沈琳潔，林榮發(fā)，張連岳，馮傳志，傅 紅

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

海洋浮游植物和藻類含有的ω-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）經(jīng)食物鏈參與海洋魚類脂質(zhì)代謝[1]，其中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）在預(yù)防和治療心血管疾病、癌癥、糖尿病、炎癥等方面發(fā)揮重要作用[2-6]。天然深海魚油中EPA和DHA以構(gòu)成甘油三酯（triacylglycerol，TG）的脂肪酸形式存在，其總含量一般不超過30%；利用化學(xué)醇解及濃縮技術(shù)制備的乙酯型魚油可以將ω-3 PUFA含量提高到50%以上[7]。但是近年研究發(fā)現(xiàn)，乙酯中的ω-3 PUFA不僅比TG需要額外的羧基脂肪酶水解，而且對(duì)胰脂肪酶水解抵抗能力比TG高50 倍，這顯著降低了乙酯中ω-3 PUFA的消化吸收效率[8-10]；另外乙酯在體內(nèi)分解產(chǎn)生的乙醇容易引發(fā)乙醇不耐癥人群和嬰幼兒的不良反應(yīng)[11]。因此，制備食用安全性好和生物利用率高的高ω-3 PUFA含量甘油酯型魚油產(chǎn)品，成為特醫(yī)食品等領(lǐng)域的新經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)，目前挪威、丹麥、韓國(guó)等在此領(lǐng)域已具備較成熟的商業(yè)化技術(shù)，我國(guó)正處于研發(fā)和試生產(chǎn)階段[12]。

利用脂肪酶油脂改性技術(shù)，以天然魚油和乙酯型魚油為底物制備高ω-3 PUFA含量的魚油甘油酯產(chǎn)品是目前魚油高附加值產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向[13-14]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)主要集中于脂肪酶類型選擇和反應(yīng)條件參數(shù)優(yōu)化，對(duì)酯交換產(chǎn)物的分離及其副產(chǎn)物再利用的研究較少。乙酯型魚油原料價(jià)格貴，利用傳統(tǒng)的減壓分離技術(shù)難以完全分離成分復(fù)雜的酯交換產(chǎn)物魚油甘油酯，成為限制工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素。分子蒸餾技術(shù)加熱溫度低、受熱時(shí)間短，可以根據(jù)脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度和飽和程度對(duì)油脂熱敏性成分進(jìn)行高效的多組分分離。在酯交換混合產(chǎn)物分離方面，He Jianlin等[15]報(bào)道了酶促乙醇反應(yīng)結(jié)合分子蒸餾技術(shù)提高藻油DHA含量的方法，蒸餾溫度150 ℃和真空度≤1×10-3MPa分離得到富含DHA甘油酯的重組分和含有棕櫚酸、DHA乙酯的輕組分；Wang Xiumei等[16]用酶催化乙酯與甘油反應(yīng)生成含有76.46% TG的產(chǎn)物，分子蒸餾溫度175 ℃、真空度3 Pa時(shí)分離產(chǎn)物中的甘油二酯和乙酯，最終將TG含量提高至96.2%；?tefan等[17]分離山茶油中的游離脂肪酸時(shí)，分子蒸餾的脫酸效率可達(dá)92%。另外，在PUFA富集方面，傅紅等[18]通過二級(jí)分子蒸餾，獲得了63%ω-3 PUFA含量的乙酯型魚油；余瑤盼等[19]在真空壓力1 Pa、一級(jí)蒸餾溫度120 ℃和二級(jí)蒸餾溫度160 ℃時(shí)，將石榴籽油共軛亞麻酸乙酯含量從80.68%提升至95.23%。

本研究在脂肪酶促酯交換技術(shù)制備高ω-3 PUFA含量的魚油甘油酯產(chǎn)品研究基礎(chǔ)上[13,20-23]，采用分子蒸餾法分步應(yīng)用于魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物的分離。通過一級(jí)分子蒸餾技術(shù)分離魚油酯交換產(chǎn)物中的一級(jí)重相產(chǎn)物甘油酯（包括TG、甘油二酯和甘油單酯）和一級(jí)輕相副產(chǎn)物，并采用高溫氣相色譜及核磁共振氫譜等技術(shù)驗(yàn)證產(chǎn)物的分離效果；將一級(jí)輕相副產(chǎn)物直接參與下一級(jí)的酶促酯交換反應(yīng)中，或再通過分子蒸餾技術(shù)富集輕相乙酯副產(chǎn)物中的ω-3 PUFA，參與下一級(jí)的酶促酯交換反應(yīng)，以此制備不同ω-3 PUFA含量等級(jí)的甘油酯型魚油產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)原料和副產(chǎn)物的最大化利用，降低原料成本。分子蒸餾技術(shù)在酶促酯交換產(chǎn)物分離工藝中的高效使用，可以為實(shí)現(xiàn)綠色、能源節(jié)約型高含量ω-3 PUFA的魚油甘油酯產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料TG型魚油（ω-3 PUFA含量≤30%）、原料乙酯型魚油（ω-3 PUFA含量≥75%）福建天馬科技集團(tuán)有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 丹麥諾維信公司；正己烷等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FMD-150分子蒸餾儀 杜馬司科學(xué)儀器（江蘇）有限公司；AVANCE NEO 600核磁共振波譜儀 德國(guó)Bruker公司；GC7890A氣相色譜儀 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；CH1020B超級(jí)恒溫水浴槽 沙鷹科學(xué)儀器（上海）有限公司；HJ-4A磁力攪拌器 北京浩開科技有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促酯交換產(chǎn)物制備

以質(zhì)量比1∶1將TG型魚油和乙酯型魚油作為反應(yīng)底物置于夾套燒杯中，加入3%（以原料總質(zhì)量計(jì)）的固定化脂肪酶Lipozyme TL IM，密封燒杯口后于52 ℃恒溫磁力攪拌器避光反應(yīng)24 h[20]。酯交換反應(yīng)結(jié)束后，80 ℃保持20 min使酶滅活，8000 r/min離心10 min去除脂肪酶固體，得到一級(jí)酯交換反應(yīng)產(chǎn)物魚油混合酯。

1.3.2 分子蒸餾分步制備工藝

在體系壓強(qiáng)5 Pa、蒸餾溫度140 ℃、刮板轉(zhuǎn)速240 r/min和進(jìn)料速率0.2 mL/min的一級(jí)分子蒸餾優(yōu)化條件下，分離一級(jí)酯交換產(chǎn)物獲得分離產(chǎn)物一級(jí)重相和一級(jí)輕相。其中一級(jí)輕相既可直接參與二級(jí)酯交換反應(yīng)和分子蒸餾分離（反應(yīng)條件和一級(jí)相同），也可將一級(jí)輕相再經(jīng)分子蒸餾富集其中的ω-3 PUFA后，再參與二級(jí)酯交換反應(yīng)和分子蒸餾分離。上述工藝得到不同等級(jí)的魚油甘油酯產(chǎn)品，工藝流程圖如圖1所示。

圖1 不同ω-3脂肪酸含量等級(jí)的甘油酯型魚油產(chǎn)品的分步制備Fig.1 Flow chart for the preparation of triglyceride-type fish oil products with different ω-3 fatty acid contents

1.3.21 酯交換混合產(chǎn)物中甘油酯的分離

稱取一定量酯交換產(chǎn)物魚油加入分子蒸餾加料罐，探究分子蒸餾體系壓強(qiáng)、蒸餾溫度、刮板轉(zhuǎn)速和進(jìn)料速率對(duì)重相中的甘油酯型魚油ω-3 PUFA（EPA＋DHA）含量的影響。將薄層制備色譜法得到的酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中甘油酯混合譜帶（包括TG、甘油二酯和甘油單酯三條譜帶）ω-3 PUFA含量作為標(biāo)準(zhǔn)值，按下式計(jì)算分子蒸餾重相中的ω-3 PUFA含量和前者的相對(duì)偏差，相對(duì)偏差越小，說明分離效果越好，其中ω-3 PUFA含量由氣相色譜法測(cè)定。

式中：X1為分子蒸餾重組分中ω-3 PUFA含量；X2為薄層制備色譜甘油酯中ω-3 PUFA含量。

1.3.22 分子蒸餾富集一級(jí)輕相的ω-3 PUFA

稱取一定量一級(jí)輕相加入分子蒸餾加料罐，在體系壓強(qiáng)5 Pa時(shí)探究刮板轉(zhuǎn)速、冷凝溫度和蒸餾溫度對(duì)一級(jí)輕相中的ω-3 PUFA富集效果的影響。收集ω-3 PUFA富集相，經(jīng)氣相色譜檢測(cè)其EPA＋DHA含量，并按下式計(jì)算乙酯型魚油富集相得率。

式中：m富為富集相乙酯型魚油的質(zhì)量/g；m進(jìn)為進(jìn)料乙酯型魚油的質(zhì)量/g。

1.3.3 薄層色譜法分析產(chǎn)物及制備甘油酯

稱取一定量樣品溶解于50 μL正己烷，用定量點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取1 μL在距薄層板底邊2 cm處點(diǎn)上直徑＜4 mm的圓點(diǎn)，放入展開缸中（展開劑為正己烷∶乙醚∶甲酸=80∶20∶2，V/V）。利用上行法展開，待展開劑上升至距薄層板頂端2 cm處時(shí)取出晾干，噴灑茴香醛顯色劑，在110 ℃加熱條件下根據(jù)Rf值判斷各脂質(zhì)組分[24]。

將30 mg未經(jīng)分子蒸餾分離的酶促酯交換反應(yīng)混合產(chǎn)物溶解于50 μL正己烷，均勻點(diǎn)樣于20 cm×20 cm薄層板上并連成1 條直線，用展開劑（正己烷∶乙醚∶乙酸=80∶20∶1，V/V）進(jìn)行層析，展開結(jié)束晾干后噴灑2’,7’-二氯熒光素顯色劑，在紫外燈下觀察并刮下甘油酯混合譜帶（包括TG、甘油二酯和甘油單酯3 條譜帶）對(duì)應(yīng)區(qū)域[25-26]。按上述方法收集制備的3～5 份混合譜帶樣品，氣相色譜分析脂肪酸含量。

1.3.4 分離產(chǎn)物的甘油酯成分和脂肪酸組成分析

1.3.41 高溫氣相色譜法測(cè)定分子蒸餾分離產(chǎn)物組成

取樣品溶解于正己烷溶劑中，通過高溫氣相色譜法分析重組分組成。色譜條件：Agilent 7890A氣相色譜儀；Agilent VF-5ht高溫柱子；檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度325 ℃，檢測(cè)器溫度340 ℃，色譜柱升溫程序：以5 ℃/min從50 ℃升到400 ℃。進(jìn)樣量2 μL，分流比為100∶1[27]。

1.3.42 氣相色譜法測(cè)定脂肪酸組成

樣品采用甲酯化處理，經(jīng)氣相色譜法測(cè)定脂肪酸組成。色譜條件：Agilent 7890A氣相色譜儀；Agilent J&W DB-FATWAX超高惰性柱；氫火焰離子化檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃；色譜柱升溫程序：40 ℃保持2 min，以55 ℃/min升至171 ℃，保持25 min，再以10 ℃/min升至215 ℃，保持25 min，直至分析完成；載氣為純氮?dú)?，流?0 cm/s，橫流模式，氫氣流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min，尾吹氣為氮?dú)?，流速?5 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比為20∶1[28]。

1.3.5 核磁共振氫譜法分析甘油酯分離效果

分別稱取50 mg樣品溶于500 μL氘代氯仿后裝入5 mm核磁管，置于600 MHz運(yùn)行的核磁共振波譜儀測(cè)試，獲得核磁共振氫譜。參數(shù)條件：以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物，掃描次數(shù)32 次，脈沖寬度90°，采集時(shí)間2.7525 s，譜寬12×10-6，脈沖間隔1 s，脈沖序列zg30[29]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2021軟件繪圖，并使用MestReNova軟件分析核磁共振氫譜圖。數(shù)據(jù)為3 次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的平均值，以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜法分析產(chǎn)物成分

在前期工藝參數(shù)優(yōu)化酶促原料TG型魚油和原料乙酯型魚油的酯交換反應(yīng)基礎(chǔ)上[13,20-21]，采用分子蒸餾技術(shù)分離酯交換產(chǎn)物的甘油酯，分離產(chǎn)物為分子蒸餾重相和分子蒸餾輕相兩部分。圖2是反應(yīng)底物、酯交換反應(yīng)后的混合產(chǎn)物及其一級(jí)分子蒸餾效果較完全的分離產(chǎn)物（一級(jí)重相、一級(jí)輕相）薄層色譜圖，其中重相在膽固醇酯、TG、甘油二酯和甘油單酯所對(duì)應(yīng)的譜帶上有清晰的斑點(diǎn)，輕相則含有乙酯型魚油和游離脂肪酸的斑點(diǎn)。因此由薄層色譜圖初步判斷，分子蒸餾法可以將乙酯型魚油等副產(chǎn)物從甘油酯中分離。

圖2 酯交換底物及一級(jí)分子蒸餾分離產(chǎn)物的薄層色譜圖Fig.2 Thin layer chromatograms of transesterification substrates and primary molecular distillation products

2.2 分子蒸餾分離酯交換產(chǎn)物的工藝條件

一級(jí)分子蒸餾的各工藝因素優(yōu)化效果見圖3。由圖3a可知，在本分子蒸餾設(shè)備能夠達(dá)到的最小體系壓強(qiáng)5 Pa時(shí)，重相ω-3 PUFA含量相對(duì)偏差最小達(dá)到6.02%。圖3b顯示，在110～150 ℃時(shí)，隨著分子蒸餾溫度的升高，重相ω-3 PUFA分離的相對(duì)偏差降低，當(dāng)蒸餾溫度為140 ℃時(shí)達(dá)到1.19%，繼續(xù)提高蒸餾溫度相對(duì)偏差無(wú)明顯降低；這是因?yàn)檎麴s溫度的升高有助于高真空條件下各組分根據(jù)平均自由程的差別而實(shí)現(xiàn)完全分離，游離脂肪酸和乙酯型魚油充分逸出到輕組分，甘油酯型魚油則被留在重相。圖3c表明，刮板轉(zhuǎn)速為180～260 r/min時(shí)相對(duì)偏差先下降后升高，當(dāng)刮板轉(zhuǎn)速達(dá)到240 r/min時(shí)相對(duì)偏差達(dá)到最小；提高刮板轉(zhuǎn)速使物料在蒸發(fā)面上形成的液膜厚度降低，導(dǎo)致傳熱和傳質(zhì)過程更加完全；但繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速使蒸發(fā)面上的料液流速加快，輕相不能完全逸出。圖3d顯示，進(jìn)料速率越慢相對(duì)偏差越小，因?yàn)榱弦涸谡舭l(fā)面上滯留時(shí)間延長(zhǎng)有助于達(dá)到充分的傳熱傳質(zhì)，使分子平均自由程小的游離脂肪酸和乙酯型魚油有足夠的時(shí)間逸出，和重相分離。在分子蒸餾分離酯交換產(chǎn)物的體系壓強(qiáng)5 Pa、蒸餾溫度140 ℃、刮板轉(zhuǎn)速240 r/min和進(jìn)料速率0.2 mL/min優(yōu)化條件下，重相甘油酯和輕相乙酯型魚油的分離效果分別對(duì)應(yīng)于圖2第4、5條薄層色譜譜帶。

圖3 分子蒸餾壓強(qiáng)（a）、蒸餾溫度（b）、刮板轉(zhuǎn)速（c）、進(jìn)料速率（d）對(duì)重相ω-3 PUFA分離相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的影響Fig.3 Effects of molecular distillation pressure (a),distillation temperature (b),scraper speed (c),and feeding rate (d) on the relative standard deviation of ω-3 PUFA separation from heavy phase

2.3 分子蒸餾技術(shù)富集一級(jí)輕相乙酯型魚油的ω-3 PUFA含量

一級(jí)分子蒸餾得到的輕相乙酯型魚油副產(chǎn)物，可以進(jìn)一步通過分子蒸餾富集其ω-3 PUFA含量再進(jìn)行二級(jí)酶促酯交換反應(yīng)。由圖4a可知，提高刮板轉(zhuǎn)速乙酯型魚油富集相ω-3 PUFA含量先升高后下降，得率呈緩慢上升趨勢(shì)。這是因?yàn)楣伟遛D(zhuǎn)速太慢導(dǎo)致蒸發(fā)壁面形成液膜厚度大，不利于傳質(zhì)傳熱；刮板轉(zhuǎn)速過快液膜內(nèi)流體的徑向速度顯著增大，導(dǎo)致飛濺現(xiàn)象[30-31]；當(dāng)刮板轉(zhuǎn)速至240 r/min時(shí)有利于形成均勻的液膜狀態(tài)，達(dá)到理想的分離效果。由圖4b可知，隨著冷凝溫度升高，分離產(chǎn)物富集相的ω-3 PUFA含量略呈下降趨勢(shì)，得率略呈上升趨勢(shì)，冷凝溫度為20 ℃能夠達(dá)到較好的分離效果。圖4c顯示，分子蒸餾壓力為5 Pa時(shí)，蒸餾溫度的升高使產(chǎn)物富集相ω-3 PUFA含量上升、得率下降；當(dāng)蒸餾溫度為110 ℃時(shí)，ω-3 PUFA含量由蒸餾前的60.73%提高到78.01%，富集相得率為32.97%。

圖4 刮板轉(zhuǎn)速（a）、冷凝溫度（b）、蒸餾溫度（c）對(duì)一級(jí)輕相中ω-3 PUFA含量富集效果的影響Fig.4 Effects of scraper speed (a),condensation temperature (b) and distillation temperature (c) on the enrichment of ω-3 PUFA in the first-stage light phase

2.4 分子蒸餾分離產(chǎn)物的組成和脂肪酸含量

2.4.1 分子蒸餾產(chǎn)物組成分析

一級(jí)分子蒸餾的輕相副產(chǎn)物通過分子蒸餾富集其ω-3 PUFA，進(jìn)行二級(jí)酶促酯交換反應(yīng)和二級(jí)分子蒸餾產(chǎn)物分離，根據(jù)游離脂肪酸、乙酯型魚油和不同酰基甘油酯的等價(jià)碳數(shù)不同，利用高溫氣相色譜分析各組分[32]。乙酯型魚油富集相參與的兩級(jí)分子蒸餾產(chǎn)物組成及含量見表1，其中酯交換反應(yīng)混合產(chǎn)物、油酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)樣品、一級(jí)分子蒸餾產(chǎn)物重相的高溫氣相色譜圖見圖5。表1結(jié)果表明，經(jīng)一級(jí)分子蒸餾后，酯交換魚油產(chǎn)物中的游離脂肪酸、乙酯和微量甘油單酯進(jìn)入輕相，而甘油二酯、TG和大多數(shù)甘油單酯則進(jìn)入重相；一級(jí)重相中的游離脂肪酸含量為0.54%，甘油單酯、甘油二酯和TG的含量分別達(dá)到14.23%、24.01%和61.22%；一級(jí)重相得率為47.13%，一級(jí)輕相得率48.36%，總損耗率4.51%。一級(jí)輕相經(jīng)分子蒸餾富集ω-3 PUFA后的富集產(chǎn)物中含有98.86%乙酯，若乙酯型魚油富集相繼續(xù)參與二級(jí)酶促酯交換反應(yīng)和二級(jí)分子蒸餾，獲得的二級(jí)產(chǎn)物重相中的甘油單酯、甘油二酯和TG的含量分別達(dá)到16.28%、19.31%、63.95%，二級(jí)重相和輕相得率分別為46.23%和47.81%，總損耗率5.96%。

表1 一級(jí)輕相富集ω-3 PUFA后的兩級(jí)分子蒸餾產(chǎn)物組成及含量Table 1 Changes in composition of the first-stage heavy and light phase after sequential ω-3 PUFA enrichment and secondary molecular distillation %

圖5 高溫氣相色譜法分析酯交換反應(yīng)混合產(chǎn)物（a）、油酸乙酯標(biāo)樣（b）和一級(jí)分子蒸餾產(chǎn)物重相（c）Fig.5 HTGC chromatograms of transesterification products (a),ethyl oleate standard (b),and heavy phase of primary molecular distillation products (c)

2.4.2 脂肪酸組成分析

氣相色譜法分析酯交換原料和分子蒸餾分步制備產(chǎn)物的各脂肪酸組成和含量，結(jié)果見表2。原料TG型魚油和原料乙酯型魚油的ω-3 PUFA含量分別為29.65%和83.75%，經(jīng)酶促酯交換反應(yīng)和一級(jí)分子蒸餾后，一級(jí)重相的ω-3PUFA含量達(dá)到53.76%，一級(jí)輕相的ω-3 PUFA含量達(dá)到60.73%。當(dāng)進(jìn)一步采用分子蒸餾富集一級(jí)輕相的ω-3 PUFA含量后，富集相的ω-3 PUFA含量提高到78.01%；將其與原料TG型魚油進(jìn)行二級(jí)酶促酯交換反應(yīng)及二級(jí)分子蒸餾分離后，得到的二級(jí)重相1的ω-3 PUFA含量達(dá)到51.38%。若一級(jí)輕相不經(jīng)分子蒸餾富集，直接作為二級(jí)酯交換底物與原料TG型魚油進(jìn)行酯交換反應(yīng)，則二級(jí)重相2的ω-3 PUFA含量?jī)H達(dá)到42.37%。上述兩級(jí)酯交換魚油甘油酯產(chǎn)品的脂肪酸含量均符合CXS 329-2017《國(guó)際食品法典標(biāo)準(zhǔn) 魚油》對(duì)濃縮甘油酯型魚油（EPA＋DHA=35%～50%）的定義[33]，因此采用分子蒸餾分步制備酯交換產(chǎn)物技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)魚油甘油酯ω-3 PUFA含量的分級(jí)，增加產(chǎn)品的多元化。

表2 兩級(jí)酶促酯交換反應(yīng)及分離產(chǎn)物的脂肪酸組成及含量Table 2 Fatty acid composition and content of two-stage enzymatic transesterification products and molecular distillation products %

2.5 分子蒸餾產(chǎn)物中重組分魚油甘油酯結(jié)構(gòu)分析

利用核磁共振氫譜法分析分子蒸餾分離酯交換產(chǎn)物一級(jí)重相的脂質(zhì)組分。氫原子受不同脂肪酸組成和脂質(zhì)類型中化學(xué)環(huán)境的影響，表現(xiàn)為核磁共振氫譜中化學(xué)位移的信息不同[34]。原料TG型魚油、原料乙酯型魚油、未分離的酯交換反應(yīng)混合產(chǎn)物和一級(jí)分子蒸餾重相4 種樣品核磁共振氫譜依次如圖6所示。

圖6 酯交換反應(yīng)及分子蒸餾分離產(chǎn)物的核磁共振氫譜全譜圖及δ 1.2～1.3局部放大譜圖Fig.6 1H-NMR spectra with zoom-in at δ 1.2-1.3 of different fish oil samples

對(duì)比圖6a、b，酯交換原料TG型魚油和乙酯型魚油的核磁共振氫譜存在δ1.2～1.3和δ4.15～4.35的兩處差異，其中原料TG型魚油和分子蒸餾分離的一級(jí)重相魚油只有δ1.267處明顯的單峰，原料乙酯型魚油有δ1.248和δ1.251兩個(gè)化學(xué)位移信號(hào)峰；從信號(hào)峰強(qiáng)度看出，原料乙酯型魚油的DHA含量為72.97%，明顯高于EPA含量8.84%，圖中δ1.251對(duì)應(yīng)的DHA乙酯的—CH3基團(tuán)振動(dòng)的信號(hào)峰強(qiáng)度更高，這和理論上推測(cè)出DHA中最近的C＝C（C4位置）更接近其乙基的—CH3部分，所以與δ1.248 和δ1.251的—CH3基團(tuán)共振分別歸屬于EPA和DHA乙酯的結(jié)論一致[35]；相比之下，原料TG型魚油和一級(jí)分子蒸餾分離的重相魚油并未顯示出上述基團(tuán)振動(dòng)峰。另外，根據(jù)魚油產(chǎn)品核磁共振氫譜各信號(hào)峰的歸屬可知[36]，甘油酯型魚油在δ4.15～4.35的雙二重峰（峰L）來(lái)源于TG主鏈上sn-1,3位的—CH2OCOR基團(tuán)共振，乙酯型魚油在δ4.12處顯示明顯的多重峰（峰K）來(lái)源于乙酯末端—CH2OCR。酯交換混合產(chǎn)物核磁共振氫譜呈現(xiàn)出兼具甘油酯型魚油和乙酯型魚油的譜圖特征，但經(jīng)分子蒸餾分離的重相魚油核磁指紋圖譜與原料TG型魚油的特征基本一致，兩者在δ4.15～4.35處峰高的差異可歸因?yàn)轷ソ粨Q后TG骨架sn-1,3位置氫原子分布的復(fù)雜化。因此，核磁共振氫譜分析結(jié)果進(jìn)一步說明了分子蒸餾分離的重相魚油屬于甘油酯型產(chǎn)品，不含乙酯型魚油。

3 結(jié)論

采用分子蒸餾方法，對(duì)脂肪酶促油脂改性技術(shù)制備食用安全性好和生物利用率高的高含量ω-3 PUFA魚油甘油酯產(chǎn)物進(jìn)行有效分離和乙酯型魚油再利用。酶促酯交換產(chǎn)物在分子蒸餾壓強(qiáng)5 Pa、蒸餾溫度140 ℃、刮板轉(zhuǎn)速240 r/min和進(jìn)料速率0.2 mL/min時(shí)，重相ω-3PUFA含量和薄層層析分離制備ω-3 PUFA含量的相對(duì)偏差最小，不含乙酯型魚油副產(chǎn)物，一級(jí)重相ω-3 PUFA含量由原料TG型魚油的29.65%提高到53.76%；再通過分子蒸餾進(jìn)一步富集乙酯型魚油副產(chǎn)物中的ω-3 PUFA，蒸餾壓強(qiáng)5 Pa、蒸餾溫度110 ℃、刮板轉(zhuǎn)速240 r/min和冷凝溫度20 ℃時(shí)，一級(jí)輕相中ω-3 PUFA含量由60.73%提高到78.01%，富集相得率為32.97%，其參與二級(jí)酶促酯交換反應(yīng)和分離獲得二級(jí)重相1ω-3 PUFA含量達(dá)到51.38%。若一級(jí)輕相直接參與二級(jí)酯交換反應(yīng)和分離，其二級(jí)重相2ω-3 PUFA含量?jī)H為42.37%。采用分子蒸餾分步制備技術(shù)可以獲得不同ω-3 PUFA含量等級(jí)的甘油酯型魚油產(chǎn)品，同時(shí)實(shí)現(xiàn)原料和副產(chǎn)物的最大化利用。