將干參以料液比1∶10分別用水和70%乙醇溶液在85 ℃提取2 h，將得到的人參提取液濃縮干燥后得到的粉末即為GE。將實(shí)驗(yàn)室保存的植物乳桿菌B1在37 ℃活化，將一定比例GE與無(wú)菌水加入到已滅菌的發(fā)酵罐中，隨后加入在MRS培養(yǎng)基中活化好的植物乳桿菌使得乳桿菌終濃度為4%，活菌數(shù)達(dá)到3.15×108CFU/mL，37 ℃恒溫發(fā)酵6 d。測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的pH值，使用0.1 mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定，確定可滴定酸度，在發(fā)酵完成后將發(fā)酵液真空冷凍干燥，得到的粉末即為FGE。

1.3.2 HPLC法分析樣品的制備

取適量GE、FGE、黑參粉分別過(guò)60 目篩，然后加入2 倍體積乙酸乙酯渦旋振蕩，充分混勻進(jìn)行萃取，5000 r/min離心5 min后吸取上清液，再次重復(fù)以上操作，將2 次上清液于85 ℃水浴加熱直至蒸干，然后加入等體積的色譜甲醇，充分溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液用于HPLC檢測(cè)。

1.3.3 GE與FGE中活性物質(zhì)含量的測(cè)定

1.3.31 總酚含量的測(cè)定

使用沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，參考白周亞等[13]方法采用福林-酚比色法測(cè)定總酚含量。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，于750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.94729x＋0.01119，R2=0.9993，總酚含量以每克干物質(zhì)中沒(méi)食子酸的質(zhì)量表示。

1.3.32 多糖含量測(cè)定

使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，參考李萬(wàn)從等[14]方法采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=7.95657x-0.00716，R2=0.9993，多糖含量以每克干物質(zhì)中葡萄糖的質(zhì)量表示。

1.3.33 總黃酮含量測(cè)定

使用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，參考Kim等[15]方法采用氯化鋁比色法測(cè)定總黃酮含量。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=2.81714x-0.00745，R2=0.9991，總黃酮含量以每克干物質(zhì)中蘆丁的質(zhì)量表示。

1.3.34 總皂苷含量測(cè)定

使用人參皂苷Re作為標(biāo)準(zhǔn)品，參考杜金鳳等[16]方法采用香草醛-冰醋酸法測(cè)定總皂苷含量。以人參皂苷Re質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，于465 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=2.97523x＋0.01902，R2=0.9995，總皂苷含量以每克干物質(zhì)中皂苷Re的質(zhì)量表示。

1.3.4 人參皂苷成分的鑒定及定量分析

用HPLC對(duì)1.3.2節(jié)中制得樣品液進(jìn)行稀有人參皂苷成分鑒定，HPLC條件參考李秋陽(yáng)等[17]方法，色譜柱：采用PerkinElmer C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸鹽水溶液（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫步驟：0～5 min，18% A，82% B；5～20 min，21% A，79% B；20～22 min，21%～26% A，79%～74% B；22～26min，26%～32% A，74%～68% B；26～46 min，32%～33.8% A，68%～66.2% B；46～51 min，33.8%～38% A，66.2%～62% B；51～57.7min，38%～49% A，62%～51% B；57.7～58 min，49%～49.1% A，51%～50.9% B；58～62 min，49.1% A，50.9% B；62～63 min，49.1%～50.6% A，50.9%～49.4% B；63～68 min，50.6%～59.6% A，49.4%～40.4% B；68～69.8 min，59.6%～65% A，40.4%～35% B；69.8～77 min，65% A，35% B；77～94min，65%～85% A，35%～15% B；94～120 min，18% A，82% B。根據(jù)人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量計(jì)算出樣品中稀有皂苷的含量，按照每克提取物中的稀有皂苷質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

1.3.51 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考Chen Fang等[18]方法對(duì)DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液（0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL），以抗壞血酸（VC）作為陽(yáng)性對(duì)照。于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：A0為1 mL DPPH自由基溶液＋1 mL雙蒸水吸光度；A1為1 mL DPPH自由基溶液＋1 mL樣品吸光度；A2為1 mL無(wú)水乙醇＋1 mL樣品吸光度。

1.3.52 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

參考Cho等[19]方法并稍作修改，配制不同濃度發(fā)酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節(jié)），以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按式（2）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率：

式中：A0為4 mL ABTS陽(yáng)離子自由基乙醇溶液＋1 mL雙蒸水的吸光度；A1為4 mL ABTS陽(yáng)離子自由基乙醇溶液＋1 mL樣品的吸光度；A2為4 mL雙蒸水＋1 mL樣品的吸光度。

1.3.53 羥自由基清除能力測(cè)定

參考Ganguly[20]和趙磊[21]等方法，配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節(jié)），以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式（3）計(jì)算羥自由基清除率：

式中：A0為乙醇-水楊酸溶液＋FeSO4溶液＋H2O2溶液＋雙蒸水的吸光度；A1為乙醇-水楊酸溶液＋FeSO4溶液＋H2O2溶液＋樣品的吸光度；A2為乙醇-水楊酸溶液＋FeSO4溶液＋雙蒸水＋樣品的吸光度。

1.3.54 還原力測(cè)定

參考李青等[22]方法，配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節(jié)），以VC為陽(yáng)性對(duì)照。以蒸餾水代替FeCl3溶液作為空白調(diào)零，以去離子水為參比，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.55β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)

參考Park等[23]方法，配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節(jié)），以2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）為陽(yáng)性對(duì)照，于470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，按式（4）計(jì)算β-胡蘿卜素和亞油酸偶聯(lián)自氧化的抑制率：

式中：A1和分別為加入樣品后0 h和6 h的吸光度；A0和分別為空白對(duì)照組0 h和6 h的吸光度。

1.3.56 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定

參考Jung等[24]采用硫氰酸鐵法評(píng)估抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。配制不同質(zhì)量濃度發(fā)酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節(jié)），以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按式（5）計(jì)算對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率：

式中：A0為第0小時(shí)樣品的吸光度；A1為第72小時(shí)樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中酸度變化

如圖1所示，植物乳桿菌發(fā)酵GE過(guò)程中，pH值由6.61降至3.31，可滴定酸度由0.24%升至2.81%。因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，使產(chǎn)物的pH值降低，可滴定酸度增加[25]。

圖1 植物乳桿菌發(fā)酵GE過(guò)程中pH值與可滴定酸度的變化Fig.1 Changes in pH and titratable acidity in GE during the fermentation process

2.2 發(fā)酵對(duì)GE中活性物質(zhì)含量的影響

如圖2 所示，與G E 相比，F(xiàn) G E 總酚的含量由11.775 mg/g提高到16.400 mg/g，提高了39.28%。這是由于在發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化，影響了酚類(lèi)物質(zhì)的釋放，微生物把復(fù)雜的大分子酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類(lèi)物質(zhì)，使總酚含量增加[26]。這與之前研究[27]，由釀酒酵母發(fā)酵黑參中總酚含量高于生參和黑參的結(jié)果相似。

圖2 發(fā)酵對(duì)GE中總酚、多糖、總黃酮和總皂苷含量影響Fig.2 Effect of fermentation on the contents of total phenols,polysaccharides,total flavonoids and total saponins in GE

多糖的含量從630 mg/g降低到350 mg/g，降低了44.44%。這是由于發(fā)酵的進(jìn)行，微生物不斷生長(zhǎng)，多糖作為微生物進(jìn)行增殖和合成代謝的重要來(lái)源被不斷的消耗。因此多糖含量的降低與微生物的生長(zhǎng)利用有關(guān)。

總黃酮的含量從2.36 mg/g提高到4.18 mg/g，提高了79.01%。根據(jù)微生物的生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)，推測(cè)造成總黃酮含量提升可能是由于發(fā)酵過(guò)程中微生物分泌的酶類(lèi)破壞了植物細(xì)胞壁，從而提高了FGE中總黃酮的含量。

總皂苷的含量從250.1 mg/g降低到156.2 mg/g，降低了37.54%。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，總皂苷含量降低，是由于人參中天然皂苷發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)化成了稀有人參皂苷所連糖基被水解掉，分子質(zhì)量降低所致。

2.3 人參皂苷的轉(zhuǎn)化結(jié)果分析

通過(guò)HPLC法對(duì)樣品的稀有人參皂苷生成情況進(jìn)行對(duì)比分析，圖3為HPLC測(cè)定色譜圖的對(duì)比。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算出樣品中稀有人參皂苷的含量，結(jié)果如表1所示，經(jīng)過(guò)發(fā)酵，人參皂苷含量與種類(lèi)發(fā)生改變。發(fā)酵前，不含有Rk3、Rh4、Rg5等稀有人參皂苷，發(fā)酵后，生成了上述稀有人參皂苷，且與黑參中稀有皂苷含量對(duì)比，發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵生成稀有人參皂苷的含量高于黑參。夏晚霞等[11]和趙彩秀[28]根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)，二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化路徑為Rb1/Rb2→Rd→Rg3→Rh2、Rb1/Rc→Rd→Rg1、Rb1→Rd→Rg3→Ck、Rg3→Rg5＋Rk1。參考劉偉等[29]三醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化機(jī)理圖，結(jié)合表1稀有皂苷含量結(jié)果，可以推測(cè)出人參皂苷的轉(zhuǎn)化路徑，二醇型人參皂苷為Rb1、Rb2、Rc→Rd→Rg3→Rg5＋Ck＋Rh2＋Rk1→PPD（圖4A），三醇型人參皂苷為Rg1、Re→Rh1＋Rg2→Rh4＋Rk3→PPT（圖4B）。

表1 發(fā)酵前后稀有人參皂苷含量對(duì)比Table 1 Comparison of rare ginsenoside contents before and after fermentation mg/g

圖3 HPLC色譜圖對(duì)比結(jié)果Fig.3 Comparison results of HPLC chromatograms

圖4 二醇型人參皂苷（A）和三醇型人參皂苷（B）轉(zhuǎn)化路徑Fig.4 Transformation pathways of diol ginsenosides (A) and triol ginsenosides (B)

GE中主要二醇型人參皂苷為Rb1、Rc、Rb2，經(jīng)發(fā)酵生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為稀有人參皂苷Rg3、Ck、Rk1、Rg5和Rh2，這幾種稀有人參皂苷的含量分別增加了1.8075、0.7706、0.7348、1.3648 mg/g和1.4796 mg/g。GE中主要三醇型人參皂苷為Rg1和Re，經(jīng)發(fā)酵生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為稀有人參皂苷Rh1、Rg2、Rk3和Rh4，這幾種稀有人參皂苷的含量分別增加了2.0996、0.8271、0.9493 mg/g和3.3924 mg/g。菌體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶能夠?qū)E中人參二醇型皂苷的C3和C20位、三醇型皂苷的C6和C20位的糖基結(jié)構(gòu)進(jìn)行水解，使天然人參皂苷失去糖基，轉(zhuǎn)化為稀有皂苷和苷元。

2.4 GE與FGE的抗氧化活性分析

2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基清除活性測(cè)定原理為紫色DPPH自由基被抗氧化劑還原為淡黃色聯(lián)氨[30]。如圖5A所示，GE和FGE都對(duì)DPPH自由基有清除能力。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～20.0 mg/mL時(shí)，GE對(duì)DPPH自由基的清除率為3.43%～65.18%，F(xiàn)GE為14.64%～86.18%。與之相比，陽(yáng)性對(duì)照VC的DPPH自由基清除率為83.15%～95.53%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加，GE和FGE的DPPH自由基清除率均有明顯提升，在同一質(zhì)量濃度下，F(xiàn)GE的DPPH自由基清除率比GE更高，且發(fā)酵前后差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明發(fā)酵能夠提升對(duì)DPPH自由基的清除能力。

圖5 GE及FGE在不同質(zhì)量濃度下3 種自由基清除活性Fig.5 Three free radical scavenging activities of GE and FGE at different concentrations

2.4.2 對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力

如圖5B所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～20.0 mg/mL時(shí)，GE對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力為1.73%～64.75%，F(xiàn)GE為4.43%～81.24%。與之相比，陽(yáng)性對(duì)照VC的ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率為99.05%～99.35%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加，GE和FGE的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均有明顯提升，在同一質(zhì)量濃度下，F(xiàn)GE的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率比GE更高，且發(fā)酵前后差異顯著（P＜0.05）。

2.4.3 對(duì)羥自由基的清除能力

如圖5C所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～20.0 mg/mL時(shí)，GE對(duì)羥自由基的清除能力為22.29%～68.14%，F(xiàn)GE為35.17%～82.29%。與之相比，陽(yáng)性對(duì)照VC的羥自由基清除率為97.35%～99.37%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加，GE和FGE的羥自由基清除率均有明顯提升，在同一質(zhì)量濃度下，F(xiàn)GE的羥自由基清除率比GE更高，且發(fā)酵前后差異顯著（P＜0.05）。

由于發(fā)酵提高了黃酮和酚類(lèi)活性物質(zhì)的含量，并將天然人參皂苷轉(zhuǎn)化成了大量具有高抗氧化性的稀有人參皂苷。樣品中稀有皂苷的含量越高，清除自由基能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)，這也是FGE清除3 種自由基能力高于GE的原因，但同時(shí)多糖含量、分子質(zhì)量下降也會(huì)影響自由基清除效果。

2.4.4 總還原能力測(cè)定

總還原能力的測(cè)定原理是將鐵氰化鉀的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵，二價(jià)鐵進(jìn)一步和三氯化鐵反應(yīng)生成在700 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰的普魯士藍(lán)，吸光度越高則表示樣品的還原能力越強(qiáng)[31]。如圖6所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～20.0 mg/mL時(shí)GE吸光度為0.0741～0.6411，F(xiàn)GE為0.0821～0.9244。與之相比，陽(yáng)性對(duì)照VC的吸光度為2.0145～4.2041。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加，GE和FGE的還原能力均有明顯提升，在同一質(zhì)量濃度下，F(xiàn)GE的吸光度高于GE，且發(fā)酵前后差異顯著（P＜0.05）。這是由于在發(fā)酵過(guò)程中形成了能夠與自由基反應(yīng)穩(wěn)定的還原劑，提高了還原能力。

2.4.5 對(duì)β-胡蘿卜素與亞油酸偶聯(lián)自氧化的抑制作用

β-胡蘿卜素是一種多烯橘黃色素，被氧化時(shí)易褪色，乳化液中的亞油酸會(huì)自動(dòng)氧化，生成的自由基可以與β-胡蘿卜素反應(yīng)，使β-胡蘿卜素顏色衰減，抗氧化劑可以減緩β-胡蘿卜素顏色衰減的速度[32]，因此該實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)定抗氧化能力，并確定對(duì)亞油酸和β-胡蘿卜素偶聯(lián)自氧化的抑制作用。如圖7所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～20.0 mg/mL時(shí)，GE的抑制率為0.98%～75.76%，F(xiàn)GE的抑制率為4.04%～81.19%。與之相比，陽(yáng)性對(duì)照BHT的抑制率為89.54%～99.69%。隨著GE和FGE質(zhì)量濃度的增加，GE和FGE的抑制率均有明顯提升，在同一質(zhì)量濃度下，F(xiàn)GE的抑制率高于GE，且發(fā)酵前后差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明發(fā)酵能夠提高對(duì)亞油酸和β-胡蘿卜素偶聯(lián)自氧化的抑制作用，F(xiàn)GE可作為天然抗氧化劑。

2.4.6 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

如圖8所示，在0.5～20.0 mg/mL下GE和FGE的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率分別為28.43%～86.59%和47.58%～92.58%。與之相比，陽(yáng)性對(duì)照BHT的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率為83.65%～94.11%。結(jié)果表明，F(xiàn)GE的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率高于GE，在同一質(zhì)量濃度下，F(xiàn)GE脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率比GE更高，且發(fā)酵前后差異顯著（P＜0.05）。這是由于產(chǎn)生的稀有人參皂苷能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性、增加抗氧化酶[33]，并且酚類(lèi)化合物能夠與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，與脂類(lèi)氧化生成的羰基化合物發(fā)生反應(yīng)[34]，使FGE具有更強(qiáng)的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力。

圖8 GE及FGE在不同質(zhì)量濃度下脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的對(duì)比Fig.8 Comparison of inhibition of lipid peroxidation by GE and FGE at different concentrations

3 結(jié)論

人參皂苷是人參的主要功能性成分，利用微生物產(chǎn)生的葡萄糖苷酶的去糖基化作用，可將其轉(zhuǎn)化為功能更強(qiáng)的稀有人參皂苷。植物乳桿菌發(fā)酵GE對(duì)pH值、可滴定酸度、總酚、多糖、總黃酮、皂苷含量、人參皂苷成分和抗氧化效果影響顯著。總酚和總黃酮的含量增加，經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，皂苷組成發(fā)生變化，天然人參皂苷經(jīng)過(guò)水解作用，轉(zhuǎn)化為稀有皂苷和苷元，如Ck、Rk1、Rh4、Rg5等。通過(guò)不同的方法評(píng)估發(fā)酵對(duì)抗氧化活性影響，F(xiàn)GE對(duì)3 種自由基具有明顯的清除作用，均呈劑量依賴(lài)性增加，其中FGE對(duì)亞油酸的自氧化有著更強(qiáng)的抑制作用。本研究證明，發(fā)酵GE能夠產(chǎn)生稀有人參皂苷，能夠提高抗氧化能力的同時(shí)抑制脂質(zhì)氧化。因此，F(xiàn)GE可作為潛在的天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和藥品工業(yè)中。