肖 琴，何 平，周瑞平，劉 超，袁思棋,*，趙金松,3,*

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.敘府酒業(yè)股份有限公司，四川 宜賓 644000；3.四川省酒業(yè)集團有限責任公司，四川 成都 610000）

中國白酒是世界著名蒸餾酒，由于其釀造工藝、制曲技術、生產地理環(huán)境等的不同，形成了以濃香型、米香型、醬香型、清香型為四大基本香型，衍生出多種其他香型的白酒體系[1]。其中濃香型白酒以其獨特的發(fā)酵過程和典型的風味特征如窖香濃郁、入口綿甜、回味悠長等優(yōu)點深受廣大消費群眾喜愛[2]。長期生產實踐表明窖泥質量是影響濃香型白酒風味和品質的重要因素之一，窖泥作為我國白酒釀造過程中特有的環(huán)境樣品，是一種高含水量、高腐殖質與低含氧量的特殊性土壤[3]，窖泥作為微生物的主要載體，其質量優(yōu)劣在很大程度上取決于其微生物群落組成及物種多樣性。在白酒發(fā)酵過程中，糟醅、窖泥與窖泥微生物形成一個復合有機整體，其間不斷進行著復雜的生物化學反應，產酒的同時并形成酒體風味成分。20世紀60年代起研究者們開始重視窖泥中的微生物，1964年輕工部茅臺試點組在茅臺窖池底部的窖泥中發(fā)現了產丁酸和己酸的梭狀芽孢桿菌，最終證明了己酸乙酯的確是窖底香味成分，并對濃香型白酒發(fā)展起到了促進作用[4]。由此拉開了窖泥微生物研究的序幕。此后，各酒廠、科研單位以及高校紛紛對濃香型白酒窖泥中的微生物種類、數量等進行了大量研究，發(fā)表了許多研究成果，同時也取得了很大的突破。

長期的釀酒生產實踐和科研研究結果表明，不同窖齡的窖池生產的白酒品質存在差異，白酒的酒質與窖池窖齡具有顯著相關性[5]。不同位置窖泥所處的地下深度不同、環(huán)境不同，如窖底泥長時間被黃水浸泡，趨于厭氧環(huán)境，而部分窖壁與空氣接觸時間更多一些，在封窖后才處于厭氧狀態(tài)[6]，故其已知有關質量指標才存差異，且微生物多樣性也存差異。因此，本研究以宜賓某酒廠的濃香型白酒窖泥為研究對象，對其5、10、20 a窖齡上層、中層和底層位置的窖泥進行了微生物群落結構分析，初步揭示窖泥微生物多樣性及窖泥理化性質差異與相關性，為窖泥質量多維度評估及提高白酒生產質量提供參考和啟發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

窖泥樣品取自宜賓敘府酒業(yè)5、10、20 a，每個年份隨機取窖池3 個作為平行樣。每個窖齡窖池分別從窖池壁上層、中層和底層進行無菌取樣（圖1）。上層樣從離窖口20 cm的四面池壁中心點取樣混合，分別標記為S5（S5_1～S5_3）、S10（S10_1～S10-3）、S20（S20_1～S20_3），中層樣從四個池壁面的中心點取樣混合，分別標記為Z5（Z5_1～Z5_3）、Z10（Z10_1～Z10_3）、Z20（Z20_1～Z20_3），底層樣從窖池底的4 個角和中心點取樣混合，分別標記為D5（D5_1～D5_3）、D10（D10_1～D10_3）、D20（D20_1～D20_3）。樣品用無菌袋密封后，放置于-80 ℃貯存，待用。

圖1 窖泥的取樣位置Fig.1 Sampling locations of PM

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、酒石酸鈉鉀、鉬酸銨（均為分析純）天津市大陸化學試劑廠；氯化銨（優(yōu)級純）天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化亞錫、磷酸二氫鉀、氟化銨（均為分析純）上海麥克林生化科技公司；鹽酸（分析純）成都市科隆化學品有限公司；碘化汞（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碘化鉀（分析純）廣東光華科技股份有限公司；DNeasy?PowerSoil?Pro Kit DNA抽提試劑盒 美國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

快速水分測定儀、電子分析天平 美國奧豪斯公司；紫外-可見分光光度計、旋渦混勻器 上海元析儀器有限公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；NanoDrop 2000 DNA濃度測定儀 美國Thermo Scientific公司；Centrifuge 5424離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥理化指標的測定

水分含量的測定：使用快速水分測定儀；氨態(tài)氮、有效磷的測定：參照沈怡方[7]方法；pH值的測定：參考辜楊等[8]方法。

1.3.2 樣品總DNA提取

本實驗采用DNeasy?PowerSoil?Pro Kit DNA提取試劑盒提取樣品中的總DNA，提取步驟參考試劑盒說明方法。

1.3.3 聚合酶鏈式反應擴增與測序

使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA質量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度，所有樣品均滿足測序要求，并于-80 ℃保存。將合格的DNA委托上海美吉生物公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

細菌和古菌采用通用引物515FmodF/806RmodR（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’/5’-GGACTACNVGGG TWTCTAAT-3’），擴增微生物16S RNA基因的V4可變區(qū)。

真菌引物ITS1F/ITS2R（5’-CTTGGTCATTTAGA GGAAGTAA-3’/5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’），擴增ITS1區(qū)。

擴增程序：95 ℃預變性3 min，35 個循環(huán)（真核27 個循環(huán)）（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），再72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后10 ℃保存直至反應結束。擴增體系參照向港興等[9]方法。

1.4 數據處理

微生物群落結構分析基于上海美吉生信云平臺進行繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等；理化指標等利用IBM SPSS Statistics 27和Excel 2019進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 測序及稀釋曲線分析

本研究采用Illumina MiSeq平臺對窖泥樣品的微生物群落進行測序分析，優(yōu)化后共得到1409227 條有效原核微生物序列和1289888 條有效真菌序列。利用各樣本在不同測序深度時的Shannon指數構建稀釋曲線（圖2），結果顯示隨著測序深度的增加，曲線趨于平穩(wěn)，表明測序量充足，測序數據合理。

圖2 高通量測序中原核生物（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of prokaryotes (a) and fungi (b) obtained by high-throughput sequencing

2.2 不同窖齡及位置的窖泥微生物群落結構α多樣性分析

用降噪后的序列進行α多樣性分析，得到原核微生物和真核微生物的多樣性指數（表1、2），覆蓋率均在99.9%以上，說明測序結果能覆蓋所有樣品中的微生物群落，具有較好的代表性，能真實反映樣品里物種的多樣性及豐度。從總體上看，所有樣品中原核微生物的物種多樣性和豐富度普遍高于真菌物種。

表1 不同窖齡及位置窖泥中原核微生物菌群的α多樣性分析Table 1 α-Diversity analysis of prokaryotic microflora in PM at different ages and locations of cellars

由表1可知，5 a窖泥原核微生物的多樣性（Chao1、Shannon指數）總體上均高于10 a和20 a，可能是酒廠對年輕窖池進行菌液噴灑養(yǎng)護不斷馴化窖泥，或者是年份低的窖泥微生物尚在適應釀酒環(huán)境的過程，處在不斷馴化過程，含有很多無用的釀酒微生物；同年份的窖泥，上層的Simpson指數高于中層和底層，說明中層和底層窖中的微生物群落分布更均勻；同年份中層窖泥的微生物多樣性高于上層和底層，同一位置的窖泥微生物多樣性隨著窖齡的增加，總體呈現下降趨勢，與鄧杰等[10]的研究結果基本一致，可能是隨著時間的增長，長時間的窖泥馴化和微生物動態(tài)變化、群落更替等，微生物逐漸適應窖泥微環(huán)境而形成優(yōu)勢群體，最終形成比較穩(wěn)定的窖泥微生物生態(tài)系統(tǒng)，即微環(huán)境中逐漸富集了更多有利于釀酒的原核微生物。

由表2可知，與原核微生物一樣，5 a窖泥中的真核微生物多樣性總體上高于10 a和20 a。總體上同一窖齡的上層和中層窖泥真菌多樣性與豐富度（Sobs、Chao1和Shannon指數）均高于底層窖泥，與王春艷等[11]的研究結果一致?？赡苁墙驯谥醒鯕夂扛撸训组L時間處于密封發(fā)酵，且常被黃水浸泡，處于厭氧環(huán)境，不利于好氧型真菌的生活，導致窖底窖泥真菌群落多樣性和豐度較低。隨著年份增加，真菌多樣性呈現總體下降趨勢，但其分布更加均勻。

表2 不同窖齡及位置窖泥中真菌菌群的α多樣性Table 2 α-Diversity of fungal flora in PM at different ages and locations of cellars

2.3 不同窖齡及位置窖泥微生物物種組成分析

2.3.1 基于門水平的窖泥微生物菌群結構分析

根據得到ASV在門分類水平的物種分類信息，分析樣品ASV在門分類水平的群落結構（圖3）。所有樣品中共檢測到由古菌和細菌構成的37 個門，其中32 個細菌門、5 個古菌門。共5個優(yōu)勢菌門（相對豐度≥1%），分別為厚壁菌門（Firmicutes）（69.59%）、廣古菌門（Euryarchaeota）（17.69%）、擬桿菌門（Bacteroidota）（4.35%）、Halobacterota（4.25%）、互養(yǎng)菌門（Synergistota）（1.28%）。Firmicutes是樣品中的絕對優(yōu)勢菌群，與Chen Li等[12]的研究結論基本一致，其在所有樣本中相對含量為25.15%～96.91%，且其在同一年份的不同位置中上層相對豐度最高，在5 a和10 a窖泥中層的Firmicutes含量都高于底層，而20 a窖泥中其含量在底層中略高于中層。這些變化趨勢與任海偉等[13]的結果略微不同。Firmicutes菌群是窖泥產香生酸的關鍵微生物菌群，窖泥的質量常用其豐度評價[14]。由此說明該酒廠的窖泥質量整體水平較為優(yōu)質，但是5 a窖泥中Firmicutes類微生物較低（大于20%），原因可能是在不斷的窖池養(yǎng)護中對窖泥微生物有一定影響，或者是5 a窖泥窖齡較短，微生物還處在不斷馴化過程；Euryarchaeota的變化趨勢則跟Firmicutes相反，其在同一年份的不同位置中，從上層到底層逐漸升高，在同一位置的不同窖齡窖泥中，隨著窖齡的增加含量逐漸減少，在所有樣品中的相對豐度變化范圍為1.43%～49.07%；Bacteroidota在不同年份的底層窖泥中含量較高，在D5含量達到了最高值16.11%。Cloacimonadota僅在不同窖齡的中層和底層出現，其相對豐度為0.39%～1.09%。Proteobacteria僅在S5、Z5中檢測出，占比分別為1.84%、1.32%，與Tao Yong等[15]研究認為Proteobacteria是新窖的優(yōu)勢菌門一致。

圖3 不同窖齡及位置窖泥原核微生物門水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of prokaryotic microbiota at phylum level in PM at different ages and locations of cellars

樣品真菌中共檢測出12 個門，其中子囊菌門（Ascomycota）（64.35%）、擔子菌門（Basidiomycota）（32.24%）、羅茲菌門（Rozellomycota）（19.74%）為優(yōu)勢菌門（圖4）。由圖4可知，Ascomycota在5 a和10 a窖泥中不同位置中都占絕對優(yōu)勢，而在20 a窖泥中，Basidiomycota占絕對優(yōu)勢，S20、Z20、D20中Basidiomycota相對豐度分別為59.67%、56.06%、72.91%。同一位置不同窖齡窖泥中，隨著窖齡的增長，Ascomycota相對豐度逐漸降低，如S5、S10、S20中其相對豐度分別為86.46%、78.61%、39.68%。Basidiomycota相對豐度逐漸升高，其在20 a窖齡窖泥中成為優(yōu)勢菌群。隨著窖齡的增加，Ascomycota占主導的優(yōu)勢菌群逐漸演變?yōu)锽asidiomycota占主導的優(yōu)勢菌群。Rozellomycota在D5和D10中檢測出且占優(yōu)勢（15.17%、1.18%）。以上真菌類優(yōu)勢菌群在孟靜雅等[16]的研究中也有所報道。

圖4 不同窖齡及位置窖泥真菌門水平相對豐度Fig.4 Relative abundance of fungi at phylum level in PM at different ages and locations of cellars

2.3.2 基于屬水平的窖泥微生物菌群結構分析

根據得到ASV在屬分類水平的物種分類信息，分析樣品ASV在屬分類水平的原核微生物群落結構，共得到629 個屬，其中優(yōu)勢菌屬（相對豐度≥1%）共15 個，其余未知菌和非優(yōu)勢菌屬歸為others，其相對豐度如圖5所示。在全部樣品中，相對豐度排前6的原核生物群落包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（20.57%）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）（11.63%）、梭菌屬-12（Clostridium_sensu_stricto_12）（9.57%）、己酸菌屬（Caproiciproducens）（7.34%）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）（6.06%）、氫孢菌屬（Hydrogenispora）（5.29%）。

圖5 不同窖齡及位置窖泥原核微生物屬水平相對豐度Fig.5 Relative abundance of prokaryotic microbiota at genus level in PM at different ages and locations of cellars

由圖5可知，在5 a上層窖齡窖泥細菌類微生物未知菌類豐度比其他窖齡窖泥更加豐富；10、20 a上層窖泥中Lactobacillus均占絕對優(yōu)勢，隨著年份的增長其豐度也在增加，分別為69.76%、73.72%。在總體上，在同一年份中，Lactobacillus相對含量隨著窖池深度的增加而減少，與Wang Chuandong等[17]報道的結果相同。研究表明，隨著窖泥質量的提高，窖泥中的Lactobacillus含量會降低[18]，而本研究中窖齡長的上層窖泥中其含量很高，可能是因為老窖池在長期的使用過程窖泥脫落，后窖泥的養(yǎng)護過程中重新增補了新窖泥；Caproiciproducens是優(yōu)勢菌屬，在3 個窖齡窖泥中層含量較高，在Z20中相對豐度高達16.05%，其產生的己酸等對Lactobacillus有抑制作用，導致Caproiciproducens相對含量高的樣品Lactobacillus相對含量就低[19-20]。Clostridium_sensu_stricto_12含量隨著窖泥位置的下移逐漸增加，隨著窖齡的增加而增加，此類菌可形成濃香型白酒中具有代表性的香氣成分；Hazenella為5 a窖齡窖泥中的特有優(yōu)勢菌屬，其在上、中、下層的相對豐度分別是4.68%、3.54%、0.43%，而在黃瑩娜等[21]研究中Hazenellas特有存在23 a的窖泥中。甲烷絲菌屬（Methanosaeta）僅在20 a的中層和底層中檢出，推測此菌在濃香型窖泥老熟過程有著積極作用；Methanobacterium在不同年份的底層占比較高，在D5樣品中相對豐度最高為30.36%，甲烷菌與己酸菌共生有利于產出濃香型白酒主體香己酸乙酯的前體物質己酸[22]。沉積菌屬（Sedimentibacter）在全部樣品中均檢測出，且在窖齡較長的10 a和20 a中占比較高，相關研究表明其在老窖泥中常作為優(yōu)勢菌存在，其能與甲烷菌共生，且有降解氨基酸生成乙酸、氨態(tài)氮等小分子的能力[23]。本研究發(fā)現的Lactobacillus、Sedimentibacter、Caproiciproducens等優(yōu)勢菌屬也廣泛存在于其他地區(qū)的窖泥中[24-26]。除前述6 個優(yōu)勢菌屬外，其他的優(yōu)勢菌屬，如Aminobacterium、Syntrophomonas也在很多文章中被報道過，且在窖齡長、質量高的窖泥中這類菌的含量較多[27]。

本研究原核生物類群注釋結果顯示，窖池內的不同位置的原核生物類群各絕對優(yōu)勢物種有顯著差異，各微生物類群的含量有顯著差異，且不同窖齡的窖泥中可能出現稀有菌群。由此可見，不同窖齡和位置對窖泥的原核生物類群物種分布有著不同程度的影響。

根據得到ASV在屬分類水平的物種分類信息，分析樣品ASV在屬分類水平的真核微生物群落結構，共得到282 個屬，其中優(yōu)勢菌屬（相對豐度≥1%）共15 個，其余未知菌和非優(yōu)勢菌屬歸為others，其相對豐度如圖6所示。屬水平的微生物群落及其相對豐度分別為未分類雙足囊菌科（unclassified_f__Dipodascaceae）（21.0%）、未分類曲霉科（unclassified_f__Aspergillaceae）（15.43%）、Apiotrichum（13.21%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces（10.07%）、Cryptococcus_f__Tremellaceae（7.93%）、Trichosporon（6.77%）、Cutaneotrichosporon（3.31%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（3.11%）、紅曲霉（Monascus）（2.22%）、unclassified_p__Rozellomycota（1.92%）、Debaryomyces（1.91%）、Botrytis（1.67%）等，各組的注釋度分別為S5（88.34%）、Z5（90.81%）、D20（91.14%）、S10（87.79%）、Z10（89.39%）、D10（94.76%）、S20（94.38%）、Z20（91.41%）、D20（92.76%）。對各樣品的注釋度比較可知，總體來說，每年份底層窖泥的注釋度較高則未知真菌少，而每年份上層的注釋度較低其已知真菌少，與孟靜雅等[16]的研究結果基本相同。各組樣品相比較，unclassified_f__Dipodascaceae在各年份中隨著窖泥空間位置的下移，其相對豐度也降低，全部樣品中其豐度在S10中達到了最高值51.87%；不同年份的組成差異較大，有些菌類僅在某幾個樣品中檢出，如Monascus僅在5 a的上、中、下層中檢測出，其相對含量分別為8.45%、7.12%、4.42%，紅曲霉能突出己酸乙酯的主體香，使得酒體豐滿協(xié)調[28]；Botrytis僅在D5和D10中檢測出，其豐度分別為1.94%和13.09%；Saccharomyces在5 a和10 a窖泥中均未檢出，在20 a窖泥中檢出，但在上層和中層窖泥中含量都很低（小于1%），而在底層含量則高達5.49%。

圖6 不同窖齡及位置窖泥真核微生物屬水平相對豐度Fig.6 Relative abundance of eukaryotic microbiota at genus level in PM at different ages and locations of cellars

由圖6可知，不同窖齡的絕對優(yōu)勢菌群不同，5 a窖泥的優(yōu)勢菌群是unclassified_f__Aspergillaceae，10 a是未分類雙足囊菌科（unclassified_f__Dipodascaceae），20 a是Apiotrichum。窖泥中的真菌主要由酵母菌和霉菌組成，研究表明酵母類真菌在白酒發(fā)酵過程中對乙醇、有機酸和多類酯產生有重要作用[29]。孟雅靜等[16]研究得出新老窖泥的真菌組成差異并不明顯，而本研究結果表明，不同窖齡的窖泥優(yōu)勢真菌存在明顯差異，且不同的窖齡可能會出現個別稀有物種。窖池內的不同位置各絕對優(yōu)勢物種沒有顯著差異，但各物種的含量有些許差異，且不同位置可能出現稀有菌群。由此可見，窖池窖齡及窖泥所在空間位置環(huán)境均可在一定程度上影響真菌群落結構分布和演替規(guī)律。

2.4 不同窖齡及位置窖泥差異微生物分析

為進一步分析不同分組窖泥微生物的差異，利用線性判別分析效應量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析組間的差異微生物，并輸出線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）柱狀圖，LDA柱狀圖展現了各組中具有顯著差異的微生物，柱長度代表差異物種的影響值大小。如圖7所示，在屬水平全部組別共檢測出12 種（LDA＞4）差異原核微生物，其中S5中的差異物種為unclassified_o__Bacillales、Hazenella；D5中的差異物種為嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）、Petrimonas；D10中的差異物種為Aminobacterium、Syntrophomonas；S20中的差異物種為Lactobacillus；Z20中的差異物種為norank_f__norank_o__Proteinivoracales、Caproiciproducens；D20中的差異物種為RumEn_M2、Syntrophaceticus、Methanoculleus。

由圖8可知，全部樣品中檢測出的差異真菌物種共15 種（LDA＞2）。Z5中的差異微生物為曲霉目（Eurotiales）；D5中的差異微生物為Aspergillaceae、Basidiomycota、unclassified_f__Aspergillaceae；S10中的差異微生物為雙足囊菌屬（Dipodascus）；S20中的差異微生物為Cutaneotrichosporon、絲孢酵母目（Trichosporonales）、Trichosporonaceae；D20中差異微生物為Tremellales、Apiotrichum、Cryptococcus_f__Tremellaceae、Tremellaceae、Tremellomycetes、Tremellaceae。

圖8 真菌LEfSe多級物種層級樹圖（a）和LDA柱形圖（b）Fig.8 LEfSe multi-level species hierarchical tree (a) and LDA plot (b) of fungi

樣品間的差異微生物分析結果表明，原核差異微生物在個別窖泥樣品中獨特存在，如5 a窖泥中的Hazenella，而10 a和20 a窖泥樣品中，某些差異微生物相對含量較低，如Aminobacterium、Syntrophomonas、Methanoculleus等，也有含量相對高差異微生物，如Lactobacillus。以上差異微生物的代謝產物對白酒的風味物質的來源和代謝途徑有重要作用。真菌差異微生物也是白酒釀造過程中有重要作用為生物類群，如Aspergillaceae、unclassified_f__Aspergillaceae等。由此可以推測，不同窖齡的窖泥有其差異原核和真核微生物存在，在釀酒過程中產生的代謝物也有所差異，從而影響窖泥質量，進而生產的白酒原酒質量有所差異。

2.5 不同窖齡及位置窖泥理化指標的差異

理化指標在一定程度上能較好反映出窖泥的質量，也是目前評價窖泥質量優(yōu)劣的重要指標。利用SPSS軟件采用單因素方差分析，比較了樣品中的理化指標差異。由表3可知，同一年份的窖泥隨著窖池深度的增加（位置從上至下），水分含量先升高后降低，總體上，年份越久，水分含量越高；全部樣品中窖泥都偏酸性，pH值變化范圍為3.66～5.20，5 a份的窖泥pH值總體比10、20 a的老窖泥高，10、20 a不同位置窖泥pH值無顯著差異，而S5和Z5具有顯著差異；pH值和氨態(tài)氮的變化趨勢相同，10 a和20 a窖泥其值都隨著位置從上至下先增加后降低，而5 a窖泥隨著窖泥位置從上至下，其pH值和氨態(tài)氮值逐步增大，可能是窖齡較低，窖泥還處在發(fā)展階段?？傮w上，氨態(tài)氮含量隨著窖泥窖齡的增加逐步增加，氨態(tài)氮含量在Z20時達到了最大值26.24 mg/100 g，微生物的自身生長繁殖、蛋白質和酶類等合成需要氨態(tài)氮，氨態(tài)氮含量對窖泥微環(huán)境維持和酒質提升有非常重要的作用。有效磷含量在同一年份不同位置窖泥中，隨著窖泥空間位置從上至下逐步升高，且均具有顯著差異（P＜0.05），對于同一位置不同年份的窖泥，隨著其窖齡的增加，有效磷含量先增加后降低（表3）。根據趙長青等[30]對窖泥理化評定表，一級、二級、三級窖泥質量中的有效磷含量分別為150～300、50～149 mg/100 g和＜50 mg/100 g，可知本研究10 a和20 a窖齡中層和底層窖泥中的有效磷含量達到了高質量窖泥的標準，而對應的窖池上層位置窖泥樣品中有效磷含量均較低，可被認為是窖泥質量較低。因此，窖齡長短和窖泥空間位置均對窖泥的質量有顯著影響，從而反映出在日常生產過程中改善相應的釀造工藝或者營養(yǎng)物質配比，保證窖泥微生物群落處于有效動態(tài)平衡。

表3 不同窖齡及位置窖泥理化性質Table 3 Physicochemical properties of PM at different ages and locations of cellars

2.6 窖泥理化指標與微生物的相關性分析

不同窖齡及位置窖泥之間理化指標的差異可能是影響窖泥微生物生長代謝或其功能的因素[31]。利用冗余分析（redundancy analysis，RDA），分析窖泥理化指標與微生物之間的相關性。圖9展示了窖泥微生物屬水平中相對豐度前5的原核、真核微生物與窖泥理化指標之間的關系，原核生物2 個主成分的總解釋度為29.27%，真核生物2 個主成分的總解釋度為27.39%。

圖9 原核微生物（a）和真菌（b）與理化指標的RDAFig.9 Redundancy analysis of prokaryotic microorganisms (a) and fungi (b) with physicochemical properties

由圖9a所示，原核微生物中的Lactobacillus與水分、pH值、氨態(tài)氮、有效磷呈負相關，與張明珠等[32]的研究結果基本一致。Methanobacterium、Clostridium_sensu_stricto_12、Caproiciproducens、Methanobrevibacter與水分、pH值、氨態(tài)氮、有效磷呈正相關。S5、S10和S20與理化指標呈負相關，而其他位置樣品與理化指標呈正相關，這表明這些理化指標對窖泥原核微生物分布影響較大，尤其是區(qū)分上、下部窖泥樣品，與胡曉龍等[33]的研究結果一致。由圖9b可知，真核微生物中unclassified_f__Dipodascaceae與水分、pH值、氨態(tài)氮呈負相關，unclassified_f__Aspergillaceae、Thermomyces與pH值呈正相關，而與水分、氨態(tài)氮和有效磷呈負相關。Cryptococcus_f__Tremellaceae、Apiotrichum與4 個理化指標都呈正相關。

3 結論

本研究對5、10 a和20 a窖齡窖泥上、中、底層空間位置的原核和真核微生物群落結構及其理化指標進行了比較分析，聯(lián)合使用了高通量測序中較新的ASV分析流程和LEfSe方法，并結合數理分析法研究了窖泥原核微生物和真核微生物與理化指標之間的關系。結果表明：1）窖泥的真菌微生物物種多樣性和豐富度普遍低于原核微生物；2）5 a窖泥原核微生物多樣性總體上高于10 a和20 a窖泥。3）同一窖齡的中層窖泥原核微生物多樣性高于上層和底層，而上層和中層的真核微生物多樣性高于底層窖泥，即不同空間位置窖泥的微生物多樣性有較大區(qū)別，同一窖齡的不同位置窖泥質量也有區(qū)別。4）窖泥微生物的組成方面，在門水平上，原核微生物共有5 個優(yōu)勢菌門，真核微生物有3 個優(yōu)勢菌門；在屬水平上，原核和真核微生物均檢出15 個優(yōu)勢菌屬。其中原核微生物中的Lactobacillus在10 a和20 a窖泥樣品中的上層占絕對優(yōu)勢，在5 a窖齡窖泥中檢測到特有Hazenellas微生物類群；不同窖齡的窖泥真核微生物具有不同的絕對優(yōu)勢菌群。5）LEfSe發(fā)現，不同窖齡及位置的窖泥在屬水平上共檢出15 種差異原核微生物和5 種差異真核微生物。6）理化分析結果表明，同一窖齡的不均一性空間位置的窖泥在4 個理化指標方面均呈顯著差異；結合RDA發(fā)現，水分含量、pH值和氨態(tài)氮分別與屬水平總豐度前5的原核和真核微生物顯著相關，即Lactobacillus、unclassified_f__Aspergillaceae、Thermomyces與水分、氨態(tài)氮和有效磷呈負相關，Methanobacterium、Clostridium_sensu_stricto_12、Caproiciproducens、Methanobrevibacter、Cryptococcus_f__Tremellaceae、Apiotrichum與水分、pH值、氨態(tài)氮、有效磷呈正相關。

綜上，本研究系統(tǒng)測定了不同位置深度、不同窖齡窖泥的理化指標與原核和真核微生物菌群，相關結果發(fā)現不同空間位置和窖齡的窖泥樣品中優(yōu)勢微生物存在較大差異，且理化指標與窖泥優(yōu)勢微生物存在顯著相關。研究表明總體上窖齡長的窖泥質量高，但在10 a和20 a窖齡上層窖泥中，微生物Lactobacillus豐度高、有效磷含量偏低說明了窖齡長的窖池上層窖泥質量存在退化現象，故窖泥質量優(yōu)劣的判斷需要綜合考慮空間位置、整個窖池的發(fā)酵效果及原酒酒體質量整體判別。本研究豐富了窖泥不同維度原核和真核微生物的研究，對于指導窖泥的日常養(yǎng)護、制作優(yōu)質窖泥和老熟提供了一定的理論參考。