賴燈妮，朱向榮，李 濤，張 群，彭清輝

（1.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙），湖南 長(zhǎng)沙 410002；3.湖南省生產(chǎn)力促進(jìn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

馬鈴薯是全球重要的糧食作物，其中，紫色馬鈴薯除具備普通馬鈴薯的所有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還富含重要的功能活性成分——多酚及花色苷[1]。多酚、花色苷等活性成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、預(yù)防心血管疾病和調(diào)節(jié)血糖等功能[2-7]。馬鈴薯通常采用煮、蒸、微波、烘焙等熱處理方式烹飪、加工。熱加工會(huì)影響紫色馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)素及活性成分[8]。研究認(rèn)為，熱加工過(guò)程中，馬鈴薯組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，原本結(jié)合在組織上的生物活性物質(zhì)得到釋放[9]；同時(shí)，還會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（如美拉德反應(yīng)等）產(chǎn)生新的物質(zhì)。熱加工引起的活性物質(zhì)變化必然對(duì)紫色馬鈴薯的活性功能如抗氧化造成影響[10-11]；但目前，熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯活性功能影響方面的相關(guān)研究報(bào)道還較少。

根據(jù)自由基理論，抗氧化活性是大多數(shù)食物健康成分發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)，所以，有關(guān)評(píng)價(jià)健康食品抗氧化活性的研究非常多。目前，評(píng)估食物活性成分抗氧化能力的方法有化學(xué)法和生物法兩大類；其中化學(xué)法包括1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、Fe3＋還原法等；生物法主要是檢測(cè)相關(guān)的抗氧化蛋白及其通路。核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是調(diào)控細(xì)胞抵抗氧化損傷、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2的缺失或激活障礙均可增強(qiáng)氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的毒性，引起細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡；從而與許多疾病密切相關(guān)[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)研究微波、熱風(fēng)、水煮3 種熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)成分、總酚、花色苷等含量的影響，采用DPPH、ABTS、Fe3＋還原法等分析了熱處理對(duì)紫色馬鈴薯花色苷提取物抗氧化活性的影響；并以未處理組為對(duì)照，研究微波處理組的花色苷提取物對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞中Nrf2和血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）蛋白表達(dá)水平的影響，以期為紫色馬鈴薯的熱加工提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠胰島β細(xì)胞株（RIN-m5F）購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)CRL-11605（CB34806782）；紫色馬鈴薯（黑金剛、黑美人）希森薯業(yè)有限公司；乙醇、檸檬酸、乙酸乙酯、甲醇、DPPH、過(guò)硫酸鉀、醋酸鈉、氯化鐵、丙烯酰胺（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；核質(zhì)分離試劑盒 賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WP-UP-WF-20超純水制備機(jī) 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒精密儀器上海有限公司；DNM-9602酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；K9840凱氏定氮儀、SH220M消化爐 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Image Quant LAS 4000 mini凝膠成像儀 美國(guó)Cytiva公司。

1.3 方法

1.3.1 紫色馬鈴薯的熱處理方法

將新鮮的馬鈴薯去皮，清洗干凈，切成6 mm×6 mm的扇形小塊（厚度4 mm）。采用不同的加熱方式處理紫色馬鈴薯，具體操作如下：①新鮮：切好的紫色馬鈴薯；②微波：將切好的紫色馬鈴薯放入寬口培養(yǎng)皿中，用封口膜封口，加工條件為25 W/g、3.5 min；③熱風(fēng)：將切好的紫色馬鈴薯放入熱風(fēng)干燥箱，60 ℃、2 h；④水煮：將切好的紫色馬鈴薯放入燒杯中，加水沒(méi)過(guò)材料，封口膜封口，加工條件：100 ℃、15 min。

所有待測(cè)樣品都制備成冷凍干燥樣品，用粉碎機(jī)磨成粉末，過(guò)80 目篩，分別標(biāo)記后放置于-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 花色苷提取分離純化

參照方芳等[14]的方法并稍作調(diào)整。稱取適量的紫色馬鈴薯粉末，用75%的乙醇溶液（含2%檸檬酸）為提取溶劑，采用料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間10 min、提取溫度45 ℃、超聲波功率300 W。采用真空抽取，將濾液置于55 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到花色苷的粗提濃縮液。向濃縮液中加入乙酸乙酯，進(jìn)行萃取數(shù)次，棄黃色液，下層液再進(jìn)一步進(jìn)行濃縮直至黏稠。最后采用D101大孔樹(shù)脂對(duì)所得濃縮液進(jìn)行純化，洗去雜質(zhì)，用乙醇溶液洗脫花色苷。所得花色苷再進(jìn)一步濃縮，冷凍干燥，放置于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 紫色馬鈴薯中主要營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

干物質(zhì)、水分：根據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》直接干燥法進(jìn)行測(cè)定；灰分：根據(jù)GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)：根據(jù)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定；脂肪：根據(jù)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定；淀粉：根據(jù)GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測(cè)定》酶水解法進(jìn)行測(cè)定；VC：根據(jù)GB 5009.86—2016《食品中抗壞血酸的測(cè)定》高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定；碳水化合物：根據(jù)GB/Z 21922—2008《食品中營(yíng)養(yǎng)成分基本術(shù)語(yǔ)》中的減法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 紫色馬鈴薯中抗氧化成分含量的測(cè)定

總酚：采用福林-酚法，參照Deuβer等[15]的方法略作修改。準(zhǔn)確稱取綠原酸，溶于蒸餾水中，5、10、15、20、25 mg/L配取綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取花色苷粗提液1.0 mL，加入至2.0 mL蒸餾水搖勻，再加0.5 mL 1 mol/L福林-酚溶液，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5min，后加入1.0 m L 15% Na2CO3溶液，均質(zhì)5 min并用蒸餾水定容至10 mL，避光反應(yīng)45 min，測(cè)定765 nm波長(zhǎng)處吸光度，蒸餾水作對(duì)照。

花色苷：采用pH值差示法，取0.5 mL花色苷提取液加入到試管中，加入2.5 mL 0.025 mol/L氯化鉀（pH 1.0）溶液和0.4 mol/L醋酸鈉（pH 4.5）溶液，反應(yīng)15 min，在520/700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。花色苷含量計(jì)算公式如下：

式中：C為花色苷含量/（g/k g）；A為吸光度（（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5）；mw為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量（449.1085）；DF為稀釋因子；V為最終體積/mL；ε為摩爾吸光系數(shù)（26900 L/（mol·cm））；W為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 化學(xué)法分析紫色馬鈴薯花色苷提取物的抗氧化活性

DPPH自由基清除率測(cè)定：參照王全逸[16]的方法并稍作調(diào)整，將40 μg/mL DPPH自由基溶液、0.05 mmol/L VC依次移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于容量瓶中，用蒸餾水定容至5.0 mL，再加入5.0 mL DPPH自由基溶液，充分混勻。對(duì)照組：5.0 mL蒸餾水加5.0 mL DPPH自由基溶液；空白組：5.0 mL蒸餾水加5.0 mL甲醇。樣品組：取5.0 mL 26 μg/mL花色苷-甲醇溶液，再加入5.0 mL DPPH自由基溶液。室溫下避光反應(yīng)30 min，取5.0 mL樣品于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

ABTS陽(yáng)離子自由基抑制率測(cè)定：參照Liang Linghong等[17]的方法并稍作調(diào)整配制ABTS陽(yáng)離子自由基溶液稍作修改。將7 mmol/L ABTS陽(yáng)離子溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液10 mL，室溫下避光反應(yīng)12～16 h配制成ABTS陽(yáng)離子自由基母液，依次取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL濃度為0.1 mmol/L的VC溶液于容量瓶，且用蒸餾水補(bǔ)足至2.5 mL；26 μg/mL花色苷-甲醇溶液后取2.5 mL，然后分別加入5.0 mL ABTS陽(yáng)離子自由基溶液避光反應(yīng)10 min后，樣品稀釋5 倍后取1.0 mL于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照組為2.5 mL蒸餾水加5.0 mL ABTS陽(yáng)離子自由基溶液，空白組為蒸餾水。

Fe3＋還原能力測(cè)定：參照Fawole等[18]的方法并稍作調(diào)整。FRAP工作液由25 mL 300 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 3.6）、2.5 mL 10.0 mmol/L TPTZ溶液與2.5 mL 20.0 mmol/L FeCl3·6H2O溶液組成。依次取0.1 mmol/L的VC 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于容量瓶，定容至2.0 mL，26 μg/mL花色苷-甲醇溶液后取2.0 mL，分別加入5.0 mL反應(yīng)試劑，混勻后5 min即可于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以2.0 mL蒸餾水加5.0 mL反應(yīng)試劑作對(duì)照組，以蒸餾水作空白組，樣品取2.0 mL測(cè)定。

1.3.6 生物學(xué)方法分析紫色馬鈴薯花色苷提取物抗氧化活性

RIN-m5F細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、100%飽和濕度、5% CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。將1×106cell/mL密度的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁單層生長(zhǎng)后，加入花色苷提取物于培養(yǎng)液中誘導(dǎo)8 h；氧化應(yīng)激狀態(tài)條件為花色苷提取物預(yù)處理2 h，隨后加入1 μL H2O2誘導(dǎo)30 min。待細(xì)胞處理結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗兩遍。每孔加入300 μL RIPA裂解液。充分混勻后移至新離心管中，冰上孵育20～30 min。14000×g離心10 min，將上清液移至新離心管中，置100 ℃金屬浴10 min，隨后加入6×Loading Buffer，充分振蕩混勻，再次100 ℃金屬浴10 min，獲得細(xì)胞裂解液，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Thermo Scientific核質(zhì)分離試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；細(xì)胞裂解液加入200 μL CERI，充分混勻，冰浴10 min；再加入200 μL CERII，振蕩5 s使之充分混勻，冰浴1 min；4 ℃、18000×g離心5 min，將上清移至新離心管中。上清液即為胞質(zhì)蛋白，沉淀用于提取胞核蛋白。根據(jù)Thermo Scientific核質(zhì)分離試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，上述沉淀中加入400 μL NER，振蕩5 s，冰育10 min，繼續(xù)振蕩15 s，以上條件重復(fù)4 次；4 ℃、18000×g離心10 min；將上清液移取至新離心管中即為胞核蛋白。

蛋白印跡檢測(cè)：根據(jù)不同蛋白分子質(zhì)量的大小選擇不同濃度的分離膠，其中LC3的檢測(cè)選擇15%的分離膠，而其他核因子Nrf2、HO-1、核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）、內(nèi)參蛋白GAPDH、泛素化蛋白質(zhì)聚集體SQSTM1/p62、半胱天冬酶-3（Caspase 3）、腺苷酸激活蛋白激酶、磷酸腺苷酸激活蛋白激酶選擇10%～12%的分離膠。將配制好的膠裝入電泳槽中，根據(jù)不同蛋白分子質(zhì)量選擇合適的電壓大小和電泳的時(shí)間。一般加入5～20 μL待測(cè)蛋白至各泳道。電壓穩(wěn)定在50～80 V，電泳1～2.5 h，轉(zhuǎn)膜，封閉后，用1∶1000的比例稀釋一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，去除一抗，用抗體洗脫液將膜清洗3 次，每次5～10 min。用1∶5000的比例稀釋二抗，搖床下孵育1 h，吸去二抗，PBS將膜清洗3 次，每次10 min。加入化學(xué)發(fā)光顯色液后，通過(guò)Image Quant LAS 4000 mini凝膠成像儀顯影，拍照、保存。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Image J分析軟件對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析，再用Duncan法進(jìn)行多重比較，P＜0.05，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01，差異極顯著。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響

如表1所示，與新鮮（新鮮代表未處理，下同）樣品相比，微波、熱風(fēng)、水煮3 種熱加工方法處理后的紫色馬鈴薯中VC、灰分以及淀粉含量下降，其中VC呈顯著下降，熱風(fēng)最為明顯，黑金剛從120.41 mg/100 g下降到55.05 mg/100 g，黑美人從103.17 mg/100 g下降到30.44 mg/100 g；其次是水煮，黑金剛從120.41 mg/100 g下降到67.80 mg/100 g，黑美人從103.17 mg/100 g下降到62.15 mg/100 g，而微波對(duì)其影響最小。熱處理后的紫色馬鈴薯灰分與對(duì)照組比較有下降，但差異不顯著。微波處理后黑金剛和黑美人的蛋白質(zhì)含量顯著上升，分別增加了3.29%和3.21%；而熱風(fēng)和水煮后的黑金剛蛋白質(zhì)含量呈顯著下降，分別下降了2.20%和1.97%；相較之下，黑美人的蛋白質(zhì)含量下降趨勢(shì)較慢，分別下降了1.91%和1.41%。紫色馬鈴薯中脂肪含量很低，經(jīng)熱加工后，變化不明顯。

表1 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 1 Effects of heat treatment methods on nutrient contents of purple-fleshed potato

2.2 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯中總酚的影響

馬鈴薯中主要酚類物質(zhì)是綠原酸，其次是咖啡酸、香草酸、沒(méi)食子酸、香豆酸及黃酮等[16]。如圖1所示，新鮮（未熱處理）黑美人和黑金剛中總酚（以綠原酸計(jì)）含量分別為1025.50 mg/100 g和2209.14 mg/100 g，經(jīng)熱處理后，兩種紫色馬鈴薯中總酚含量下降，其中微波對(duì)總酚的影響最小，水煮后的總酚含量下降最為顯著。與新鮮比較，微波處理后黑金剛總酚含量?jī)H下降9.36%，而黑美人僅下降4.40%；水煮后黑金剛總酚含量下降25.73%，而黑美人下降31.42%。

2.3 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯中花色苷含量的影響

由圖2可見(jiàn)，黑金剛的花色苷含量整體高于黑美人，黑美人的花色苷在烹飪過(guò)程中變化不顯著，黑金剛經(jīng)水煮和微波處理后其花色苷含量增加，分別為98.52、93.51 mg/100 g，其中與新鮮的紫色馬鈴薯花色苷組相比分別上升了22.92%、16.67%。由于黑金剛在多酚以及花色苷的含量都顯著高于黑美人品種，所以選定黑金剛作為后續(xù)的研究對(duì)象。

圖2 烹飪方式對(duì)紫色馬鈴薯花色苷的影響Fig.2 Effects of cooking methods on anthocyanin content of purplefleshed potato

2.4 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯花色苷提取物抗氧化作用的影響

2.4.1 化學(xué)法分析熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯花色苷提取物抗氧化活性的影響

由表2可見(jiàn)，熱風(fēng)、水煮明顯降低了花色苷提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力；但微波處理對(duì)花色苷提取物DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的影響較小，且明顯提高了Fe3＋還原能力。因此，選擇新鮮紫色馬鈴薯和微波處理方式作為后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

表2 烹飪方式對(duì)紫色馬鈴薯花色苷抗氧化能力的影響Table 2 Effects of cooking methods on antioxidant capacity of anthocyanins in purple-fleshed potato

2.4.2 紫色馬鈴薯花色苷提取物對(duì)抗氧化蛋白表達(dá)的影響

新鮮和微波處理紫色馬鈴薯的花色苷提取物（0.1、1 mg/mL）誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞（RIN-m5F）的結(jié)果（圖3）表明，花色苷提取物增強(qiáng)了抗氧化蛋白Nrf2及HO-1的表達(dá)，且呈劑量依賴性上升；微波加工馬鈴薯的花色苷提取物組的抗氧化蛋白Nrf2及HO-1表達(dá)水平高于新鮮樣品組，說(shuō)明微波處理紫色馬鈴薯的花色苷提取物在RIN-m5F細(xì)胞抗氧化能力較強(qiáng)。

圖3 紫色馬鈴薯花色苷提取物對(duì)抗氧化蛋白表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of anthocyanins from purple-fleshed potato on the expression levels of antioxidant proteins

2.4.3 紫色馬鈴薯的花色苷提取物在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)Nrf2和NF-κB的影響

如圖4所示，通過(guò)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，發(fā)現(xiàn)RIN-m5F細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)水平增加，而加入1 mg/mL的MA降低了RIN-m5F細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)水平。

圖4 紫色馬鈴薯的花色苷提取物在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)Nrf2和NF-κB蛋白的影響Fig.4 Effects of anthocyanins from purple-fleshed potato on the expression levels of Nrf2 and NF-κB proteins in cells under oxidative stress

2.4.4 紫色馬鈴薯的花色苷提取物對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)錄的影響

紫色馬鈴薯的花色苷提取物對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞核中Nrf2轉(zhuǎn)錄的影響見(jiàn)圖5。通過(guò)核質(zhì)分離技術(shù)，使得RIN-m5F細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的蛋白分離。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，MA能顯著增強(qiáng)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2抗氧化蛋白表達(dá)，而對(duì)細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2蛋白表達(dá)基本無(wú)差異。說(shuō)明在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，MA使得Nrf2的Neh2片段不能與Keap1偶聯(lián)，因此Nrf2不能泛素化降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中Nrf2大量積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，啟動(dòng)II相脫毒酶和抗氧化蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。

圖5 紫色馬鈴薯的花色苷提取物對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)錄的影響Fig.5 Effects of anthocyanins from purple-fleshed potato on Nrf2 nuclear translocation

3 討論

3.1 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響

相對(duì)微波和熱風(fēng)處理，水煮處理對(duì)紫色馬鈴薯中VC的影響最大，可能是由于VC為水溶性維生素，并具有熱敏感性；因此，熱處理和水處理極易造成VC的流失，這與Murniece[19]和Han[20]等研究結(jié)果一致。紫色馬鈴薯總淀粉含量較高，經(jīng)熱處理后，總淀粉有不同程度的損失，其中以水煮損失較多，這可能是水煮使得馬鈴薯細(xì)胞組織受到影響，從而導(dǎo)致其淀粉流失。微波處理后紫色馬鈴薯的蛋白質(zhì)含量顯著上升，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似，Murniece等[19]也發(fā)現(xiàn)烹飪處理后馬鈴薯中的蛋白質(zhì)都有所增加，F(xiàn)inglas等[21]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵和烘烤后馬鈴薯蛋白質(zhì)分別增加至2.2%和2.8%。該現(xiàn)象的原因可能是在熱加工條件下，水分蒸發(fā)后干物質(zhì)含量都有所增加，從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)含量的增加。

3.2 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯總酚含量的影響

采用3 種熱加工方式均使紫色馬鈴薯總酚含量明顯降低，與Lemos等[22]研究結(jié)果相似，因?yàn)樗苄苑宇愇镔|(zhì)容易隨水流失且遇熱分解。此外，熱處理過(guò)程中，酚類化合物發(fā)生了美拉德等反應(yīng)也導(dǎo)致其含量減少。因此，較低溫度、較短時(shí)間的熱加工方式是保留酚類化合物較好的方法。

3.3 熱加工方式對(duì)紫色馬鈴薯花色苷含量的影響

花色苷含量在微波和水煮處理中上升，在熱風(fēng)處理中下降。本研究結(jié)果與Lemos等[22]的研究報(bào)道基本一致?；ㄉ諛O易發(fā)生酶促降解，而熱處理抑制了酶活性，使得馬鈴薯中的花色苷得到保留。其次，有些熱處理方式改變了馬鈴薯的微觀結(jié)構(gòu)，使花色苷更易于提取。黑金剛熱風(fēng)處理組中花色苷下降了46.87%，其原因可能是花色苷長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫空氣中被分解。

3.4 熱加工方式對(duì)花色苷提取物抗氧化作用的影響

3.4.1 熱加工方式對(duì)花色苷提取物化學(xué)抗氧化作用及其抗氧化蛋白表達(dá)的影響

Bontempo等[23]研究認(rèn)為，紫色馬鈴薯花色苷提取物的抗氧化活性主要以Fe3＋還原能力為主，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微波處理黑金剛紫色馬鈴薯的花色苷提取物與新鮮紫色馬鈴薯的花色苷提取物比較，提高了Fe3＋的還原能力，其可能主要存在兩個(gè)方面的原因：微波的熱處理使得紫色馬鈴薯花色苷種類發(fā)生變化，不同花色苷抗氧化能力與它所含羥基的數(shù)目和位置相關(guān)，因此不同的花色苷抗氧化能力不一樣[24]；其次，由于花色苷的熱不穩(wěn)定性，可能使得紫色馬鈴薯花色苷的糖苷配基丟失，形成花青素單體，而花青素單體的抗氧化活性一般強(qiáng)于花色苷。

3.4.2 花色苷提取物在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)Nrf2和NF-κB的影響

目前研究發(fā)現(xiàn)紫色馬鈴薯中花色苷提取物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，通過(guò)激活Nrf2途徑從而上調(diào)HO-1、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和NAD(P)H表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似[25]。

在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中Nrf2的Neh2片段上的ETGE和DLG位點(diǎn)與Keap1結(jié)合。Keap1和Cul-Rbx-E3泛素連接酶偶聯(lián)Neh2賴氨酸殘基從而使Nrf2被泛素化標(biāo)記，最后被引導(dǎo)進(jìn)入蛋白酶體進(jìn)行降解。因此，正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白含量較低[26]。在氧化應(yīng)激和親電反應(yīng)中，Keap1中半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)改變，從而不能與Neh2偶聯(lián)，因此不能泛素化降解掉Nrf2。這樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中Nrf2大量積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，然后在分子伴侶Maf的協(xié)助下與ARE結(jié)合形成二聚體，啟動(dòng)II相脫毒酶和抗氧化蛋白相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白的合成，從而提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力[27]。同時(shí)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，MAPK、NF-κB、AP-1等信號(hào)通路被激活，使得下游炎癥COX-2、iNOS等蛋白以及部分炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)增加[28]。

已有研究報(bào)道矢車菊素、飛燕草色素、錦葵色素不僅可以激活Nrf2作用于ARE，誘導(dǎo)II相抗氧化蛋白谷胱甘肽還原酶、醌氧化還原酶等的表達(dá)，從而Caspase-3的活性，而且能抑制LPS，IFN-γ誘導(dǎo)的NF-κB的活化[29]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，1 mg/mL微波處理紫色馬鈴薯的花色苷提取物與對(duì)照組相比增強(qiáng)了RIN-m5F細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)水平。這說(shuō)明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下紫色馬鈴薯花色苷提取物通過(guò)提高大鼠胰島β細(xì)胞抗氧化能力，從而降低炎癥蛋白的表達(dá)水平。

4 結(jié)論

熱處理后紫色馬鈴薯中VC、灰分以及淀粉含量下降；從VC來(lái)看，所有的處理方式均使含量顯著下降，熱風(fēng)處理中黑金剛減少了65.36 mg/100 g，黑美人減少了72.73 mg/100 g，變化最為明顯，微波對(duì)其影響最??；微波處理后蛋白質(zhì)含量顯著上升，黑金剛和黑美人的蛋白質(zhì)含量分別增加了3.29%和3.21%，而熱風(fēng)（60 ℃、2 h）和水煮（100 ℃、15 min）使黑金剛馬鈴薯的蛋白質(zhì)含量顯著下降。

熱處理后紫色馬鈴薯的總酚（以綠原酸計(jì)）含量顯著下降，其中微波處理對(duì)紫色馬鈴薯的總酚含量影響最小，黑金剛和黑美人下降率分別為9.36%和4.40%，水煮方式中總酚含量下降最為顯著，分別達(dá)到了25.73%和31.42%。

研究結(jié)果表明，微波處理能明顯提高紫色馬鈴薯花色苷提取物的還原能力，經(jīng)微波處理的紫色馬鈴薯的花色苷提取物可明顯提高大鼠胰島β細(xì)胞中對(duì)抗氧化蛋白Nrf2和HO-1的表達(dá)水平，并降低NF-B炎癥蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述，微波（25 W/g、3.5 min）是紫色馬鈴薯最佳的熱處理方法。