趙亞娜，郭江濤，周田田，李孟昊，李會(huì)珍

（1.中北大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西 太原 030051；2.中北大學(xué)晉中產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，山西 晉中 030600；3.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）菏澤分院，山東 菏澤 274000）

紫蘇（Perilla frutescensL.）是唇形科一年生草本植物，為亞洲特有植物資源，在我國(guó)已有2000多年栽培歷史，是衛(wèi)生部首批頒布的60 種藥食同源類作物之一。作為傳統(tǒng)中草藥，紫蘇具有散寒解暑、潤(rùn)肺止咳、健胃鎮(zhèn)靜和治療感冒頭痛等功效，蘇梗、蘇葉、蘇籽均可入藥[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紫蘇還具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌和免疫調(diào)節(jié)等功效[3-5]。紫蘇多糖（Perilla frutescenspolysaccharides，PFPS）是一類復(fù)雜的可溶性生物活性大分子，眾多研究表明PFPS具有潛在的生物功效。如Li Huizhen等[6]通過(guò)DEAE-cellulose-52和Sephadex G-100分離純化獲得了4 種紫蘇葉多糖單一組分，都顯示了不同程度的體外抗氧化活性。PFPS還具有較強(qiáng)的細(xì)胞溶酶體酶活性和巨噬細(xì)胞吞噬能力，體外能誘導(dǎo)一氧化氮和腫瘤壞死因子產(chǎn)生，體內(nèi)能刺激小鼠免疫因子產(chǎn)生，可作為一種免疫增強(qiáng)劑被開發(fā)利用[7]。紫蘇餅粕多糖是具有β-糖苷鍵的中等分子質(zhì)量多糖，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，具有良好的抗氧化活性[8]。

硒是人體必需的微量元素，人體許多疾病的發(fā)生與硒缺乏有關(guān)，如克山病、心腦血管疾病、癌癥和糖尿病等。由于硒無(wú)法在人體內(nèi)合成而必須從食物中攝取，因此人體中硒的缺乏非常普遍[9]。研究表明，有機(jī)硒具有比無(wú)機(jī)硒更高的安全性、更低的毒性和更好的生物利用度。天然多糖的硒酸化修飾是將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)硒與多糖功能強(qiáng)化的一種修飾方法[10]。Surhio等[11]采用HNO3-Na2SeO3法對(duì)粒毛盤菌（Lachnumsp.）胞外多糖硒化改性，其中硒以—Se(O)OH基團(tuán)結(jié)合到多糖C6的O6位置，修飾后胞外多糖的降脂能力和肝臟保護(hù)作用優(yōu)于未修飾多糖。也有研究分別在產(chǎn)胞外多糖陰溝腸桿菌、灰樹花和平菇培養(yǎng)基中添加適宜濃度的Na2SeO3，硒含量分別達(dá)12.962、8.37 μg/g和3.21 μg/g，且顯示了有效的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[12-14]。

本研究以紫蘇葉為原料，分別經(jīng)水提醇沉法、Sevag法和膜透析法制備分離粗PFPS。采用HNO3-Na2SeO3法對(duì)PFPS進(jìn)行硒酸改性修飾，獲得硒化-紫蘇多糖（Se-PFPS）分別采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、X射線衍射分析（X-ray diffraction，XRD）和熱重分析儀（thermal gravimetric analyzer，TGA）對(duì)PFPS和Se-PFPS的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行表征鑒定，旨在為開發(fā)新型富硒食品及擴(kuò)大紫蘇在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇來(lái)源于山西太原中北大學(xué)試驗(yàn)田。紫蘇葉于9月采收，采收后室溫陰干約1 周備用。

亞硒酸鈉 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖吳江市鑫茂精細(xì)化工有限公司；氯化鋇 天津市蘇莊化學(xué)試劑廠；苯酚 天津盛通泰化工有限公司；氯仿、正丁醇 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；濃硫酸、濃硝酸北京華亞兄弟商貿(mào)有限公司；抗壞血酸 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-T250高速多功能粉碎機(jī) 上海頂帥工貿(mào)有限公司；SB-100D數(shù)控超聲波清洗器 寧波市新芝生物科技股份有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市醫(yī)療器械廠；L535-1低速（冷凍）離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；KQ-100DE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 昆山市超聲儀器有限公司；Tensor-11 FTIR儀 德國(guó)布魯克公司；紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；MIRA LMS SEM 捷克泰思肯公司；SC7620濺射鍍膜儀英國(guó)Quorum公司；Nano ZS90納米粒度儀 英國(guó)馬爾文公司；1200型高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Empyrean XRD儀 荷蘭帕納科公司；STA2500 TGA 耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PFPS提取

參考Wang Chao等[15]方法采用水提醇沉法提取PFPS。陰干的紫蘇葉經(jīng)粉碎過(guò)篩后（80 目）稱取100 g，按液料比20∶1（mL/g）加入蒸餾水并在80 ℃水浴鍋中攪拌提取3 h。4000 r/min離心15 min獲得上清液后，沉淀物繼續(xù)浸提3 h，合并2 次上清液并蒸發(fā)濃縮。濃縮液中加入4 倍體積95%乙醇溶液，過(guò)夜沉淀后離心獲得沉淀物即為PFPS。PFPS經(jīng)進(jìn)一步溶解后采用Sevag法除蛋白。向多糖溶液中加入1/5體積的Sevag試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4（V∶V）），多次振蕩混勻后除去中層蛋白層并回收上清液。上清液經(jīng)自來(lái)水和蒸餾水分別透析48 h（mw：3500 Da）后，冷凍干燥即得到PFPS固體粉末。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0588x＋0.0846，R2=0.9945），采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖純度[16]。多糖得率計(jì)算如式（1）所示：

式中：W為多糖得率/%；m1為凍干后PFPS質(zhì)量/g；m0為紫蘇葉質(zhì)量/g。

1.3.2 硒化-紫蘇多糖（Se-PFPS）制備

采用HNO3-Na2SeO3法[17]對(duì)PFPS進(jìn)行硒酸化修飾。精確稱取質(zhì)量比為1∶1（g/g）的PFPS和亞硒酸鈉于50 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%硝酸溶液，加入0.7 g氯化鋇，在反應(yīng)溫度60 ℃水浴反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后加入適量的飽和硫酸鈉溶液去除氯化鋇，4000 r/min離心15 min獲得上清液后，加入碳酸鈉溶液調(diào)pH值至中性，之后加入4 倍體積95%乙醇過(guò)夜沉淀，離心得到沉淀物即為Se-PFPS。沉淀物經(jīng)復(fù)溶后用透析袋（mw：3500 Da）透析，每8 h換一次水，直至滴加抗壞血酸后不變紅色，冷凍干燥后得到Se-PFPS固體粉末，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖純度[16]。

1.3.3 硒含量測(cè)定

參考HJ 680—2013《土壤和沉積物 汞、砷、硒、鉍、銻的測(cè)定》[18]，分別移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL硒標(biāo)準(zhǔn)液（100.0 μg/L）于50 mL容量瓶中，分別加入10 mL鹽酸，室溫放置30 min，蒸餾水定容混勻后，測(cè)定熒光強(qiáng)度并繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=164.319x-22.498，R2=0.9998）。準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品于消解管中，之后緩慢加入6 mL鹽酸和2 mL硝酸，充分混勻。將消解罐裝入消解罐支架后放入微波消解儀爐腔內(nèi)，按表1升溫程序進(jìn)行微波消解。將消解后的樣品稀釋至合適濃度置于原子熒光光度計(jì)中進(jìn)行測(cè)定，并按式（2）計(jì)算Se-PFPS中的硒含量：

表1 微波消解升溫程序Table 1 Microwave digestion heating program

式中：W為樣品中硒含量/（μg/g）；ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中硒元素質(zhì)量濃度/（μg/L）；ρ0為空白溶液硒元素質(zhì)量濃度/（μg/L）；V0為微波消解后試液定容體積/mL；V1為分取試液的體積/mL；V2為分取后測(cè)定試液的定容體積/mL；m為稱取Se-PFPS質(zhì)量/g。

1.3.4 紫外光譜分析

稱取一定量PFPS和Se-PFPS，用蒸餾水溶解并稀釋至1 mg/mL后，以蒸餾水為空白對(duì)照，200～900 nm范圍內(nèi)作全波長(zhǎng)掃描。

1.3.5 FTIR分析

分別稱取10 mg PFPS和Se-PFPS粉末于真空干燥箱中干燥到恒質(zhì)量。用等量遞增法逐步加入100 mg無(wú)水KBr，利用瑪瑙研缽研磨均勻，對(duì)其壓片并置于紅外光譜儀。對(duì)無(wú)水KBr單獨(dú)壓片，作空白基線調(diào)零，在波長(zhǎng)范圍4000～500 cm-1之間進(jìn)行掃描。

1.3.6 SEM觀察

將2 種多糖樣品均勻撒在導(dǎo)電膠上，并使用濺射鍍膜儀噴金45 s，在加速電壓10～15 kV條件下通過(guò)掃描電鏡觀察樣品表面形態(tài)特征。

1.3.7 粒徑分析

用蒸餾水分別配制0.5 mg/mL的PFPS和Se-PFPS溶液，通過(guò)納米粒度儀在室溫測(cè)定2 種多糖的粒度分布和聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）。

1.3.8 HPGPC分析

參考Ren Yuanyuan等[19]方法，采用HPGPC法測(cè)定多糖分子質(zhì)量分布。分別精確稱取PFPS和Se-PFPS 2.00 mg，用1.0 mL超純水溶解后，過(guò)0.22 μm水膜，用高效液相色譜儀對(duì)2 種多糖的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：TSK-GEL G4000PWxl色譜柱；示差檢測(cè)器；流動(dòng)相：超純水；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器溫度：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.9 XRD分析

采用XRD儀測(cè)定2 種多糖樣品的晶體結(jié)構(gòu)。XRD條件：CuKα輻射，35 kV管壓力，100 mA管電流，10°～70°，0.02°梯度。

1.3.10 TGA

采用TGA測(cè)定2 種多糖樣品熱穩(wěn)定性。以20.0 mL/min的速度將氣體轉(zhuǎn)換為氮?dú)猓⒁?0 ℃/min速率將樣品從30 ℃加熱至800 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒含量分析

由表2可知，經(jīng)水提醇沉、Sevag法脫蛋白和透析處理后，PFPS得率為3.57%，純度為（53.22±1.69）%。在此基礎(chǔ)上，對(duì)紫蘇粗多糖進(jìn)行硒酸改性修飾。在PFPS與亞硒酸鈉質(zhì)量比0.5∶0.5（g/g）、硝酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間8 h條件下，所得Se-PFPS中硒含量可達(dá)（1004.33±48.60）μg/g，硒取代度為0.1%，多糖純度為（60.92±1.21）%。根據(jù)前期研究，紫蘇粗多糖主要由3 種單一組分組成，其質(zhì)量占比分別為18.04%、29.39%和23.33%。在單糖組成方面，紫蘇粗多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其質(zhì)量比為3.196∶43.901∶21.956∶4.244∶4.706∶21.997[8]。大量研究顯示，采用HNO3-Na2SeO3法對(duì)多糖進(jìn)行稀酸改性，其中硒主要以—Se(O)OH基團(tuán)結(jié)合到多糖C6的O6位置（圖1），從而實(shí)現(xiàn)硒與多糖的功能強(qiáng)化[11,20]。因此，Na2SeO3與PFPS中單糖發(fā)生了硒酸酯化反應(yīng)。

圖1 天然多糖硒酸化修飾機(jī)制Fig.1 Selenization modification mechanism of natural polysaccharide

表2 PFPS和Se-PFPS化學(xué)組成分析Table 2 Chemical composition of PFPS and Se-PFPS

2.2 紫外及紅外光譜分析

如圖2a所示，2 種多糖在280 nm波長(zhǎng)處均存在特殊吸收峰，表明仍有部分蛋白未脫除，分析其可能為結(jié)合蛋白[21]。圖2b顯示，2 種多糖在3379.38 cm-1和3386.77 cm-1處的強(qiáng)吸收峰歸屬于—OH伸縮振動(dòng)，2931.97 cm-1和2931.58 cm-1處的吸收峰歸屬于CH3、CH2、CH等C—H伸縮振動(dòng)[22]。1606.51 cm-1和1601.31 cm-1處的吸收峰歸屬于N—H（—CONH—）振動(dòng)，表明PFPS中存在結(jié)合蛋白[23]；1415.17 cm-1和1418.02 cm-1處的吸收峰與C—H彎曲振動(dòng)有關(guān)[24]，1028.50 cm-1和1025.92 cm-1處的強(qiáng)峰歸屬于C—O—C糖苷鍵，837.38 cm-1和837.37 cm-1為吡喃葡萄糖的特征吸收峰[25]。亞硒酸鈉在743 cm-1處存在特征吸收峰，而PFPS與Se-PFPS在此范圍內(nèi)無(wú)特征吸收峰，表明PFPS與亞硒酸鈉發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)而不是物理吸附。此外，在895.42 cm-1處為Se-PFPS比PFPS多出的特征吸收峰，因此可判斷PFPS發(fā)生了硒化反應(yīng)，且硒以亞硒酸酯的形式存在[26-27]。

圖2 PFPS和Se-PFPS的紫外光譜圖（a）和FTIR圖（b）Fig.2 UV (a) and FTIR (b) spectra of PFPS and Se-PFPS

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

如圖3所示，PFPS表面光滑，呈片狀結(jié)構(gòu)，許多不規(guī)則的交聯(lián)球在PFPS表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生強(qiáng)大的分子間作用力。Se-PFPS多呈現(xiàn)不規(guī)則的斷裂碎片，相對(duì)分散，表面粗糙，有許多不規(guī)則孔洞。形態(tài)學(xué)觀察表明硒酸改性對(duì)PFPS結(jié)構(gòu)影響很大，不僅削弱了多糖分子之間交聯(lián)程度，還改變了它們的形態(tài)[28]。

圖3 PFPS和Se-PFPS的SEM圖Fig.3 SEM photographs of PFPS and Se-PFPS

2.4 粒徑及分子質(zhì)量分析

PDI越小，表明水溶液中多糖顆粒分布越窄，均一性越好。當(dāng)PDI值小于1時(shí)，表明該物質(zhì)分子質(zhì)量均一性良好；當(dāng)PDI值大于1時(shí)，表明該物質(zhì)分子質(zhì)量均一性差[29]。從圖4a和表3可得，硒化修飾后PFPS的PDI從0.71±0.06降至0.60±0.02，可以認(rèn)為2 種多糖是一種單分散的同質(zhì)多糖。另外，與PFPS相比，Se-PFPS平均粒徑顯著減小，表明硒的結(jié)合導(dǎo)致糖鏈結(jié)合或纏繞，減小了顆粒尺寸[30]。圖4b顯示了PFPS與Se-PFPS的主要單糖組分分子質(zhì)量。結(jié)果表明，Se-PFPS各組分出峰時(shí)間都早于PFPS，表明Se-PFPS分子質(zhì)量大于PFPS，這一結(jié)果與Lee等[31]研究結(jié)果一致，在不同條件下硒化修飾的榆果果膠多糖（6.080×1012～6.557×1012Da）具有比未修飾果膠多糖（4.903×1012Da）更大的分子質(zhì)量，其可能是由于C6上的—OH被—HSeO3所代替。

圖4 PFPS和Se-PFPS的粒徑分布圖（a）和高效液相色譜圖（b）Fig.4 Particle size distribution (a) and HPLC chromatograms (b) of PFPS and Se-PFPS

表3 PFPS和Se-PFPS的粒徑、PDI和主要組分出峰時(shí)間Table 3 Particle sizes,PDIs and peak times of PFPS and Se-PFPS

2.5 XRD分析

如圖5所示，PFPS在衍射角19.92°觀察到明顯分散峰，而Se-PFPS分別在22.68°和28.69°處存在少量分散吸收峰，表明PFPS比Se-PFPS更容易形成單晶形態(tài)，這可能是由于Se-PFPS形成了具有不同緊密性含硒的新聚合物[32]。此外，2 種多糖弱的衍射吸收峰表明它們不能形成大量單晶，多以多晶和非晶形式存在。

圖5 PFPS和Se-PFPS的XRD分析Fig.5 XRD analysis of PFPS and Se-PFPS

2.6 熱穩(wěn)定性分析

圖6顯示PFPS與Se-PFPS的失重曲線和失重率曲線。PFPS與Se-PFPS分別有3 個(gè)分解階段，第1個(gè)階段為30～150 ℃，歸屬于水分蒸發(fā)；第2個(gè)階段為150～300 ℃，歸屬于多糖側(cè)鏈降解；第3個(gè)階段為300～800 ℃，歸屬于多糖主鏈降解，且500～800 ℃，2 種多糖質(zhì)量基本穩(wěn)定[33]。但相比之下，PFPS質(zhì)量高于Se-PFPS，表明PFPS更穩(wěn)定。

圖6 PFPS和Se-PFPS的熱穩(wěn)定性分析Fig.6 TGA analysis of PFPS and Se-PFPS

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從紫蘇葉中提取PFPS，并采用HNO3-Na2SeO3法獲得硒化-紫蘇雜多糖。通過(guò)FTIR、HPGPC、SEM，XRD和TGA等分析對(duì)PFPS和Se-PFPS進(jìn)行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)比較。結(jié)果表明硒以硒酯的形式取代了PFPS中C6位羥基，實(shí)現(xiàn)了無(wú)機(jī)硒向有機(jī)硒的轉(zhuǎn)變。同時(shí)，硒酸改性減小了多糖顆粒尺寸，增加了多糖分子質(zhì)量，改變了多糖形態(tài)特征和晶體狀態(tài)。