周 迪，邱小嫻，柯 野，胡秋怡

（韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

大豆中蛋白氨基酸組成合理，且無飽和脂肪酸和膽固醇，具有良好的功能特性，是食品和飼料加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源[1-2]。近年來，我國(guó)大豆以進(jìn)口為主，2020年進(jìn)口超過1億 t，2021年進(jìn)口量9652萬 t，豆粕飼用需求是拉動(dòng)大豆進(jìn)口量的主要因素之一。但大豆中存在多種致敏原，它們通過干擾營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，以及改變正常的新陳代謝，引起不良的生理反應(yīng)，影響動(dòng)物尤其是幼齡動(dòng)物的健康，從而限制了其推廣應(yīng)用[3-4]。因此，在目前大豆蛋白資源短缺的情況下，降低或消除大豆蛋白致敏性的研究對(duì)提高大豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值、提升大豆利用率和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S）是大豆中致敏性最強(qiáng)的兩種蛋白。目前，常采用熱處理法、酸堿化學(xué)法和生物酶解法降低或消除大豆蛋白的致敏性。其中，生物酶解法特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、效率高，采用的蛋白酶能水解切斷大豆蛋白分子的氨基酸序列，部分或完全破壞其線性表位，被認(rèn)為是降低甚至消除大豆蛋白致敏性的最佳選擇[5-7]。研究表明，盡管堿性蛋白酶[8-9]、風(fēng)味蛋白酶[10-11]、中性蛋白酶[12]等較胰蛋白酶[13]和胃蛋白酶[14]對(duì)大豆蛋白的水解和降低致敏性的效果較好，但仍然難以完全消除其致敏性[5]。且這幾種酶的最適pH值為中性偏堿性，僅適合大豆蛋白的體外水解。天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23）通常被稱為酸性蛋白酶，廣泛分布于真菌、脊椎動(dòng)物、植物、細(xì)菌和病毒中。該類酶的最適反應(yīng)pH值一般在2.0～6.0之間，動(dòng)物的胃（pH 2.0～4.0）和腸道環(huán)境（pH 5.0～7.5）有利于酸性蛋白酶的穩(wěn)定性和催化功能[15-16]。因此，可將天冬氨酸蛋白酶直接添加到大豆蛋白中，以簡(jiǎn)化體外水解利用大豆蛋白的生產(chǎn)工藝。除胃蛋白酶外，其他酸性蛋白酶水解大豆蛋白的應(yīng)用研究很少。如王錦欣等[17]通過黑曲霉酸性蛋白酶和胃蛋白酶聯(lián)合酶解β-伴大豆球蛋白，可以將α’和α亞基完全消化，但β亞基仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的致敏性。因此，發(fā)掘出更多、更高效的水解大豆蛋白并降低其致敏性的酸性蛋白酶有助于推動(dòng)大豆蛋白更廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）是4 種生防效果優(yōu)良的木霉菌之一，能分泌幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、木聚糖酶和蛋白酶等多種胞外蛋白酶，這些酶協(xié)同作用發(fā)揮其生物防治功能。然而，與其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶[18-21]、纖維素酶[22-23]和木聚糖酶[24]相比，其產(chǎn)生的蛋白酶性質(zhì)、功能和應(yīng)用研究較少。為開發(fā)木霉屬真菌蛋白酶資源及挖掘蛋白酶的應(yīng)用價(jià)值，本研究從棘孢木霉中克隆天冬氨酸蛋白酶基因asp，并在畢赤酵母（Pichia pastoris）中表達(dá)。對(duì)表達(dá)的重組蛋白酶rAsp成熟肽序列和同源建模分析，然后采用rAsp濃縮液水解大豆分離蛋白，研究rAsp對(duì)大豆分離蛋白的水解及降低大豆蛋白致敏性的效果，旨在為酸性蛋白酶應(yīng)用于大豆蛋白加工或開發(fā)酸性蛋白酶飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）CGMCC3.17461中國(guó)微生物菌種保藏中心；畢赤酵母GS115菌株（hismut＋）、質(zhì)粒pPIC9K 美國(guó)Invitrogen公司；RNAiso Plus、PrimeScript? II 1stStrand cDNA合成試劑盒、PrimeSTAR?Max Premix（2×）、DNA marker、MiNiBEST DNA片段純化試劑盒、MiNiBEST質(zhì)粒純化試劑盒及各種工具酶 TaKaRa（大連）有限公司；pEASY-Blunt克隆試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 美國(guó)Thermo公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、胃蛋白酶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；Sephadex G-75 美國(guó)GE Healthcare公司；大豆分離蛋白 臨沂山松生物制品有限公司；β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

棘孢木霉和大腸桿菌（Escherichia coli）培養(yǎng)分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）和溶菌肉湯培養(yǎng)基；畢赤酵母GS115菌株所用培養(yǎng)基及配方均按照Invitrogen公司的畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體試劑盒操作進(jìn)行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26S XP高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；1-14K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；2720 DNA擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司；Multiskan GO 1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；AKTA Prime Plus蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；Gene Pluser XcellTM電轉(zhuǎn)化儀、1658001微型垂直電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因asp的克隆

將棘孢木霉接種至PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，收集菌絲體，采用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，使用PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載棘孢木霉asp基因序列（登錄號(hào)：XM_024902133.1），去除終止子序列后設(shè)計(jì)引物F：CGGGATCCGAGGCCATCTTCAACGTCCA和R：TAGGGGGCCCCTGGTTAGACGCAGAATTCA（下劃線部分分別為引入的BamH I和ApaI限制性酶切位點(diǎn)序列）。以獲得的cDNA為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸3 min。純化回收PCR產(chǎn)物，連接構(gòu)建pEASY-Blunt/asp克隆載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，篩選陽性克隆子并測(cè)序驗(yàn)證，并進(jìn)一步利用生物信息學(xué)軟件和在線程序?qū)幋a的氨基酸序列和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.2 重組畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建和篩選

以DH5α陽性克隆子的菌液為模板，利用引物F和R擴(kuò)增asp基因片段，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和ApaI雙酶切后，連接至表達(dá)載體pICH（由載體pPIC9K改造獲得），構(gòu)建重組表達(dá)載體pICH/asp。利用StuI線性化載體pICH/asp，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115菌株中（2 mm電轉(zhuǎn)杯、1.5 kV、25 μF、4～6 ms），電轉(zhuǎn)液經(jīng)復(fù)蘇后，12000×g離心2 min，棄培養(yǎng)基上清液至200 μL，吸打混勻后涂布至MD（minimal dextrase）平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h后，挑取單菌落接種至含1.0%脫脂奶粉基礎(chǔ)甲醇（minimal methanol，MM）平板（pH 5.0）上，以菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈為選擇標(biāo)志，篩選重組畢赤酵母菌株單菌落。以引物F和R及引物5’-AOX：GACTGGTTCCAATTGACAAGC和3’-AOX：GGCAAATGGCATTCTGACATCC進(jìn)行酵母基因組PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.3.3 重組畢赤酵母工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選獲得的重組畢赤酵母工程菌株接種至緩沖甘油培養(yǎng)基（pH 6.0）中，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接至緩沖甲醇培養(yǎng)基（pH 5.0）中，使初始接種量OD600nm為5～6，28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d。期間每24 h補(bǔ)加甲醇1 次，使其終體積分?jǐn)?shù)為0.8%，并在每次加甲醇之前進(jìn)行取樣，測(cè)定培養(yǎng)上清液的蛋白酶活力。

1.3.4 蛋白酶活力的測(cè)定

采用Folin-酚法，取適當(dāng)稀釋的酶液100 μL，加入到等體積的2 g/100 mL酪蛋白底物溶液（采用pH 3.0、20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液溶解）中，混勻，40 ℃孵育10 min，加入200 μL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。12000×g離心10 min，取300 μL上清液，先后加入1.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和300 μL Folin-酚試劑，混勻，40 ℃孵育20 min，660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以先加入三氯乙酸的滅活酶作為對(duì)照。蛋白酶活力定義為：40 ℃每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 rAsp的純化

4 ℃、8500×g離心15 min，收集1.3.3節(jié)培養(yǎng)上清液，采用截留分子質(zhì)量為10 kDa的切向流膜過濾設(shè)備濃縮發(fā)酵上清液至適當(dāng)體積，再用不同截留分子質(zhì)量的離心超濾管逐步濃縮去雜后，以pH 3.020 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對(duì)濃縮液進(jìn)行透析，進(jìn)一步采用Sephadex G-75分子篩層析純化rAsp，將純化的rAsp濃縮液于4 ℃保藏，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 pH值和溫度對(duì)rAsp活力及穩(wěn)定性的影響測(cè)定

以pH 2.0～7.0的20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制不同pH值的2 g/100 mL酪蛋白底物溶液。將rAsp濃縮液用上述緩沖液適當(dāng)稀釋，然后與不同pH值的酪蛋白底物溶液在40 ℃反應(yīng)，測(cè)定蛋白酶活力，以確定最適反應(yīng)pH值。將1.3.5節(jié)純化的rAsp濃縮液等量加入上述不同pH值緩沖液中，4 ℃孵育24 h，透析至pH 3.0，測(cè)定殘余酶活力，以確定pH值對(duì)rAsp穩(wěn)定性的影響。

將1.3.5節(jié)純化的rAsp濃縮液和底物混合液于不同溫度（30～60 ℃，5 ℃為間隔）下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以確定rAsp最適反應(yīng)溫度。將rAsp濃縮液分別置于上述不同溫度下分別保溫10、20、40、60、80、120 min，測(cè)定殘余酶活力，分析溫度對(duì)rAsp穩(wěn)定性的影響。

1.3.7 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)rAsp活性的影響

在4 ℃條件下，將1.3.5節(jié)純化的rAsp濃縮液與不同金屬離子（終濃度為5 mmol/L）和不同濃度的化學(xué)試劑共孵育30 min，測(cè)定殘余酶活力，以確定金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)rAsp活性的影響。

1.3.8 rAsp和胃蛋白酶水解大豆分離蛋白

用檸檬酸緩沖液（pH 3.0）配制3 g/100 mL的大豆分離蛋白溶液。然后按每毫升大豆分離蛋白溶液中分別加入23 U的rAsp和胃蛋白酶，35 ℃水解，分別于0、5、60、180、360 min取適量水解液，置于沸水中10 min滅酶，12000×g離心30 min，收集水解上清液，備用。

1.3.9 SDS-PAGE檢測(cè)及水解液的致敏性測(cè)定

用SDS-PAGE（分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）檢測(cè)大豆分離蛋白水解液，以觀察水解過程中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亞基的變化情況，對(duì)照樣品點(diǎn)樣量10 μL，酶水解樣品點(diǎn)樣量20 μL；用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定水解上清液中蛋白含量的變化。

采用ELISA試劑盒測(cè)定大豆分離蛋白水解前后β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的致敏性，按試劑盒操作步驟進(jìn)行測(cè)定，以致敏性降低百分比表示水解前后致敏性的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 asp基因的克隆和序列分析

將提取的棘孢木霉總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用引物F和R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物片段與預(yù)期大小一致（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pEASY-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，挑取陽性克隆子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的asp基因具有完整的開放閱讀框，長(zhǎng)度為1359 bp，編碼453 個(gè)氨基酸。其DNA序列與數(shù)據(jù)庫公布的序列存在27 個(gè)堿基突變，相似性為98.01%；推測(cè)編碼的氨基酸序列存在3 個(gè)氨基酸殘基突變，分別為D251G、S289A和N397D。將rAsp序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，顯示其屬于霉菌天冬氨酸蛋白酶家族（cd06097：Aspergillopepsin_like）。rAsp成熟肽序列與已報(bào)道的該家族其他成員序列的相似性均很低，與來自Aspergillus oryzae的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：1izd）[25]相似性最高（47.74%），與來自Trichoderma reesei的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：3c9x）[26]相似性為43.81%，與來自Penicillium janthinellum的青霉蛋白酶（PDB code：3app）[27]相似性為44.66%，與來自Cryphonectria parasitica的天冬氨酸蛋白酶Endothiapepsin（PDB code：5hct）[28]相似性為42.04%，與來自Rhizopus chinensis的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：2apr）[29]相似性為36.86%，與來自Aspergillus phoenicis的Aspergillopepsin I（PDB code：1ibq）[30]相似性為47.44%。這些序列的比對(duì)結(jié)果如圖2所示?？梢姡瑀Asp是一種新型天冬氨酸蛋白酶，有必要進(jìn)行深入研究。

圖1 天冬氨酸蛋白酶asp基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electropherogram of PCR products of the asp gene

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的Conserved Domain Search Service分析，rAsp為含有一個(gè)Asp域的單體酶。根據(jù)同源建模的評(píng)分，以Trichoderma reesei天冬氨酸蛋白酶（PDB code：3c9x）為模板構(gòu)建出rAsp的3D結(jié)構(gòu)（圖3）。rAsp與其他霉菌天冬氨酸蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制相似，即由2 個(gè)相似N端β-桶域和C端β-桶域構(gòu)成，在桶域之間形成一個(gè)催化裂縫（cleft），便于底物多個(gè)殘基與之結(jié)合，達(dá)到定向固定底物作用；每個(gè)桶域中DT (S) G Motif結(jié)構(gòu)中的活性催化D殘基親核攻擊底物肽鍵，達(dá)到水解底物作用。rAsp與其他6 種酶相比（以序列比對(duì)中rAsp第1個(gè)氨基酸殘基Q序號(hào)定義為1，以此類推），增加126～131、145～150、161～164、183～185和262～264位點(diǎn)的殘基片段，促使其具有更長(zhǎng)Loop結(jié)構(gòu)；rAsp的126～127位點(diǎn)不是保守的cis肽鍵，M259-W295不能形成保守的二硫鍵結(jié)構(gòu)。對(duì)于底物特異性非常重要的C結(jié)構(gòu)域第二flap環(huán)（302～307位點(diǎn)）而言，該環(huán)中含有高度保守的G306，該殘基對(duì)底物構(gòu)象定向和定位具有重要作用；在rAsp中，高度保守G突變?yōu)榫哂懈髠?cè)鏈基團(tuán)P殘基，以及非極性I305突變?yōu)闃O性N，這可能更利于側(cè)鏈基團(tuán)小和極性強(qiáng)的底物結(jié)合。rAsp結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基、二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面的差異對(duì)rAsp分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的改造具有一定的指導(dǎo)作用。

圖3 rAsp的同源建模3D結(jié)構(gòu)圖Fig.3 3D structure diagram for homology modeling of rAsp

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和畢赤酵母工程菌株的篩選

將線性化的重組表達(dá)載體pICH/asp電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115后，電轉(zhuǎn)菌懸液涂布在MD平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h后，從中挑取單菌落至含1%脫脂奶粉的MM培養(yǎng)基上，以單菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈為篩選標(biāo)志（圖4），挑取具有最大水解圈直徑的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酵母基因組PCR鑒定。由圖5可知，以引物F和R擴(kuò)增獲得了asp基因的產(chǎn)物；以引物AOX擴(kuò)增獲得了2 種產(chǎn)物，分別為含有asp基因的重組表達(dá)載體pICH/asp序列和畢赤酵母AOX1基因序列。以上結(jié)果表明，重組畢赤酵母工程菌株成功構(gòu)建并得到表達(dá)。

圖4 重組畢赤酵母工程菌株的篩選Fig.4 Screening of recombinant Pichia pastoris strain

圖5 重組表達(dá)載體pICH/asp轉(zhuǎn)化子菌液PCR電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of PCR products from recombinant expression vector pICH/asp transformant

2.3 重組畢赤酵母工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)和rAsp的純化

重組畢赤酵母工程菌株在三角瓶中誘導(dǎo)表達(dá)，當(dāng)發(fā)酵至144 h，發(fā)酵液酶活力達(dá)到最大，約為25.8 U/mL，明顯高于從棘孢木霉中克隆的天冬氨酸蛋白酶rAsp55（最高酶活力9.52 U/mL）[31]和rTaAsp（最高酶活力18.5 U/mL）[32]，表明rAsp獲得了高效表達(dá)，為該蛋白酶的應(yīng)用研究提供了保障。

發(fā)酵上清液經(jīng)切向流膜過濾系統(tǒng)濃縮、離心超濾管濃縮和Sephadex G-75凝膠過濾層析，純化獲得了單一蛋白條帶（圖6）。根據(jù)相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量的關(guān)系，計(jì)算出該蛋白條帶的大小為49.1 kDa，與克隆的asp基因序列推導(dǎo)編碼的氨基酸序列分子質(zhì)量大小一致，表明此單一蛋白條帶為rAsp。

圖6 純化rAsp的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified rAsp

2.4 pH值和溫度對(duì)rAsp活力及穩(wěn)定性的影響結(jié)果

由圖7A可知，rAsp的最適反應(yīng)pH值為2.5，低于來自同種的rTaAsp（pH 4.0）[32]及同屬哈茨木霉的SA76（pH 3.5）[33]；rAsp在pH 2.0～6.0較廣范圍內(nèi)穩(wěn)定性好，在4 ℃孵育24 h后仍保留了90%以上的殘余活力。當(dāng)pH值高于6.0以后穩(wěn)定性急劇下降，pH值到達(dá)7.0以后活性完全喪失。這表明rAsp在酸性條件下具有良好的酶促反應(yīng)活性和穩(wěn)定性，能很好地適應(yīng)動(dòng)物胃腸道環(huán)境，具有作為飼料添加劑的應(yīng)用潛能。由圖7B、C可知，rAsp的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，在45 ℃以下穩(wěn)定性良好，45 ℃孵育120 min仍保留77%以上的活力，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)活力下降明顯，55 ℃孵育10 min活性完全喪失。

圖7 pH值和溫度對(duì)rAsp活性及穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH and temperature on the activity and stability of rAsp

2.5 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)rAsp活力的影響

如表1所示，F(xiàn)e3＋和SDS能顯著抑制rAsp的活力，其他金屬離子和化學(xué)試劑促進(jìn)或不顯著影響rAsp的活性。其中，Cu2＋和Mn2＋對(duì)rAsp的活性具有促進(jìn)作用，分別使其相對(duì)酶活力提高19.90%和24.23%。Cu2＋和Mn2＋對(duì)酸性蛋白酶的促進(jìn)作用與報(bào)道的rP6281[34]和TLAP[35]的結(jié)果一致，這可能是由于Cu2＋和Mn2＋穩(wěn)定了蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)所致；胃蛋白酶抑制劑幾乎完全抑制rAsp的活性，而苯甲磺酰氟、亮肽素和抑肽酶對(duì)其活力影響不明顯，表明rAsp是一種天冬氨酸蛋白酶[36-37]，這與2.1節(jié)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。不同濃度的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraa cetic acid，EDTA）對(duì)rAsp活力影響不大，表明rAsp活力不顯著依賴于金屬離子[38]。rAsp對(duì)大部分金屬離子和化學(xué)試劑的穩(wěn)定性顯示了其在食品和飼料工業(yè)上廣泛應(yīng)用的潛力。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)rAsp活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on rAsp activity

2.6 rAsp和胃蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解

為探索rAsp在水解大豆分離蛋白上的應(yīng)用，將rAsp和胃蛋白酶分別在相同條件下水解大豆分離蛋白。由圖8可知，隨著水解的不斷進(jìn)行，在rAsp和胃蛋白酶不同時(shí)間的水解產(chǎn)物中，兩種主要致敏原如β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亞基條帶逐步被降解甚至消失。5 min時(shí)，β-伴大豆球蛋白的α’（71 kDa）、α（67 kDa）和β亞基（49 kDa）被rAsp和胃蛋白酶完全降解，大豆球蛋白的酸性亞基A（38 kDa）被部分降解，堿性亞基B（21 kDa）被rAsp降解，僅剩分子質(zhì)量小于25 kDa的彌散帶；而此時(shí)胃蛋白酶的水解液中產(chǎn)生了34、31 kDa及≤5 kDa的蛋白帶。60 min后，rAsp和胃蛋白酶繼續(xù)水解大豆分離蛋白，直至逐步將大分子片段降解為小分子肽。水解終點(diǎn)時(shí)，rAsp水解液中僅見＜14.4 kDa的小分子肽，而胃蛋白酶水解液中在14.4～25 kDa之間仍存在一些未被降解的彌散帶，且＜14.4 kDa的小分子帶顏色明顯比rAsp水解液深。相對(duì)蛋白含量的變化（圖9）顯示，隨著水解的進(jìn)行，rAsp和胃蛋白酶水解產(chǎn)物中相對(duì)蛋白含量在水解前60 min下降劇烈，在水解終點(diǎn)時(shí)趨于穩(wěn)定，剩余相對(duì)蛋白含量分別為21.1%和28.8%，rAsp對(duì)大豆分離蛋白的水解效率比胃蛋白酶高7.7%。

圖8 rAsp和胃蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白不同水解時(shí)間產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig.8 SDS-PAGE analysis of SPI hydrolyzed by rAsp or pepsin for different time periods

圖9 rAsp和胃蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白不同水解時(shí)間產(chǎn)物的相對(duì)蛋白含量變化Fig.9 Changes in relative protein content of SPI hydrolyzed by rAsp or pepsin for different time periods

水解終點(diǎn)時(shí)，ELASA檢測(cè)結(jié)果顯示，rAsp使β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的致敏性分別降低了35.9%和27.9%；而胃蛋白酶相應(yīng)使其降低了26.1%和15.6%。可見，rAsp降低β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白致敏性的能力分別約為胃蛋白酶的1.4 倍和1.8 倍。因此，SDSPAGE圖譜、相對(duì)蛋白含量和致敏性變化結(jié)果表明，rAsp對(duì)大豆分離蛋白的水解能力明顯強(qiáng)于胃蛋白酶；且水解降低大豆分離蛋白致敏性的效果強(qiáng)于相同條件下的胃蛋白酶，具有應(yīng)用于大豆蛋白深加工或作為飼料添加劑的潛力。

3 結(jié)論

本研究從T.asperellum克隆天冬氨酸蛋白酶asp基因，并使其在畢赤酵母中成功表達(dá)。在三角瓶中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，rAsp發(fā)酵液的酶活力最高可達(dá)25.8 U/mL。rAsp的最適反應(yīng)pH值為2.5，最適反應(yīng)溫度為45 ℃；在pH 2.0～6.0范圍內(nèi)和低于45 ℃條件下穩(wěn)定性好。rAsp和胃蛋白酶均能很好地降解大豆分離蛋白，使β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亞基完全水解；然而，rAsp對(duì)大豆分離蛋白的水解效率比胃蛋白酶高7.7%，而且對(duì)β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白致敏性降低率分別比胃蛋白酶高9.8%和12.3%。

綜上所述，rAsp適應(yīng)pH值范圍廣，特別是與動(dòng)物消化系統(tǒng)酸堿環(huán)境相吻合，而且在降低和消除大豆蛋白致敏性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，是一種新型高效的酸性蛋白酶。本研究不僅豐富了蛋白酶庫內(nèi)容以及為大豆食品加工產(chǎn)業(yè)和相應(yīng)動(dòng)物飼料產(chǎn)業(yè)提供了有力支撐，也為大豆蛋白酶水解的深入研究奠定了基礎(chǔ)。