鄭 雪，梁 琪,* ，宋雪梅，張 炎

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

甘南地區(qū)位于甘肅省西南部，具有獨(dú)特的地理環(huán)境和生物多樣性[1-2]。牦牛是甘南藏區(qū)牧民的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源和生活支柱，傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳是以牦牛乳為原料經(jīng)傳統(tǒng)方法制作而成的特色牦牛乳制品，在長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)自然馴化使傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳中具有豐富的乳酸菌[3-4]，從中篩選得到的融合魏斯氏菌（Weissella confusa）ZW21具有較強(qiáng)的抑菌、抗氧化等功能活性。

融合魏斯氏菌屬乳桿菌目（Lactobacillales）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、魏斯氏菌屬（Weissella），是一類有益乳酸菌[5]。其生物學(xué)特性為一種兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，過(guò)氧化氫酶陰性，菌體形態(tài)呈桿狀或球狀[6]。魏斯氏菌屬的微生物已被國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)列入發(fā)酵食品用菌種名單[7]，德國(guó)科學(xué)基金會(huì)食品安全委員會(huì)也驗(yàn)證了其在傳統(tǒng)食品發(fā)酵中的使用[8]。該菌屬微生物多存在于酸奶、泡菜等各種發(fā)酵食品中[9]，也定植于人體和動(dòng)物的腸道中[10-11]，具有避免腸道感染、促進(jìn)消化吸收、降低膽固醇以及癌癥發(fā)病率等作用[12]。研究表明，W.confusa可產(chǎn)生胞外多糖，具有抗氧化和抗炎等功能特性[13]。此外，W.confusa還具有產(chǎn)細(xì)菌素的潛力，Tenea等[14]從W.confusaCys2-2中分離得到的細(xì)菌素對(duì)沙門氏菌等革蘭氏陰性致病菌均具有明顯的抑制作用；Malik等[15]通過(guò)全基因組測(cè)序從W.confusaMBF8-1發(fā)現(xiàn)產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒pWcMBF8-1，具有編碼3 種抗菌肽相關(guān)基因。

全基因組測(cè)序技術(shù)可通過(guò)對(duì)生物體進(jìn)行測(cè)序得到其全基因組序列，進(jìn)而分析物種間的相互作用和物種進(jìn)化關(guān)系，從分子層面對(duì)生物體進(jìn)行解讀，從而挖掘功能基因，為篩選優(yōu)良菌株奠定基礎(chǔ)[16]。本課題組前期從傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳中分離獲得功能活性突出的W.confusaZW21，擬從基因組學(xué)層面挖掘該菌的功能基因和代謝通路，以揭示該菌株的關(guān)鍵基因。本研究采用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)W.confusaZW21進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，并利用基因功能（Gene Ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、蛋白質(zhì)直系同源簇（Clusters of Orthologous Groups，COG）、非冗余蛋白（Non-Redundant Protein，NR）、碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZy）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫(kù)（Transporter Classification Database，TCBD）、Swiss-Prot和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋，從基因水平揭示W(wǎng).confusaZW21的關(guān)鍵功能基因，旨在為其抗菌機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

W.confusaZW21由甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室前期從甘南牦牛發(fā)酵乳中分離并保存。

MRS培養(yǎng)基、MRS瓊脂 北京索萊寶科技有限公司；NEBNext?Ultra? DNA文庫(kù)制備試劑盒 美國(guó)NEB公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop超微量核酸蛋白測(cè)定儀 上海光譜儀器有限公司；Qubit 2.0核酸蛋白定量?jī)x 美國(guó)Invitrogen公司；Covaris超聲波細(xì)胞/核酸破碎儀 美國(guó)Covaris公司；2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；Illumina Nova Seq PE150全基因組測(cè)序系統(tǒng) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

-80 ℃冷凍保存的W.confusaZW21采用平板劃線法在MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化后，挑取單菌落至MRS液體培養(yǎng)基中純化，37 ℃培養(yǎng)12 h后離心去除上清液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)以及文庫(kù)構(gòu)建。

采用十二烷基硫酸鈉法提取W.confusaZW21基因組DNA。提取的基因組DNA利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀、核酸蛋白定量?jī)x和0.35%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度、濃度和完整性檢測(cè)。

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

選取提取的1 μg DNA作為DNA樣本制備材料。使用NEBNext?Ultra? DNA文庫(kù)制備試劑盒生成測(cè)序文庫(kù)，并將索引代碼添加到每個(gè)樣品的屬性序列。檢測(cè)合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約為350 bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫(kù)制備。文庫(kù)構(gòu)建完成后，首先使用核酸蛋白定量?jī)x進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至2 ng/μL，隨后使用生物分析儀對(duì)文庫(kù)的Insert Size進(jìn)行檢測(cè)，Insert Size符合預(yù)期后，使用實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度大于3 nmol/L），以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后使用Illumina Nova Seq PE150全基因組測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行W.confusaZW21全基因組測(cè)序。

1.3.3 功能原件分析及全基因組圖譜繪制

過(guò)濾除去低質(zhì)量和長(zhǎng)度過(guò)短的reads后，對(duì)過(guò)濾后的reads進(jìn)行從頭組裝，并對(duì)組裝后的draft基因組進(jìn)行糾錯(cuò)，之后使用SOAPde novo、Abyss、SPAdes拼接工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行組裝并使用CISA軟件整合3 個(gè)軟件的組裝結(jié)果。

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編碼基因、非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）、基因島、重復(fù)序列等預(yù)測(cè)。其中使用基因組工具Prokka對(duì)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）進(jìn)行預(yù)測(cè)及過(guò)濾；核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer ribonucleic acid，tRNA）、細(xì)菌非編碼小RNA（small non-coding RNA，sRNA）分別使用rRNAmmer、tRNAscan-SE、Rfam軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；轉(zhuǎn)座子使用Transposon PSI軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；基因島通過(guò)Island Viewer 4（http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/）網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)；重復(fù)序列采用Repeat Masker軟件（verison 4.0.5）進(jìn)行預(yù)測(cè)。

將基因組序列、基因組預(yù)測(cè)及RNA預(yù)測(cè)信息整合成gbk（GeneBank）文件，隨后采用cgView（https://proksee.ca/）繪制全基因組圖譜。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

采用GO（http://geneontology.org/）、KEGG（https://www.kegg.jp/）、COG（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/）、NR（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/）、TCDB（http://www.tcdb.org/）、CAZy（http://www.cazy.org/）、Pfam（http://pfam.xfam.org/）和Swiss-Prot（http://www.ebi.ac.uk/uniprot）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)W.confusaZW21編碼基因進(jìn)行功能注釋。

1.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將W.confusaZW21測(cè)序的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST同源性分析，選取相似性99%以上的序列利用MEGA 7.0軟件使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 W. confusa ZW21基因組組裝及基因組組分

ZW21染色體基因組大小為2.44 M b，總長(zhǎng)度為2224179 bp，GC含量為45.66%。如表1所示，W.confusaZW21全基因組中編碼基因總長(zhǎng)度為1947771 bp，有2175 個(gè)編碼基因，平均長(zhǎng)度為896 bp，占基因組的87.57%；轉(zhuǎn)座子30 個(gè)，總長(zhǎng)度為1908 bp，平均長(zhǎng)度64 bp，占基因組的0.086%；長(zhǎng)散在重復(fù)序列40 個(gè)，總長(zhǎng)度為2415 bp，平均長(zhǎng)度61 bp，占基因組的0.109%；短分散重復(fù)序列18 個(gè)，總長(zhǎng)度為1122 bp，平均長(zhǎng)度62 bp，占基因組的0.050%；tRNA 78 個(gè)，總長(zhǎng)度為5916 bp；基因島 5 個(gè)，總長(zhǎng)度為48800 bp。

表1 W. confusa ZW21基因組Table 1 Genome statistics of W. confusa ZW21

由圖1可知，W.confusaZW21的基因組最內(nèi)圈（第1圈）是基因組序列位置坐標(biāo)，其后由內(nèi)而外第2～3圈分別為基因組GC Skew值分布、基因組GC含量，最外部2 圈為ncRNA及編碼序列（coding DNA sequence，CDS），其中內(nèi)圈為正鏈、外圈為反鏈。

圖1 W. confusa ZW21全基因組圖譜Fig.1 Whole genome map of W. confusa ZW21

2.2 W. confusa ZW21基因注釋

對(duì)預(yù)測(cè)得到的編碼基因在GO、KEGG、COG、NR、TCDB和CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，如表2所示，W.confusaZW21在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中共注釋到1445 個(gè)基因，在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中共注釋到1377 個(gè)基因，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共注釋到1817 個(gè)基因，在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中共注釋到2106 個(gè)基因；在TCDB中共注釋到219 個(gè)基因；在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中共注釋到77 個(gè)基因。

表2 W. confusa ZW21基因功能統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of gene functions of W. confusa ZW21

2.2.1 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

GO數(shù)據(jù)庫(kù)分為細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過(guò)程（biological process，BP）3 類。如圖2所示，W.confusaZW21在GO分類中共有1445 個(gè)基因被注釋，其中CC中富集基因數(shù)量最多的前3 個(gè)功能條目分別為大分子復(fù)合物、細(xì)胞和細(xì)胞部分；MF中轉(zhuǎn)運(yùn)活性、催化活性和結(jié)合是基因數(shù)量最多的功能條目；BP中得到最多注釋的前3 個(gè)功能條目為代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和定位。其中，與抗氧化活性相關(guān)的基因ID分別為GM000507、GM000577、GM001988，涉及免疫系統(tǒng)相關(guān)基因ID分別為GM000354、GM000169、GM000122、GM000963、GM001770。

圖2 W. confusa ZW21基因功能注釋GO功能分類Fig.2 GO functional classification of W. confusa ZW21 gene functional annotation

2.2.2 COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

COG數(shù)據(jù)庫(kù)是根據(jù)細(xì)菌、藻類和真核生物完整基因組的編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類構(gòu)建而成。通過(guò)比對(duì)可以將蛋白序列注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)而推測(cè)該序列的功能。如圖3所示，W.confusaZW21共有1377 個(gè)基因被注釋，分布于23 個(gè)COG條目中。參與復(fù)制、重組和修復(fù)的基因有93 個(gè)，參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成的基因有183 個(gè)，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因有83 個(gè)，參與碳水化合物運(yùn)輸和代謝的基因有129 個(gè)，參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的基因有113 個(gè)。

圖3 W. confusa ZW21基因功能注釋COG功能分類Fig.3 COG functional classification of W. confusa ZW21 gene functional annotation

注釋結(jié)果表明W.confusaZW21具有參與合成MFS（major facilitator superfamily）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的序列（Atg22家族），基因編號(hào)為GM 000025；以及合成膜蛋白的功能序列（DUF1440家族），基因編號(hào)為GM000592。

2.2.3 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)將生物通路劃分為8 類，將W.confusaZW21的氨基酸序列與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將目標(biāo)物種的基因與其相對(duì)應(yīng)的功能注釋信息結(jié)合。W.confusaZW21菌株在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有1817 個(gè)基因分別注釋到細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝、組織系統(tǒng)6 大功能的35 個(gè)通路。如圖4所示，W.confusaZW21在代謝途徑和遺傳信息處理得到較多的基因功能注釋。其中，817 個(gè)基因注釋到代謝通路，在12 個(gè)代謝通路中，碳水化合物代謝相關(guān)的基因?yàn)?18 個(gè)，占代謝通路注釋基因的14.44%；131 個(gè)基因在環(huán)境信息處理層面得到注釋，其中與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因?yàn)?3 個(gè)，與膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因?yàn)?8 個(gè)。

圖4 W. confusa ZW21基因功能注釋KEGG代謝通路圖Fig.4 KEGG metabolic pathways of W. confusa ZW21 gene functional annotation

表3所示為W.confusaZW21在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的關(guān)于免疫相關(guān)基因及其通路信息。W.confusaZW21基因組中包含參與抗生素、生物降解等代謝過(guò)程的基因，以及可調(diào)控免疫和炎癥通路（包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR））的組織系統(tǒng)通路相關(guān)基因。此外，W.confusaZW21基因組還含有可調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌感染的通路map05150，涉及5 種相關(guān)基因（GM000756、GM001068、GM001069、GM001070和GM001071），在感染疾病通路水平上參與拮抗金黃色葡萄球菌感染。W.confusaZW21中基因GM001319參與原核生物糖代謝調(diào)控，參與新霉素、卡那霉素和慶大霉素等抗生素的生物合成；基因GM001149、GM001154、GM001155、GM00115參與單內(nèi)酰胺類抗生素的生物合成；基因GM000115、GM001122、GM001123參與靈菌紅素生物合成；基因GM000057、GM001133、GM001319參與鏈霉素生物合成。W.confusaZW21中GM000458和GM001545參與PPAR信號(hào)通路的調(diào)控。W.confusaZW21中1 個(gè)基因（GM002091）參與NLR信號(hào)通路的調(diào)控。此外，W.confusaZW21還存在編碼抗葉酸的基因，包括GM001745、GM000317、GM001606、GM000868。

表3 W. confusa ZW21基因組抗菌和免疫調(diào)控通路及其相關(guān)基因Table 3 Genes related to antibacterial activity and immune regulatory pathways in the genome of W. confusa ZW21

2.2.4 NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋及系統(tǒng)發(fā)育分析

N R 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果中包含有物種信息，可用于物種分類。如圖5A所示，有1739 個(gè)基因注釋為W.confusa?；贜CBI數(shù)據(jù)庫(kù)已知的W.confusa全基因組和W.confusaZW21全基因組，采用MAGE 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖5B所示，W.confusaZW21與W.confusaN17的親緣關(guān)系最近，因此，將其鑒定為1 株融合魏斯氏菌。

圖5 W. confusa ZW21 NR注釋（A）及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（B）Fig.5 NR annotation (A) and phylogenetic tree (B) of W. confusa ZW21

對(duì)W.confusaZW21潛在的細(xì)菌素基因進(jìn)行挖掘，如表4所示，W.confusaZW21含有8 個(gè)編碼細(xì)菌素相關(guān)基因。其中，2 個(gè)編碼大腸菌素V基因（GM000070、GM001948），1 個(gè)編碼含雙甘氨酸前導(dǎo)肽的II類細(xì)菌素基因（GM001064），1 個(gè)編碼ABC型抗菌肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因（GM001172），1 個(gè)編碼桿菌肽抗性蛋白BacA的基因（GM001752），1 個(gè)編碼乳球菌素家族的基因（GM000397），1 個(gè)編碼羊毛硫抗生素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白nisF的基因（GM002164），以及1 個(gè)編碼ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合蛋白EcsA的基因（GM000146），證明該菌具有合成并分泌細(xì)菌素的潛力。

表4 W. confusa ZW21潛在的細(xì)菌素基因Table 4 Potential bacteriocin related genes of W. confusa ZW21

2.2.5W.confusaZW21大腸菌素序列分析

將W.confusaZW21大腸菌素的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，如圖6所示，W.confusaZW21與W.confusaLBAE C39-2的大腸菌素生產(chǎn)蛋白序列（WP_003609935.1）完全相同。

圖6 W. confusa ZW21菌株大腸菌素核苷酸序列翻譯（A）及氨基酸序列比對(duì)（B）Fig.6 Nucleotide sequence translation (A) and amino acid sequence alignment (B) of colicin from W. confusa ZW21

2.2.6 TCDB數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

TCDB數(shù)據(jù)庫(kù)是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫(kù)，將W.confusaZW21的氨基酸序列與TCDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖7所示。ZW21存在初級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白123 個(gè)、電化學(xué)電位驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白61 個(gè)。

圖7 W. confusa ZW21 TCDB注釋Fig.7 TCDB annotation of W. confusa ZW21

2.2.7 CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

如圖8所示，W.confusaZW21共有77 個(gè)基因被注釋，其中碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因17 個(gè)、糖酯酶基因2 個(gè)、糖苷水解酶基因35 個(gè)、糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因23 個(gè)。

圖8 W. confusa ZW21 CAZy注釋Fig.8 CAZy annotation of W. confusa ZW21

3 討論

細(xì)菌素是由包括乳酸菌在內(nèi)的一些微生物產(chǎn)生的一類強(qiáng)效抗菌肽，一般由核糖體合成，主要對(duì)親緣關(guān)系較近的細(xì)菌及部分食源性致病菌發(fā)揮抗菌活性。因其高效、廣譜、安全的特性，目前被認(rèn)為是抗生素的有效替代品[17-18]。本研究通過(guò)對(duì)1 株從發(fā)酵牦牛乳中分離得到的W.confusaZW21進(jìn)行全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，解析了W.confusaZW21的基因組結(jié)構(gòu)和具體功能。通過(guò)NR、Pfam、Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫(kù)在W.confusaZW21基因組中共注釋得到包括大腸菌素V和乳球菌素家族在內(nèi)的5 種已知的細(xì)菌素相關(guān)基因。大腸菌素主要通過(guò)破壞敏感靶細(xì)胞的膜電位抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有良好的抑制作用[19]。W.confusaZW21全基因組中包含編碼大腸菌素VcvpA基因（GM000070、GM001948）、賦予該菌株大腸菌素V抗性的桿菌肽抗性蛋白BacA的基因（GM001752）[20]、編碼參與大腸菌素分泌的含雙甘氨酸前導(dǎo)肽的II類細(xì)菌素基因（GM001064）。由于大腸菌素V符合革蘭氏陽(yáng)性菌中II類細(xì)菌素的定義[21]，早在1997年Van Belkum等[22]研究提出雙甘氨酸型前導(dǎo)肽是II類細(xì)菌素分泌所必需，這表明W.confusaZW21具有分泌大腸菌素V的能力。Goh等[23]從W.confusaA3中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)大腸菌素V的基因，Amari等[24]在W.confusaLBAE C39-2中也發(fā)現(xiàn)大腸菌素V的基因，本研究將W.confusaZW21翻譯得到的蛋白序列與W.confusaA3和W.confusaLBAE C39-2產(chǎn)生的V族大腸菌素進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，3 株菌株的產(chǎn)大腸菌素V的序列完全相同。此外，本研究在W.confusaZW21基因組中發(fā)現(xiàn)編碼乳球菌素家族（GM000397）、羊毛硫抗生素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白nisF（GM002164）及ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合蛋白EcsA（GM000146）的基因，表明該菌株可能具有產(chǎn)生乳球菌素的潛力。乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，具有顯著抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的能力[25]。其抗菌機(jī)制是穿過(guò)病原菌的細(xì)胞膜，增加其滲透性，導(dǎo)致離子流失以及膜電位消耗，最終導(dǎo)致病原菌的死亡[26]。此外，在該菌株中還發(fā)現(xiàn)了編碼ABC型抗菌肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因（GM001172），可能參與上述兩種細(xì)菌素的分泌。Horn等[27]發(fā)現(xiàn)1 株具有分泌乳球菌素和大腸菌素V能力的乳酸乳球菌。本研究結(jié)果也顯示W(wǎng).confusaZW21具有聯(lián)產(chǎn)大腸菌素V和乳球菌素的能力，表明其具有對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的廣泛抑制能力。

課題組前期研究表明W.confusaZW21具有抗氧化活性，這與W.confusaZW21的抗氧化基因密切相關(guān)。通過(guò)GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，W.confusa有3 個(gè)基因參與抗氧化過(guò)程，5 個(gè)基因參與免疫過(guò)程。COG注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)參與合成膽汁耐受基因（MFS型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能Atg22序列）和耐酸基因（DUF1440家族序列），與W.confusaZW21的耐酸、耐膽鹽特性相吻合[28]。此外，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果表明，W.confusaZW21基因組注釋到調(diào)控免疫和炎癥的PPAR和NLR通路，其中PPAR信號(hào)通路與能量代謝、細(xì)胞分化、增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[29]；NLR可以通過(guò)識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁成分、微生物毒素等外源物質(zhì)進(jìn)而參與拮抗入侵細(xì)菌，且被證明與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[30]。W.confusaZW21還含有編碼抗葉酸相關(guān)基因，抗葉酸是第一類抗代謝藥物，已被證明在治療癌癥和炎癥性疾病中有效[31]。已有研究證實(shí)，W.confusa的存在可減輕炎癥反應(yīng)，具有成為抗感染強(qiáng)效治療劑的潛力[32-33]和預(yù)防癌細(xì)胞增殖的功能[34]。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)1 株牦牛發(fā)酵乳源W.confusaZW21進(jìn)行全基因組測(cè)序，從基因?qū)用鎸?duì)該菌株的抗菌機(jī)理進(jìn)行解析。結(jié)果表明，W.confusaZW21基因組大小為2.44 Mb，有2175 個(gè)編碼基因；W.confusaZW21含有8 種細(xì)菌素相關(guān)基因，具有合成大腸菌素V及乳球菌素的潛力，其產(chǎn)生的細(xì)菌素分別對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌具有抑制作用；除合成基因外，該菌株還具有參與細(xì)菌素分泌及賦予菌株細(xì)菌素抗性的基因，證明該株W.confusaZW21具有分泌細(xì)菌素且不被自身所分泌的細(xì)菌素殺滅的能力。但目前極少有關(guān)于W.confusa產(chǎn)大腸菌素的報(bào)道，因此其產(chǎn)生及分泌的機(jī)制仍不清楚。本研究對(duì)W.confusaZW21的全基因組測(cè)序分析豐富了W.confusa的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，后續(xù)可通過(guò)代謝組學(xué)的方法深入研究該菌株分泌大腸菌素及乳球菌素的代謝通路，探索其產(chǎn)生機(jī)制及其對(duì)致病菌的抑菌機(jī)理，并進(jìn)一步對(duì)W.confusaZW21所產(chǎn)細(xì)菌素的安全性進(jìn)行評(píng)估，為推進(jìn)該菌株在食品保鮮及防腐方面的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。