楊金梅，李云嵌，何霞紅，王振興,*

（1.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

三七（Panax notoginseng）為我國傳統(tǒng)名貴植物，為五加科（Araliaceae）人參屬，主要分布于我國云南文山、廣西、廣東、福建等地[1]。三七的葉、果以及根莖均可藥用，其味甘、微苦，性溫，現(xiàn)代藥理研究表明，三七具有鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝利膽、抗心律失常、抗血栓等作用[2]。三七葉是云南當(dāng)?shù)靥厣称罚哂信c根部相似的藥用價(jià)值。研究表明三七葉富含皂苷、總黃酮、多酚、多糖等活性成分[3]，具有活血化瘀、止痛消炎、促進(jìn)消化等多種功能活性[4-6]。但是目前對于三七葉的開發(fā)利用較少，只有三七葉茶、粉等產(chǎn)品，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，因此迫切需要加大對三七葉的開發(fā)利用。

利用食用真菌或細(xì)菌發(fā)酵是對植物基食品進(jìn)行增效加工的有效手段之一，在發(fā)酵過程中，微生物發(fā)酵可作用于植物中多糖、蛋白質(zhì)等成分[7]，促進(jìn)有效成分的釋放，同時(shí)將難于吸收的大分子代謝成小分子[8]，增加植物有效成分的含量[9]，或者可將低活性有效成分轉(zhuǎn)化為高活性有效成分，具有無污染、酶活性高、轉(zhuǎn)化率高、成本低、周期短、可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)[10]。目前已有利用食用微生物進(jìn)行發(fā)酵三七葉的相關(guān)研究，如張媛媛等[11]通過凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵三七葉茶，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可以提高三七葉的總皂苷含量，提高其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力。陳紅惠等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后的三七葉茶具有較好的抗氧化能力。Yang Min等[13]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和枯草芽孢桿菌共發(fā)酵三七葉后，其皂苷、酚酸、黃酮類化合物等活性物質(zhì)含量顯著增加，并表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。此外，益生菌發(fā)酵對三七葉中主要活性成分皂苷具有一定的轉(zhuǎn)化作用，如Li Fei等[14]利用真菌Cordyceps sinensis和Ascomycotasp.將常見人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3和CK。Liu Chunying等[15]發(fā)現(xiàn)黑曲霉能將原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷CK。相對細(xì)菌而言，真菌對皂苷的轉(zhuǎn)化時(shí)間更短，轉(zhuǎn)化率更高，其產(chǎn)物中功能性較強(qiáng)的人參皂苷Rg3、Rg2和CK含量更高[16]。但這些研究主要是利用單一菌株或者復(fù)合菌株對三七葉進(jìn)行發(fā)酵，有必要針對不同菌株對三七葉的發(fā)酵性能進(jìn)行比較，從而篩選出適合三七葉發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)菌株。

米根霉（Rhizopusoryzae）、粗糙脈孢菌（Neurosporo crassa）、紅曲霉（Monascus）和魯氏毛霉（Mucor rouxianus）是食品領(lǐng)域常用的4 種真菌，其中米根霉具有發(fā)達(dá)的淀粉和蛋白酶系，是藥和酒曲中的優(yōu)勢菌種，在我國傳統(tǒng)發(fā)酵中十分重要[17]；粗糙脈孢菌高產(chǎn)纖維素酶、漆酶和多種消化酶，適合于發(fā)酵含纖維素較高的木本植物[18]；紅曲霉在我國已有1000多年的食品發(fā)酵歷史，其能利用多種糖類和酸類、有機(jī)氮等，生成多種蛋白酶、淀粉酶等初級代謝產(chǎn)物和紅曲色素、抗菌素等次生代謝產(chǎn)物[19]；魯氏毛霉是一種接合菌綱真菌，主要用于食品發(fā)酵，其分解纖維素的能力較強(qiáng)[20]。考慮到三七葉含有豐富的多糖、蛋白、纖維等成分[21]，本研究選用上述4 種真菌對三七葉進(jìn)行發(fā)酵，研究其化學(xué)成分和功能活性的變化，篩選出對三七葉功能活性增效最明顯的菌株，并分析其發(fā)酵過程中的代謝物變化，以探討其發(fā)酵機(jī)制。旨在為三七葉發(fā)酵食品的菌株選擇提供參考，并為三七葉的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七葉，2021年11月采收于云南省昆明市尋甸縣羊街鎮(zhèn)豐樂林下三七種植基地，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)植物學(xué)教研室戚建華副教授鑒定為三七的葉子，真空冷凍干燥，粉碎并過40目篩，-20 ℃保存。葉片橢圓形或倒卵形，長約5～9 cm，寬約2～5 cm。粗糙脈孢菌經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)酵豆腐渣中分離純化所得；米根霉（CICC 3037）、紅曲霉（CDMCC 3.438）、魯氏毛霉（CICC 40933）購自廣東省微生物菌種保藏中心。

沒食子酸、D(＋)-無水葡萄糖、阿卡波糖、ABTS、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside，PNPG）、水溶性VE（Trolox）、三七總皂苷 上海源葉生物科技有限公司；蘆丁、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；α-葡萄糖苷酶（700000 U/mL）北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜級）美國Millipore公司；氨水（色譜級）德國Merck公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-304箱式真空冷凍干燥機(jī) 濟(jì)南駿德儀器有限公司；XINYI-IID超聲波粉碎機(jī)、SB-400DTY超聲波清洗機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；BSA224S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀帝肯貿(mào)易有限公司（上海）；Nexera X2 LC-30AD超高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；Q Exactive plus質(zhì)譜儀美國賽默飛世爾科技公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀 艾本德中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng)

將米根霉、粗糙脈孢菌、紅曲霉和魯氏毛霉分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)[22]。待菌種長滿平板后，用打孔器打取已活化好的菌種并接種到PDA液體培養(yǎng)基中，得到濃度為1×105個(gè)/mL的菌懸液[23]。

1.3.2 樣品及發(fā)酵液制備

取4 g三七葉粉末，加100 mL蒸餾水，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至室溫后，接種4 mL濃度為1×105個(gè)/mL的菌懸液，于28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)10 d，每隔24 h等體積取樣一次，取樣后置于4 ℃冰箱中停止發(fā)酵，并將所有樣品保存在-20 ℃冰箱備用[13]。在不含菌種的三七葉溶液中取樣，作為空白對照，即為第0天發(fā)酵液。隨后，加入無水乙醇使發(fā)酵液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，然后置于50 ℃水浴超聲（160 W，40 kHz）提取2 h，離心后取上清液置于-20 ℃冰箱[24]。

1.3.3 總皂苷含量測定

采用香草醛-高氯酸-冰乙酸法[25]測定。40 μL樣品溶液，于80 ℃恒溫水浴鍋中蒸干溶劑后加入20 μL 5%香草醛-冰乙酸溶液和80 μL高氯酸，60 ℃水浴15 min，冰浴5 min后加入200 μL冰乙酸停止反應(yīng)，在540 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/mL三七總皂苷溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式Y(jié)=1.7768X＋0.0586（R2=0.995），根據(jù)公式計(jì)算總皂苷含量。

1.3.4 總多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[26]測定總多糖含量。50 μL樣品溶液，加入50 μL 5%苯酚溶液，隨后緩慢加入250 μL濃硫酸，40 ℃水浴恒溫10 min，冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100、150、200 μg/mL的D(＋)-無水葡萄糖溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式Y(jié)=4.818X＋0.2156（R2=0.9915），根據(jù)公式計(jì)算總多糖含量。

1.3.5 總酚和總黃酮含量測定

采用福林-酚法[27]測定總酚含量。取50 μL樣品溶液，加入125 μL 0.1 mol/L福林-酚溶液，最后加入100 μL 75 g/L碳酸鈉溶液，避光反應(yīng)30 min后，于765 nm波長處測定吸光度，以100 μL蒸餾水代替碳酸鈉溶液作對照組。同等條件下測定沒食子酸質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80、100 μg/mL時(shí)的吸光度，并繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式Y(jié)=0.009X＋0.0365（R2=0.9978），根據(jù)公式計(jì)算總酚含量。

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[28]測定總黃酮含量。取40 μL樣品溶液，加入20 μL 50 g/L亞硝酸鈉溶液，室溫反應(yīng)6 min，加入20 μL 100 g/L硝酸鋁溶液，室溫反應(yīng)6 min，加入140 μL 40 g/L氫氧化鈉溶液，室溫反應(yīng)15 min后，于510 nm波長處測定吸光度。80%乙醇溶液代替相應(yīng)的試劑為對照組。同等條件下測定蘆丁質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL時(shí)的吸光度，并繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式Y(jié)=0.0013X-0.0103（R2=0.9921），根據(jù)公式計(jì)算總黃酮含量。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

1.3.61 DPPH自由基清除能力

參照Xiao Yecheng等[29]的方法測定不同發(fā)酵液的DPPH自由基清除活性，并作適當(dāng)修改。適宜濃度100 μL樣品溶液，加入100 μL DPPH自由基溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度，其中，以80%乙醇溶液代替DPPH自由基溶液作為對照組。VC和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）為陽性對照。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式Y(jié)=-0.0197X＋0.8968（R2=0.9906），計(jì)算樣品的Trolox當(dāng)量，結(jié)果以其與第0天發(fā)酵液DPPH自由基清除能力的比值表示（相對能力/%）。

1.3.62 ABTS陽離子自由基清除能力

參照Tao Liang等[30]的方法，并作適當(dāng)修改。將7 mmol/L ABTS和140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h，制得ABTS陽離子自由基儲(chǔ)備液，后稀釋至其吸光度在734 nm波長處為0.7±0.2，可得ABTS陽離子自由基工作液。取50 μL適宜濃度的樣品溶液于酶標(biāo)板中，加入200 μL ABTS陽離子自由基工作液，室溫避光反應(yīng)6 min后于734 nm波長處測吸光度。VC和BHT為陽性對照。其中，以80%乙醇溶液代替ABTS陽離子自由基溶液作為對照組。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，得到公式Y(jié)=-0.0089X＋0.7406（R2=0.9933），根據(jù)公式計(jì)算，計(jì)算樣品的Trolox當(dāng)量，結(jié)果以其與第0天發(fā)酵液ABTS陽離子自由基清除能力的比值表示（相對能力/%）。

1.3.63 鐵離子還原能力

參照Xu Xiaoyan等[31]的方法測定樣品的鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）。分別配制30 mmol/L pH 3.6的乙酸緩沖溶液、10 mmol/L TPTZ工作液及20 mmol/L的FeCl3溶液，將3 種溶液以體積比10∶1∶1混勻即得到FRAP工作液。取50 μL樣品溶液于酶標(biāo)板中，加入250 μL FRAP工作液，37 ℃水浴恒溫10 min后在593 nm波長處測定吸光度。其中，80%乙醇溶液代替FRAP工作液作為對照組。同等條件下測定硫酸亞鐵的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式Y(jié)=0.0056X＋0.0206（R2=0.9929），根據(jù)公式計(jì)算，結(jié)果以其與第0天發(fā)酵液相應(yīng)FRAP的比值表示（相對能力/%）。

1.3.7α-葡萄糖苷酶抑制能力測定

參照Amirah等[32]的方法，略修改。50 μL樣品溶液中加入25 μL 0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液（磷酸緩沖液配制），37 °C水浴恒溫10 min，后加入50 μL 5 mmol/L PNPG溶液，37 ℃下水浴恒溫15 min后，加入100 μL 0.2 mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，并在405 nm波長處測定吸光度（A）。其中，以蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶溶液作為對照組（A0），以80%乙醇溶液代替樣品溶液作為空白對照（A1）。以阿卡波糖為陽性對照。按下式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率：

1.3.8 代謝組學(xué)分析

米根霉、粗糙脈孢菌、紅曲霉和魯氏毛霉發(fā)酵后，綜合比較三七葉化學(xué)成分和體外抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶能力的變化情況，并篩選得到對功能活性增效最強(qiáng)的菌株，對該菌株發(fā)酵后的代謝物做進(jìn)一步分析。

代謝物提取[33]：樣品置于4 ℃解凍后吸取3 mL液體樣品于離心管中，凍干后加入1 mL甲醇-水溶液（4∶1，V/V）混勻，冰浴超聲30 min，于-20 ℃靜置2 h，然后于4 ℃、16000×g離心20 min，取上清液。將上清液在高速真空濃縮離心機(jī)中揮干，加入100 μL甲醇-水溶液（1∶1，V/V）復(fù)溶，4 ℃、20000×g離心20 min，取上清液用于質(zhì)譜分析，同時(shí)從每個(gè)樣品中取等體積樣品，混勻制備QC樣品，以驗(yàn)證系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

超高效液相色譜條件[34]：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量4 μL。整個(gè)分析過程樣品一直置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫過程Table 1 Gradient elution procedure

質(zhì)譜條件[35]：樣品采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式檢測。噴霧電壓正離子模式為3800 V，負(fù)離子模式為3200 V；離子傳輸管溫度為320 ℃；母離子掃描范圍為m/z7～1050。

數(shù)據(jù)處理：原始數(shù)據(jù)采用MSDIAL軟件進(jìn)行峰對齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配（質(zhì)量偏差＜0.02‰）和二級譜圖匹配（質(zhì)量偏差＜0.02 Da）的方式，檢索HMDB、MassBank等公共數(shù)據(jù)庫及自建數(shù)據(jù)庫。對提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值＞50%的離子峰；對正負(fù)離子數(shù)據(jù)分別進(jìn)行總峰面積歸一化，整合正負(fù)離子峰并應(yīng)用R軟件進(jìn)行模式識(shí)別，數(shù)據(jù)經(jīng)Unit variance scaling預(yù)處理后，進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)，使用Origin 2018和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析、繪圖。P＜0.05，差異顯著。利用OmicStudio云平臺(tái)（https://www.omicstudio.cn/tool）和歐易集團(tuán)云平臺(tái)（https://cloud.oebiotech.cn/task/）進(jìn)行熱圖、火山圖、相關(guān)性以及主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對總皂苷含量的影響

由圖1可知，不同菌株對三七葉總皂苷的影響存在顯著差異，其中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，米根霉、粗糙脈孢菌和魯氏毛霉發(fā)酵的三七葉皂苷含量均呈現(xiàn)先降低后升高然后又降低的趨勢，而紅曲霉則是先降低后升高。除米根霉外的3 種真菌發(fā)酵后的總皂苷含量均低于未發(fā)酵樣品，原因可能是由于皂苷發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化成了稀有人參皂苷，導(dǎo)致總皂苷含量降低[36]。陳紅惠等[12]同樣發(fā)現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵可使三七葉中皂苷含量先增加后下降，原因是極性較低的稀有皂苷含量有所增加。閆炳雄等[37]報(bào)道了黑曲霉可以高效地轉(zhuǎn)化三七藥材中的皂苷類成分，且伴有幾種稀有人參皂苷和三七皂苷的生成。而米根霉發(fā)酵4 d后，其總皂苷含量從未發(fā)酵的170.19 mg/g增加到187.31 mg/g，原因可能是三七葉木質(zhì)部細(xì)胞的細(xì)胞壁被米根霉產(chǎn)生的某些纖維素酶水解，提高了皂苷提取率[38]。

圖1 真菌發(fā)酵對總皂苷含量的影響Fig.1 Effect of fungal fermentation on total saponin content

2.2 發(fā)酵對總多糖含量的影響

如圖2所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，4 種真菌發(fā)酵后的總多糖含量均明顯降低，其原因可能是微生物在生長過程中，需要不斷地消耗多糖等營養(yǎng)物質(zhì)[36]。進(jìn)入發(fā)酵后期，菌種活力下降，減少了對糖類的利用[39]。與梅玉立等[40]研究結(jié)果一致。

圖2 真菌發(fā)酵對多糖含量的影響Fig.2 Effect of fungal fermentation on polysaccharide content

2.3 發(fā)酵對總酚和總黃酮含量的影響

由圖3可知，米根霉、粗糙脈孢菌和紅曲菌在發(fā)酵7～10 d后使三七葉的總酚含量分別提高40.4%、17.66%、8.1%；而魯氏毛霉發(fā)酵卻使三七葉總酚含量顯著下降。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同菌種、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵方式會(huì)造成發(fā)酵前后總酚含量的不同[41-42]。張媛媛等[11]研究發(fā)現(xiàn)三七葉茶經(jīng)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵后，其醇提物的總酚和總黃酮含量顯著降低。陳紅惠等[12]研究發(fā)現(xiàn)三七葉發(fā)酵茶經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，其多酚含量顯著降低，黃酮含量在發(fā)酵第15天達(dá)到最大值。

此外，米根霉和魯氏毛霉在發(fā)酵1～2 d后使三七葉的總黃酮含量分別提高8.66%和17.11%；而粗糙脈孢菌和紅曲霉發(fā)酵后，三七葉的總黃酮含量顯著降低。米根霉和魯氏毛霉發(fā)酵三七葉后其總黃酮的含量顯著升高，原因可能是米根霉和魯氏毛霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的水解酶降低了淀粉、纖維等高分子對活性成分的包裹作用，有利于黃酮類物質(zhì)的溶出[43]。粗糙脈孢菌和紅曲霉發(fā)酵三七葉后其總黃酮的含量顯著降低，這與發(fā)酵過程中三七葉的某些黃酮類成分轉(zhuǎn)化有關(guān)。

2.4 發(fā)酵對體外抗氧化活性的影響

考慮到抗氧化機(jī)制的復(fù)雜性，采用DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP綜合評價(jià)其體外抗氧化活性。如圖4所示，米根霉、粗糙脈孢菌、紅曲霉發(fā)酵后，三七葉的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP呈先降后升的趨勢，而魯氏毛霉發(fā)酵后，三七葉的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP呈先降后平緩的趨勢。4 種真菌發(fā)酵3～5 d均可顯著增強(qiáng)三七葉的抗氧化活性，但不同菌株之間作用不一。對增效作用進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)紅曲霉發(fā)酵3～10 d后，三七葉的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP分別提高14.30%、29.46%、18.40%，顯著高于其他菌株。其中，三七葉的DPPH自由基清除能力和FRAP在紅曲霉發(fā)酵3 d后效果顯著，ABTS陽離子自由基清除能力在紅曲霉發(fā)酵3 d后提高5.13%，但顯著低于發(fā)酵10 d后。真菌發(fā)酵可以增強(qiáng)抗氧化活性，與凌阿靜等[44]研究結(jié)果相似。

圖4 真菌發(fā)酵對抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of fungal fermentation on antioxidant activity of P. notoginseng leaves

2.5 發(fā)酵對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

由圖5可知，4 種真菌在發(fā)酵前期均降低了三七葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，對α-葡萄糖苷酶抑制活性有所增強(qiáng)。米根霉、粗糙脈孢菌和魯氏毛霉發(fā)酵后，三七葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性影響不明顯，而紅曲霉發(fā)酵6 d后，三七葉對α-葡萄糖苷酶的抑制活性提高16.03%，明顯高于其他菌株。這與王丹等[45]的研究結(jié)果一致，紅曲霉發(fā)酵可以提高α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，紅曲霉是增強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制活性較合適的菌株。

圖5 真菌發(fā)酵對抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effect of fungal fermentation on α-glucosidase inhibitory activity

2.6 代謝組學(xué)分析

基于前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，紅曲霉發(fā)酵對三七葉的功能活性增效最好，因此采用非靶向代謝組學(xué)分析紅曲霉發(fā)酵3 d后三七葉中代謝物的變化。

2.6.1 代謝物分類

從三七葉中共鑒定出573 種代謝物，其中正離子模式下檢測到380 種，負(fù)離子模式下193 種，如圖6所示。其中，顏色代表分類，面積代表分類中代謝物的相對比例。三七葉中的代謝物在超類水平上主要包括脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)雜環(huán)化合物；在類水平上主要包括羧酸及其衍生物、有機(jī)氧化合物、丙烯醇脂質(zhì)；在亞類水平上以氨基酸、肽和類似物為主。

圖6 正（A）、負(fù)（B）離子模式下的代謝物分類Fig.6 Classification of metabolites identified in positive (A) and negative (B) ion modes

2.6.2 代謝物的相關(guān)分析

根據(jù)代謝物的主成分分析（principal component analysis，PCA），如圖7A所示，三七葉和發(fā)酵三七葉在正、負(fù)離子模式下分布距離較遠(yuǎn)，表明發(fā)酵前后的代謝物種類和含量有顯著差異。正負(fù)離子模式下樣品點(diǎn)集中，表明樣品重復(fù)性好。根據(jù)P＜0.05和|log2倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）|≥1.5構(gòu)建火山圖，如圖7B所示，正離子模式下代謝物有380 種，其中28 種顯著上調(diào)，63 種顯著下調(diào)；負(fù)離子模式下代謝物有193 種，其中顯著上調(diào)的有24 種，顯著下調(diào)的有46 種。綜上，正負(fù)離子模式下上調(diào)的代謝物均明顯少于下調(diào)的代謝物。

圖7 代謝物的相關(guān)分析Fig.7 Correlation analysis among metabolites

根據(jù)正交偏最小二乘判別分析獲得的投影中變量重要性（variable importance in projection，VIP）值，選擇VIP值排在前50的差異代謝物繪制聚類熱圖，如圖7C所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后變化的代謝物主要集中在氨基酸、生物堿、碳水化合物、脂類、酚類、類黃酮以及一些萜類化合物等。在發(fā)酵過程中，三七葉中的蛋白質(zhì)發(fā)生部分水解，促進(jìn)氨基酸形成；而氨基酸能與可溶性糖等產(chǎn)生反應(yīng)，生成新物質(zhì)；同時(shí)三七葉中的黃酮苷也可以被降解成黃酮苷元和糖體。總之，三七葉在發(fā)酵過程中發(fā)生復(fù)雜的代謝反應(yīng)，也是發(fā)酵后三七葉化學(xué)成分變化的原因。

2.6.3 差異代謝物與功能活性的相關(guān)性分析

將功能活性與代謝物之間進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，如圖8所示。在正、負(fù)離子模式下，只有少量代謝物與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著相關(guān)，這些代謝物所屬類別較多，這意味著發(fā)揮功能活性是各種代謝物協(xié)同作用的結(jié)果，而不是單一作用。

圖8 功能活性與代謝物的相關(guān)性Fig.8 Correlation between functional activity and metabolites

2.6.4 皂苷類化合物分析

由于皂苷被認(rèn)為是三七中最主要的活性成分之一，因此針對代謝物中的皂苷類化合物進(jìn)行分析。紅曲霉發(fā)酵三七葉發(fā)酵前后代謝物中的皂苷類化合物如表2所示，共鑒定到21 種皂苷類化合物，其中正離子模式下10 種，負(fù)離子模式下11 種，并發(fā)現(xiàn)其中9 種皂苷類化合物經(jīng)發(fā)酵后含量發(fā)生了顯著變化。由圖9可知，人參皂苷F2顯著上調(diào)，其余皂苷顯著下調(diào)。其中，人參皂苷F2是由楊秀偉等[46]從人參莖葉中鑒定出來的稀有皂苷。研究表明，稀有人參皂苷具有較好的藥理活性，如人參皂苷C-K具有抗結(jié)直腸癌、抗炎作用[47]；人參皂苷F2是原人參二醇型皂苷如Rb1、Rb2、Rc和Rd等失去若干糖而代謝降解形成的次級皂苷之一[48-49]，被證明具有抗氧化、降脂等生物活性[50]。稀有人參皂苷因含量低而受到限制，利用生物轉(zhuǎn)化法對普通人參單體皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是獲得稀有人參皂苷的重要途徑[51]。陳旸等[52]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵人參后，人參Rd含量顯著提高，Rd作為稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物，其作用極為重要。而依據(jù)上述總皂苷含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測出三七葉在發(fā)酵過程中同樣存在著皂苷類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

圖9 9 種皂苷類化合物含量的變化Fig.9 Changes in contents of nine saponins

表2 三七葉發(fā)酵前后代謝物中的皂苷類化合物Table 2 Saponins in metabolites of raw and fermented P. notoginseng leaves

2.6.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析

對差異代謝物參與的通路進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果如圖10所示。圖中C（細(xì)胞過程）、E（環(huán)境信息處理）、G（遺傳信息處理）、H（人類疾?。?、M（新陳代謝）、O（生物體系統(tǒng)），圓圈大小表示注釋到該通路中的差異代謝物數(shù)量，圓圈顏色越藍(lán)越顯著。由于本實(shí)驗(yàn)研究三七葉在發(fā)酵過程中的代謝物變化，因而針對M（新陳代謝）進(jìn)行分析。嘌呤代謝、嘧啶代謝、類黃酮生物合成、輔助因子的生物合成等是紅曲霉在發(fā)酵三七葉過程中最可能的代謝通路，其富集到的差異代謝物數(shù)量分別為5、4、4 個(gè)和6 個(gè)。其中，嘧啶代謝往往與氨基酸代謝緊密聯(lián)系，如5-甲基胞嘧啶和胸腺嘧啶會(huì)參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；輔助因子是碳代謝與能量代謝的中心代謝物，對氨基酸代謝、脂類代謝、植物次生代謝等有重要作用。

3 結(jié)論

真菌發(fā)酵對三七葉中的皂苷、多糖、總酚和總黃酮含量有較大的影響，其中皂苷和多糖含量在發(fā)酵后顯著降低，而總酚與總黃酮含量在不同真菌中差異較大，原因可能是三七葉中皂苷和多糖含量較高，而總酚和總黃酮含量較低。真菌發(fā)酵對三七葉的功能活性有一定的影響，4 種真菌的抗氧化活性在發(fā)酵3～5 d后明顯增強(qiáng)，其中紅曲霉發(fā)酵3 d后，三七葉的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力和FRAP分別提高14.30%、5.13%、18.40%；相比其他真菌，其增效作用更顯著。此外，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵對α-葡萄糖苷酶抑制活性有所增強(qiáng)，其中紅曲霉發(fā)酵6 d后增強(qiáng)16.03%，在4 種真菌發(fā)酵中增效作用最大。通過上述結(jié)果可得，紅曲霉發(fā)酵3 d后，對三七葉的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的增效作用較顯著，因此選擇紅曲霉作為本研究中最適宜發(fā)酵三七葉的菌株。有趣的是，三七葉中含有豐富的纖維，但本研究選用的分解纖維素能力較強(qiáng)的兩株菌株（粗糙脈孢菌、魯氏毛霉菌）并非是對三七葉功能活性增效最明顯的菌株，原因可能是三七葉除了富含纖維外，也含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分，而這些營養(yǎng)成分可以被真菌所利用，產(chǎn)生具有各種功能活性的次生代謝產(chǎn)物。

進(jìn)一步的非靶向代謝組學(xué)分析揭示了三七葉在發(fā)酵過程中代謝物的變化，發(fā)酵后上調(diào)的代謝物明顯少于下調(diào)的代謝物，主要集中在氨基酸、生物堿、碳水化合物、脂類、酚類、類黃酮以及萜類化合物等，這些代謝物可能作為三七葉發(fā)酵的底物，被逐漸氧化消耗，意味著這些代謝物可能參與三七葉發(fā)酵的過程。對其中的21 種皂苷類化合物進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)其中只有人參皂苷 F2顯著上調(diào)，另有8 種皂苷顯著下調(diào)。且只有少量代謝物與DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著相關(guān)。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝、嘧啶代謝、類黃酮生物合成、輔助因子的生物合成等是紅曲霉在發(fā)酵三七葉過程中最可能的代謝通路，這解釋了紅曲霉發(fā)酵三七葉后功能活性發(fā)生變化的原因，揭示了其代謝途徑。本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)研究了發(fā)酵過程中的差異代謝物以及皂苷類化合物的變化情況，并初步推測了其可能的代謝途徑。然而，由于發(fā)酵過程復(fù)雜，對其代謝機(jī)制的研究仍需深入探討。此外，本研究是在同樣的條件下利用不同真菌對三七葉進(jìn)行發(fā)酵，在今后的研究中可對不同菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高菌株的發(fā)酵能力。同時(shí)進(jìn)一步對三七葉中皂苷的發(fā)酵轉(zhuǎn)化進(jìn)行深入研究，為三七稀有皂苷的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制提供思路。以期為三七葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。