周 迪，邱小嫻，柯 野，胡秋怡

（韶關(guān)學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院，廣東 韶關(guān) 512005）

大豆中蛋白氨基酸組成合理，且無飽和脂肪酸和膽固醇，具有良好的功能特性，是食品和飼料加工領域應用廣泛的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源[1-2]。近年來，我國大豆以進口為主，2020年進口超過1億 t，2021年進口量9652萬 t，豆粕飼用需求是拉動大豆進口量的主要因素之一。但大豆中存在多種致敏原，它們通過干擾營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，以及改變正常的新陳代謝，引起不良的生理反應，影響動物尤其是幼齡動物的健康，從而限制了其推廣應用[3-4]。因此，在目前大豆蛋白資源短缺的情況下，降低或消除大豆蛋白致敏性的研究對提高大豆營養(yǎng)價值、提升大豆利用率和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S）是大豆中致敏性最強的兩種蛋白。目前，常采用熱處理法、酸堿化學法和生物酶解法降低或消除大豆蛋白的致敏性。其中，生物酶解法特異性強、反應條件溫和、效率高，采用的蛋白酶能水解切斷大豆蛋白分子的氨基酸序列，部分或完全破壞其線性表位，被認為是降低甚至消除大豆蛋白致敏性的最佳選擇[5-7]。研究表明，盡管堿性蛋白酶[8-9]、風味蛋白酶[10-11]、中性蛋白酶[12]等較胰蛋白酶[13]和胃蛋白酶[14]對大豆蛋白的水解和降低致敏性的效果較好，但仍然難以完全消除其致敏性[5]。且這幾種酶的最適pH值為中性偏堿性，僅適合大豆蛋白的體外水解。天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23）通常被稱為酸性蛋白酶，廣泛分布于真菌、脊椎動物、植物、細菌和病毒中。該類酶的最適反應pH值一般在2.0～6.0之間，動物的胃（pH 2.0～4.0）和腸道環(huán)境（pH 5.0～7.5）有利于酸性蛋白酶的穩(wěn)定性和催化功能[15-16]。因此，可將天冬氨酸蛋白酶直接添加到大豆蛋白中，以簡化體外水解利用大豆蛋白的生產(chǎn)工藝。除胃蛋白酶外，其他酸性蛋白酶水解大豆蛋白的應用研究很少。如王錦欣等[17]通過黑曲霉酸性蛋白酶和胃蛋白酶聯(lián)合酶解β-伴大豆球蛋白，可以將α’和α亞基完全消化，但β亞基仍表現(xiàn)出較強的致敏性。因此，發(fā)掘出更多、更高效的水解大豆蛋白并降低其致敏性的酸性蛋白酶有助于推動大豆蛋白更廣泛的應用和發(fā)展。

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）是4 種生防效果優(yōu)良的木霉菌之一，能分泌幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、木聚糖酶和蛋白酶等多種胞外蛋白酶，這些酶協(xié)同作用發(fā)揮其生物防治功能。然而，與其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶[18-21]、纖維素酶[22-23]和木聚糖酶[24]相比，其產(chǎn)生的蛋白酶性質(zhì)、功能和應用研究較少。為開發(fā)木霉屬真菌蛋白酶資源及挖掘蛋白酶的應用價值，本研究從棘孢木霉中克隆天冬氨酸蛋白酶基因asp，并在畢赤酵母（Pichia pastoris）中表達。對表達的重組蛋白酶rAsp成熟肽序列和同源建模分析，然后采用rAsp濃縮液水解大豆分離蛋白，研究rAsp對大豆分離蛋白的水解及降低大豆蛋白致敏性的效果，旨在為酸性蛋白酶應用于大豆蛋白加工或開發(fā)酸性蛋白酶飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）CGMCC3.17461中國微生物菌種保藏中心；畢赤酵母GS115菌株（hismut＋）、質(zhì)粒pPIC9K 美國Invitrogen公司；RNAiso Plus、PrimeScript? II 1stStrand cDNA合成試劑盒、PrimeSTAR?Max Premix（2×）、DNA marker、MiNiBEST DNA片段純化試劑盒、MiNiBEST質(zhì)粒純化試劑盒及各種工具酶 TaKaRa（大連）有限公司；pEASY-Blunt克隆試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準 美國Thermo公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、胃蛋白酶、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；Sephadex G-75 美國GE Healthcare公司；大豆分離蛋白 臨沂山松生物制品有限公司；β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海紀寧實業(yè)有限公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

棘孢木霉和大腸桿菌（Escherichia coli）培養(yǎng)分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）和溶菌肉湯培養(yǎng)基；畢赤酵母GS115菌株所用培養(yǎng)基及配方均按照Invitrogen公司的畢赤酵母多拷貝表達載體試劑盒操作進行配制。

1.2 儀器與設備

Avanti J-26S XP高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；1-14K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；2720 DNA擴增儀 美國ABI公司；Multiskan GO 1510全波長酶標儀 美國Thermo公司；AKTA Prime Plus蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；Gene Pluser XcellTM電轉(zhuǎn)化儀、1658001微型垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因asp的克隆

將棘孢木霉接種至PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，收集菌絲體，采用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，使用PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載棘孢木霉asp基因序列（登錄號：XM_024902133.1），去除終止子序列后設計引物F：CGGGATCCGAGGCCATCTTCAACGTCCA和R：TAGGGGGCCCCTGGTTAGACGCAGAATTCA（下劃線部分分別為引入的BamH I和ApaI限制性酶切位點序列）。以獲得的cDNA為模板，利用引物進行PCR擴增，反應體系為50 μL。反應程序：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸3 min。純化回收PCR產(chǎn)物，連接構(gòu)建pEASY-Blunt/asp克隆載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，篩選陽性克隆子并測序驗證，并進一步利用生物信息學軟件和在線程序?qū)幋a的氨基酸序列和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行分析。

1.3.2 重組畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建和篩選

以DH5α陽性克隆子的菌液為模板，利用引物F和R擴增asp基因片段，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和ApaI雙酶切后，連接至表達載體pICH（由載體pPIC9K改造獲得），構(gòu)建重組表達載體pICH/asp。利用StuI線性化載體pICH/asp，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115菌株中（2 mm電轉(zhuǎn)杯、1.5 kV、25 μF、4～6 ms），電轉(zhuǎn)液經(jīng)復蘇后，12000×g離心2 min，棄培養(yǎng)基上清液至200 μL，吸打混勻后涂布至MD（minimal dextrase）平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h后，挑取單菌落接種至含1.0%脫脂奶粉基礎甲醇（minimal methanol，MM）平板（pH 5.0）上，以菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈為選擇標志，篩選重組畢赤酵母菌株單菌落。以引物F和R及引物5’-AOX：GACTGGTTCCAATTGACAAGC和3’-AOX：GGCAAATGGCATTCTGACATCC進行酵母基因組PCR擴增驗證。

1.3.3 重組畢赤酵母工程菌株的誘導表達

將篩選獲得的重組畢赤酵母工程菌株接種至緩沖甘油培養(yǎng)基（pH 6.0）中，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接至緩沖甲醇培養(yǎng)基（pH 5.0）中，使初始接種量OD600nm為5～6，28 ℃誘導培養(yǎng)7 d。期間每24 h補加甲醇1 次，使其終體積分數(shù)為0.8%，并在每次加甲醇之前進行取樣，測定培養(yǎng)上清液的蛋白酶活力。

1.3.4 蛋白酶活力的測定

采用Folin-酚法，取適當稀釋的酶液100 μL，加入到等體積的2 g/100 mL酪蛋白底物溶液（采用pH 3.0、20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液溶解）中，混勻，40 ℃孵育10 min，加入200 μL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液終止反應。12000×g離心10 min，取300 μL上清液，先后加入1.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和300 μL Folin-酚試劑，混勻，40 ℃孵育20 min，660 nm波長處測定吸光度，以先加入三氯乙酸的滅活酶作為對照。蛋白酶活力定義為：40 ℃每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.5 rAsp的純化

4 ℃、8500×g離心15 min，收集1.3.3節(jié)培養(yǎng)上清液，采用截留分子質(zhì)量為10 kDa的切向流膜過濾設備濃縮發(fā)酵上清液至適當體積，再用不同截留分子質(zhì)量的離心超濾管逐步濃縮去雜后，以pH 3.020 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對濃縮液進行透析，進一步采用Sephadex G-75分子篩層析純化rAsp，將純化的rAsp濃縮液于4 ℃保藏，用于后續(xù)實驗。

1.3.6 pH值和溫度對rAsp活力及穩(wěn)定性的影響測定

以pH 2.0～7.0的20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制不同pH值的2 g/100 mL酪蛋白底物溶液。將rAsp濃縮液用上述緩沖液適當稀釋，然后與不同pH值的酪蛋白底物溶液在40 ℃反應，測定蛋白酶活力，以確定最適反應pH值。將1.3.5節(jié)純化的rAsp濃縮液等量加入上述不同pH值緩沖液中，4 ℃孵育24 h，透析至pH 3.0，測定殘余酶活力，以確定pH值對rAsp穩(wěn)定性的影響。

將1.3.5節(jié)純化的rAsp濃縮液和底物混合液于不同溫度（30～60 ℃，5 ℃為間隔）下進行酶促反應，以確定rAsp最適反應溫度。將rAsp濃縮液分別置于上述不同溫度下分別保溫10、20、40、60、80、120 min，測定殘余酶活力，分析溫度對rAsp穩(wěn)定性的影響。

1.3.7 金屬離子和化學試劑對rAsp活性的影響

在4 ℃條件下，將1.3.5節(jié)純化的rAsp濃縮液與不同金屬離子（終濃度為5 mmol/L）和不同濃度的化學試劑共孵育30 min，測定殘余酶活力，以確定金屬離子和化學試劑對rAsp活性的影響。

1.3.8 rAsp和胃蛋白酶水解大豆分離蛋白

用檸檬酸緩沖液（pH 3.0）配制3 g/100 mL的大豆分離蛋白溶液。然后按每毫升大豆分離蛋白溶液中分別加入23 U的rAsp和胃蛋白酶，35 ℃水解，分別于0、5、60、180、360 min取適量水解液，置于沸水中10 min滅酶，12000×g離心30 min，收集水解上清液，備用。

1.3.9 SDS-PAGE檢測及水解液的致敏性測定

用SDS-PAGE（分離膠質(zhì)量分數(shù)12%、濃縮膠質(zhì)量分數(shù)5%）檢測大豆分離蛋白水解液，以觀察水解過程中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亞基的變化情況，對照樣品點樣量10 μL，酶水解樣品點樣量20 μL；用考馬斯亮藍法測定水解上清液中蛋白含量的變化。

采用ELISA試劑盒測定大豆分離蛋白水解前后β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的致敏性，按試劑盒操作步驟進行測定，以致敏性降低百分比表示水解前后致敏性的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 asp基因的克隆和序列分析

將提取的棘孢木霉總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用引物F和R進行PCR擴增，獲得的產(chǎn)物片段與預期大小一致（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pEASY-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，挑取陽性克隆子進行測序。測序結(jié)果表明，克隆的asp基因具有完整的開放閱讀框，長度為1359 bp，編碼453 個氨基酸。其DNA序列與數(shù)據(jù)庫公布的序列存在27 個堿基突變，相似性為98.01%；推測編碼的氨基酸序列存在3 個氨基酸殘基突變，分別為D251G、S289A和N397D。將rAsp序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，顯示其屬于霉菌天冬氨酸蛋白酶家族（cd06097：Aspergillopepsin_like）。rAsp成熟肽序列與已報道的該家族其他成員序列的相似性均很低，與來自Aspergillus oryzae的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：1izd）[25]相似性最高（47.74%），與來自Trichoderma reesei的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：3c9x）[26]相似性為43.81%，與來自Penicillium janthinellum的青霉蛋白酶（PDB code：3app）[27]相似性為44.66%，與來自Cryphonectria parasitica的天冬氨酸蛋白酶Endothiapepsin（PDB code：5hct）[28]相似性為42.04%，與來自Rhizopus chinensis的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：2apr）[29]相似性為36.86%，與來自Aspergillus phoenicis的Aspergillopepsin I（PDB code：1ibq）[30]相似性為47.44%。這些序列的比對結(jié)果如圖2所示。可見，rAsp是一種新型天冬氨酸蛋白酶，有必要進行深入研究。

圖1 天冬氨酸蛋白酶asp基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electropherogram of PCR products of the asp gene

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的Conserved Domain Search Service分析，rAsp為含有一個Asp域的單體酶。根據(jù)同源建模的評分，以Trichoderma reesei天冬氨酸蛋白酶（PDB code：3c9x）為模板構(gòu)建出rAsp的3D結(jié)構(gòu)（圖3）。rAsp與其他霉菌天冬氨酸蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)和催化機制相似，即由2 個相似N端β-桶域和C端β-桶域構(gòu)成，在桶域之間形成一個催化裂縫（cleft），便于底物多個殘基與之結(jié)合，達到定向固定底物作用；每個桶域中DT (S) G Motif結(jié)構(gòu)中的活性催化D殘基親核攻擊底物肽鍵，達到水解底物作用。rAsp與其他6 種酶相比（以序列比對中rAsp第1個氨基酸殘基Q序號定義為1，以此類推），增加126～131、145～150、161～164、183～185和262～264位點的殘基片段，促使其具有更長Loop結(jié)構(gòu)；rAsp的126～127位點不是保守的cis肽鍵，M259-W295不能形成保守的二硫鍵結(jié)構(gòu)。對于底物特異性非常重要的C結(jié)構(gòu)域第二flap環(huán)（302～307位點）而言，該環(huán)中含有高度保守的G306，該殘基對底物構(gòu)象定向和定位具有重要作用；在rAsp中，高度保守G突變?yōu)榫哂懈髠?cè)鏈基團P殘基，以及非極性I305突變?yōu)闃O性N，這可能更利于側(cè)鏈基團小和極性強的底物結(jié)合。rAsp結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基、二級結(jié)構(gòu)等方面的差異對rAsp分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的改造具有一定的指導作用。

圖3 rAsp的同源建模3D結(jié)構(gòu)圖Fig.3 3D structure diagram for homology modeling of rAsp

2.2 重組表達載體的構(gòu)建和畢赤酵母工程菌株的篩選

將線性化的重組表達載體pICH/asp電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115后，電轉(zhuǎn)菌懸液涂布在MD平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h后，從中挑取單菌落至含1%脫脂奶粉的MM培養(yǎng)基上，以單菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈為篩選標志（圖4），挑取具有最大水解圈直徑的轉(zhuǎn)化子進行酵母基因組PCR鑒定。由圖5可知，以引物F和R擴增獲得了asp基因的產(chǎn)物；以引物AOX擴增獲得了2 種產(chǎn)物，分別為含有asp基因的重組表達載體pICH/asp序列和畢赤酵母AOX1基因序列。以上結(jié)果表明，重組畢赤酵母工程菌株成功構(gòu)建并得到表達。

圖4 重組畢赤酵母工程菌株的篩選Fig.4 Screening of recombinant Pichia pastoris strain

圖5 重組表達載體pICH/asp轉(zhuǎn)化子菌液PCR電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of PCR products from recombinant expression vector pICH/asp transformant

2.3 重組畢赤酵母工程菌株的誘導表達和rAsp的純化

重組畢赤酵母工程菌株在三角瓶中誘導表達，當發(fā)酵至144 h，發(fā)酵液酶活力達到最大，約為25.8 U/mL，明顯高于從棘孢木霉中克隆的天冬氨酸蛋白酶rAsp55（最高酶活力9.52 U/mL）[31]和rTaAsp（最高酶活力18.5 U/mL）[32]，表明rAsp獲得了高效表達，為該蛋白酶的應用研究提供了保障。

發(fā)酵上清液經(jīng)切向流膜過濾系統(tǒng)濃縮、離心超濾管濃縮和Sephadex G-75凝膠過濾層析，純化獲得了單一蛋白條帶（圖6）。根據(jù)相對遷移率和分子質(zhì)量的關(guān)系，計算出該蛋白條帶的大小為49.1 kDa，與克隆的asp基因序列推導編碼的氨基酸序列分子質(zhì)量大小一致，表明此單一蛋白條帶為rAsp。

圖6 純化rAsp的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified rAsp

2.4 pH值和溫度對rAsp活力及穩(wěn)定性的影響結(jié)果

由圖7A可知，rAsp的最適反應pH值為2.5，低于來自同種的rTaAsp（pH 4.0）[32]及同屬哈茨木霉的SA76（pH 3.5）[33]；rAsp在pH 2.0～6.0較廣范圍內(nèi)穩(wěn)定性好，在4 ℃孵育24 h后仍保留了90%以上的殘余活力。當pH值高于6.0以后穩(wěn)定性急劇下降，pH值到達7.0以后活性完全喪失。這表明rAsp在酸性條件下具有良好的酶促反應活性和穩(wěn)定性，能很好地適應動物胃腸道環(huán)境，具有作為飼料添加劑的應用潛能。由圖7B、C可知，rAsp的最適反應溫度為45 ℃，在45 ℃以下穩(wěn)定性良好，45 ℃孵育120 min仍保留77%以上的活力，當溫度高于50 ℃時活力下降明顯，55 ℃孵育10 min活性完全喪失。

圖7 pH值和溫度對rAsp活性及穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH and temperature on the activity and stability of rAsp

2.5 金屬離子和化學試劑對rAsp活力的影響

如表1所示，F(xiàn)e3＋和SDS能顯著抑制rAsp的活力，其他金屬離子和化學試劑促進或不顯著影響rAsp的活性。其中，Cu2＋和Mn2＋對rAsp的活性具有促進作用，分別使其相對酶活力提高19.90%和24.23%。Cu2＋和Mn2＋對酸性蛋白酶的促進作用與報道的rP6281[34]和TLAP[35]的結(jié)果一致，這可能是由于Cu2＋和Mn2＋穩(wěn)定了蛋白酶的三級結(jié)構(gòu)所致；胃蛋白酶抑制劑幾乎完全抑制rAsp的活性，而苯甲磺酰氟、亮肽素和抑肽酶對其活力影響不明顯，表明rAsp是一種天冬氨酸蛋白酶[36-37]，這與2.1節(jié)預測的結(jié)果一致。不同濃度的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraa cetic acid，EDTA）對rAsp活力影響不大，表明rAsp活力不顯著依賴于金屬離子[38]。rAsp對大部分金屬離子和化學試劑的穩(wěn)定性顯示了其在食品和飼料工業(yè)上廣泛應用的潛力。

表1 金屬離子和化學試劑對rAsp活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on rAsp activity

2.6 rAsp和胃蛋白酶對大豆分離蛋白的水解

為探索rAsp在水解大豆分離蛋白上的應用，將rAsp和胃蛋白酶分別在相同條件下水解大豆分離蛋白。由圖8可知，隨著水解的不斷進行，在rAsp和胃蛋白酶不同時間的水解產(chǎn)物中，兩種主要致敏原如β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亞基條帶逐步被降解甚至消失。5 min時，β-伴大豆球蛋白的α’（71 kDa）、α（67 kDa）和β亞基（49 kDa）被rAsp和胃蛋白酶完全降解，大豆球蛋白的酸性亞基A（38 kDa）被部分降解，堿性亞基B（21 kDa）被rAsp降解，僅剩分子質(zhì)量小于25 kDa的彌散帶；而此時胃蛋白酶的水解液中產(chǎn)生了34、31 kDa及≤5 kDa的蛋白帶。60 min后，rAsp和胃蛋白酶繼續(xù)水解大豆分離蛋白，直至逐步將大分子片段降解為小分子肽。水解終點時，rAsp水解液中僅見＜14.4 kDa的小分子肽，而胃蛋白酶水解液中在14.4～25 kDa之間仍存在一些未被降解的彌散帶，且＜14.4 kDa的小分子帶顏色明顯比rAsp水解液深。相對蛋白含量的變化（圖9）顯示，隨著水解的進行，rAsp和胃蛋白酶水解產(chǎn)物中相對蛋白含量在水解前60 min下降劇烈，在水解終點時趨于穩(wěn)定，剩余相對蛋白含量分別為21.1%和28.8%，rAsp對大豆分離蛋白的水解效率比胃蛋白酶高7.7%。

圖8 rAsp和胃蛋白酶對大豆分離蛋白不同水解時間產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig.8 SDS-PAGE analysis of SPI hydrolyzed by rAsp or pepsin for different time periods

圖9 rAsp和胃蛋白酶對大豆分離蛋白不同水解時間產(chǎn)物的相對蛋白含量變化Fig.9 Changes in relative protein content of SPI hydrolyzed by rAsp or pepsin for different time periods

水解終點時，ELASA檢測結(jié)果顯示，rAsp使β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的致敏性分別降低了35.9%和27.9%；而胃蛋白酶相應使其降低了26.1%和15.6%?？梢?，rAsp降低β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白致敏性的能力分別約為胃蛋白酶的1.4 倍和1.8 倍。因此，SDSPAGE圖譜、相對蛋白含量和致敏性變化結(jié)果表明，rAsp對大豆分離蛋白的水解能力明顯強于胃蛋白酶；且水解降低大豆分離蛋白致敏性的效果強于相同條件下的胃蛋白酶，具有應用于大豆蛋白深加工或作為飼料添加劑的潛力。

3 結(jié)論

本研究從T.asperellum克隆天冬氨酸蛋白酶asp基因，并使其在畢赤酵母中成功表達。在三角瓶中誘導表達時，rAsp發(fā)酵液的酶活力最高可達25.8 U/mL。rAsp的最適反應pH值為2.5，最適反應溫度為45 ℃；在pH 2.0～6.0范圍內(nèi)和低于45 ℃條件下穩(wěn)定性好。rAsp和胃蛋白酶均能很好地降解大豆分離蛋白，使β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亞基完全水解；然而，rAsp對大豆分離蛋白的水解效率比胃蛋白酶高7.7%，而且對β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白致敏性降低率分別比胃蛋白酶高9.8%和12.3%。

綜上所述，rAsp適應pH值范圍廣，特別是與動物消化系統(tǒng)酸堿環(huán)境相吻合，而且在降低和消除大豆蛋白致敏性方面具有顯著優(yōu)勢，是一種新型高效的酸性蛋白酶。本研究不僅豐富了蛋白酶庫內(nèi)容以及為大豆食品加工產(chǎn)業(yè)和相應動物飼料產(chǎn)業(yè)提供了有力支撐，也為大豆蛋白酶水解的深入研究奠定了基礎。