王瑞仙，田 霜，魯武鋒，方英藝，張孝敬，安傳相，譚 莉，楊友聯(lián)

1.鳳岡縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州鳳岡 564200；2.六盤水師范學院 生物科學與技術(shù)學院，貴州六盤水 553004

大葉黃楊（Euonymus japonicusThumb）具有一定的觀賞價值和生態(tài)價值，是園林綠化中的常見植物。由于其葉部病蟲害發(fā)生普遍，常造成植株死亡，影響了其在園林綠化中的應用價值。目前，對大葉黃楊白粉病、大葉黃楊褐斑?。ㄈ~斑?。┖痛笕~黃楊炭疽病的研究較為深入，病原菌分別為正木粉孢霉（Oidium euonymi-japonicaeSacc）、壞損尾孢（Cercospora destructiveRav）、膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz）[1-2]。但還沒有對大葉黃楊葉枯病病害系統(tǒng)、全面的研究報道。李庚花等[3]研究發(fā)現(xiàn)大葉黃楊葉枯病的病原菌為半知菌亞門盤多毛孢屬，而賁海燕[4]發(fā)現(xiàn)引起大葉黃楊葉枯病的病原菌為黃楊葉點霉，但該病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)與李庚花等報道的差別較大。上述研究均只采用了形態(tài)學鑒定的方法，且研究結(jié)果存在爭議。因此，采用新技術(shù)手段進一步探索大葉黃楊葉枯病的病原菌，明確大葉黃楊葉部病害種類及其防控策略尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，應用分子生物學技術(shù)可更加準確地鑒定病原菌種類，其中因核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）在眾多基因序列中最容易被擴增及測序，已廣泛應用于病原真菌檢測[5]。但ITS序列拷貝引物位點高度保守，許多復合種不能單一地依靠ITS序列進行區(qū)分，且基因片段較短，在真菌系統(tǒng)學研究中存在不足[6]。除ITS外，甘油醛三磷酸脫氫酶基因（GPDH），α、β、γ-微管蛋白基因，鈣調(diào)蛋白基因（CAL）等也被廣泛應用于真菌系統(tǒng)學研究[7]。應用多基因分析結(jié)合形態(tài)學特征可提高真菌的準確識別率，使依靠形態(tài)學及單基因分析極難識別的復合種的鑒定成為可能。

近年來，在貴州省六盤水地區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似大葉黃楊葉枯病的癥狀，發(fā)病后其葉片病斑呈圓形、多角形或不規(guī)則形，后期病斑上有絲狀斑紋，葉面著生黑色分生孢子盤。該病害多危害葉片、嫩梢和幼莖，最終可致使葉片枯死掉落，嚴重時導致全株枯死。該病害存在大范圍流行的趨勢，嚴重影響了大葉黃楊的觀賞及生態(tài)價值。為明確引起該病害的病原菌，采用形態(tài)學與多基因系統(tǒng)學相結(jié)合的方法，對貴州省六盤水地區(qū)疑似大葉黃楊葉枯病的病原菌開展研究，旨在確定其分類地位，為該病原真菌的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在貴州省六盤水市市區(qū)及水城縣森林公園采集具典型特征的大葉黃楊葉枯病病害樣品，對病斑進行拍照，裝入牛皮紙信封中。將標本帶回實驗室進行分離純化。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用稀釋涂布法分離病原菌，將采集病葉樣品進行純化培養(yǎng)后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)學鑒定 將分離得到的2個菌株分別接種在PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)倒置培養(yǎng)7 d左右，采用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落特征。分別刮取病害標本、PDA培養(yǎng)基上的分生孢子堆制成臨時裝片，采用奧林巴斯BX51顯微攝像系統(tǒng)觀察并拍攝分生孢子形態(tài)特征，并采用Spot32 v4.0.8軟件測量其大小。

1.2.3 分離菌株的致病性鑒定 參照牛小瑞[8]和楊友聯(lián)[9]等的方法，以濃度為3.0×106個孢子/mL的孢子懸浮液為接種體，分別對供試的2個菌株設(shè)室內(nèi)創(chuàng)傷（針刺法）接種和無創(chuàng)傷接種2個處理，用無菌水接種作空白對照。于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕（70%以上）培養(yǎng)。每天觀察記錄發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，從病健交界處分離菌株，完成柯赫氏法則驗證。

1.2.4 多基因聯(lián)合鑒定 分別將2個菌株接種于PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后刮取菌絲，采用改良的CTAB法提取菌株DNA[10]。選擇核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）、β-微管蛋白（β-tubulin）和翻譯延長因子1α亞基基因（tef-1）3個基因片段作為目標基因進行擴增與測序（表1）。ITS序列引物為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），β-tubulin序列引物為BT2ATCTT），每個反應體系包括12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix酶，上、下游引物各1 μL，1.5 μL DNA模板和9 μL水，總體積為25 μL。按表2的擴增程序?qū)?個基因片段進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由成都栢輝生物科技有限公司進行測序。將測序結(jié)果在GenBank比對并參考序列相偶聯(lián)的文獻，同時下載相似度較高的序列用于序列分析[11-13]（表2）。采用Clustal 1.83對測序的各個基因序列以及在GenBank下載的序列進行比對，比對后各個基因分別首尾相連，采用Paup 4.0 beta 10軟件，最大簡約法（Maximum parsimony，MP）進行分析，以啟發(fā)式搜索法（Heuristic Search）構(gòu)建多基因系統(tǒng)樹，以確定菌株的分類地位。

表2 參與分子系統(tǒng)學分析的序列

2 結(jié)果與分析

2.1 供試大葉黃楊病葉的病害癥狀及病原菌初步鑒定結(jié)果

病斑多在新生枝葉及頂部葉片處發(fā)生，病健交界明顯，病斑呈圓形、多角形或不規(guī)則形向外擴展。感病葉片先是變枯黃，后產(chǎn)生黑色小粒點，著生于葉表皮下，后期突破表皮外露，為分生孢子盤和分生孢子，嚴重時整個葉片枯萎（圖1）。

圖1 大葉黃楊葉枯病病癥

圖2 接種供試菌株后大葉黃楊葉片癥狀

分離的菌株純化后得到2個菌株，編號LPSU2015001、LPSU2015002，經(jīng)鏡檢初步鑒定引起當?shù)卮笕~黃楊葉枯病的病原菌為擬盤多毛孢屬真菌。

2.2 大葉黃楊病原菌致病性檢測結(jié)果

室內(nèi)接種結(jié)果表明，絕大部分健壯的大葉黃楊葉片在刺傷接種后均能被病原菌侵染，且病斑癥狀與供試大葉黃楊病葉相似，而無刺傷接種葉片均未發(fā)病，表明該病原菌只能從傷口侵染葉片。2個菌株刺傷接種后發(fā)病率均為60%。分離純化后所得菌株菌落及分生孢子形態(tài)與原供試菌株一致。

2.3 大葉黃楊病原菌的形態(tài)學鑒定

經(jīng)分離純化，菌株LPSU2015001在PDA培養(yǎng)基上的菌絲呈白色絮狀，生長速度11.1～11.4 mm/d，菌落邊緣不整齊，背面淺黃色，菌絲致密，有同心環(huán)狀紋飾（圖3A）；分生孢子堆黑色，分生孢子5細胞，（23.9～30.3）μm×（4.4～7.40）μm，中間3個色胞幾乎同色，上2色胞深褐色，第3色胞顏色稍淡，分割處顏色特深，稍縊縮，頂胞無色，梯形或圓錐形，有2～3根附屬絲，長14.5～29.8 μm，尾孢無色，圓錐形，具中生式柄1～2根，多1根，長6.3～12.8 μm（圖3B、圖3C）。寄主上，分生孢子4～5細胞，4細胞分生孢子無頂端透明孢，多5細胞，直或稍彎曲，（16.9～27.5）μm×（5.9～9.8）μm（圖3D、圖3E）；產(chǎn)孢細胞生于分生孢子梗頂端，棍棒形，無色，末端產(chǎn)分生孢子（圖3F、圖3G）。

圖3 LPSU2015001純培養(yǎng)及顯微特征

菌株LPSU2015002在PDA培養(yǎng)基上菌絲潔白，呈棉絮狀，分布均勻，菌落邊緣不整齊，氣生菌絲少，有同心輪紋，接種點周圍菌絲稍稀疏，生長速率9.7～9.9 mm/d（圖4A）；分生孢子堆黑色，分生孢子5細胞，（20.4～27.6）μm×（4.3～7.8）μm，中間3個色胞幾乎同色，上2色胞深褐色，第3色胞顏色稍淡，分割處顏色特深，稍縊縮，頂胞無色，梯形或圓錐形，有1～2根附屬絲，長9.4～21.4 μm，尾孢無色，圓錐形，具中生式柄1根，長4.8～7.7 μm（圖4B、圖4C）。寄主上，分生孢子4～5細胞，4細胞分生孢子無頂端透明孢，（16.5～36.7）μm×（4.8～9.9）μm，整體較小，具小瘤（圖4D、圖4E）；產(chǎn)孢細胞生于分生孢子梗頂端，棍棒形，無色，末端產(chǎn)分生孢子（圖4F）。

圖4 LPSU2015002純培養(yǎng)及顯微特征

2.4 大葉黃楊病原菌的分子生物學鑒定

將分離得到的2個菌株的ITS、β-tubulin、tef-1序列與從GenBank下載的同源性較高的序列（表2），以最大簡約法，以Seiridium sp. SD096作為外類群，基于ITS、β-tubulin、tef-1序列構(gòu)建多基因系統(tǒng)樹（圖5）。結(jié)果表明，LPSU-2015001與P.intermediaM親緣關(guān)系較近，處于同一進化分支上，支持率為93%；LPSU2015002與P.trachicarpicola親緣關(guān)系較近，處于同一進化分支上，支持率為79%，但兩者支長差異較大。

圖5 基于ITS、β-tubulin、tef-1部分序列構(gòu)建的擬盤多毛孢屬系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

大葉黃楊葉枯病是一種常見的植物真菌性病害，早在2006年，李庚花等[3]在對江西省大葉黃楊病害調(diào)查中，通過描述病原菌分生孢子大小，分生孢子器著生位置，鑒定該病的病原菌為半知菌亞門盤多毛孢屬，并未對分生孢子及產(chǎn)孢細胞等形態(tài)特征作具體描述。賁海燕等在對北方花卉新病害的鑒定中，采用形態(tài)學鑒定的方法，描述了大葉黃楊葉枯病病原菌的分生孢子器以及PDA純培養(yǎng)特征與顯微特征，鑒定該病原菌為黃楊葉點霉，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)與李庚花等報道的差別很大。通過形態(tài)學鑒定，2個菌株的形態(tài)學特征均與前兩者不同，觀察純培養(yǎng)特征及顯微特征，初步判定2個菌株（LPSU2015001、LPSU2015002）均屬于擬盤多毛孢屬。

有關(guān)擬盤多毛孢屬的分類，Steyaert[14]根據(jù)分生孢子的形態(tài)特征作為界定擬盤多毛孢的依據(jù)；Cuba[15]則設(shè)5細胞組以界定擬盤多毛孢屬，兩者均根據(jù)形態(tài)特征來劃分種。但對于形態(tài)特征的測量及描述，各學者的研究結(jié)果均存在參差，且許多種的形態(tài)特征幾乎相似，不同的人可能會將不同的種鑒定成同一個種，甚至會出現(xiàn)形態(tài)學與基因分析結(jié)果不相吻合的情況[16]。

參照Maharachchikumbura等[17-18]的研究，將分離到的2株菌與其在分子系統(tǒng)發(fā)育樹中近緣種的形態(tài)特征相比，發(fā)現(xiàn)LPSU2015001的形態(tài)學特征與Maharachchikumbura等對P. intermedia的描述稍有差異，如寄主上，LPSU2015001分生孢子大小為（16.9～27.5） μm×（5.9～9.8）μm，而Maharachchikumbura等描述的是（24.0～28.0）μm×（5.5～6.5）μm，結(jié)合多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，兩者處于同一進化分支上，支持率為93%，因此可將LPSU2015001鑒定為P. intermedia?；贚PSU2015002多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，其與P. trachicarpicola親緣關(guān)系較近，但兩者的支長相差大，且支持率僅有79%，在形態(tài)方面，LPSU2015002寄主上分生孢子較P. trachicarpicola長，頂端附屬絲數(shù)量、長度、分生孢子細胞數(shù)量等差異較大，故不能將其分類單元定位到種，暫定為Pestalotiopsissp.。因此，此次在六盤水地區(qū)采樣分離得到的疑似大葉黃楊葉枯病的病原菌為擬盤多毛孢菌株，其中菌株LPSU2015001為P. intermedia，菌株LPSU2015002暫定為Pestalotiopsissp.。