趙卓琳 吳蛟 馬英 劉沁 蔣玲 陳道鋒

(1宜賓市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川 宜賓 644000;2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

缺血性腦卒中是由腦動(dòng)脈狹窄/閉塞導(dǎo)致腦區(qū)缺血缺氧,進(jìn)而造成神經(jīng)元損傷及神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)的常見腦血管病,是一種高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率疾病,占臨床腦卒中發(fā)病總數(shù)的80%左右。故探求新的神經(jīng)保護(hù)劑對預(yù)防和治療神經(jīng)病學(xué)具有重要裨益〔1,2〕。研究表明,缺血性腦卒中其病因及發(fā)病機(jī)制是由多因素引發(fā)的腦組織能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等系列病理反應(yīng),從而引發(fā)全身性臨床癥狀〔3,4〕。目前,臨床以靜脈溶栓、血管內(nèi)介入為主要治療措施,雖療效顯著,但對錯(cuò)過最佳治療時(shí)間窗患者療效欠佳〔5〕。丹酚(SA)作為植物提取的有效成分,具有特異的高選擇性κ阿片受體(KOR)激活動(dòng)能。研究表明,SA效能遠(yuǎn)高于其他現(xiàn)有的KOR激動(dòng)劑,并具有良好的腦血管保護(hù)作用,但其機(jī)制及腦血管的作用機(jī)制尚不明確〔6,7〕?；诖?通過建立缺血性腦卒中大鼠模型給予SA干預(yù),對其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑 選取40只健康SD大鼠,鼠齡6～10 w,體質(zhì)量200～261 g,平均(230.50±25.92)g,由江西中洪博元生物技術(shù)有限公司〔動(dòng)物許可證：(贛)2020-0001〕提供。飼養(yǎng)條件：溫度(24.00±0.85)℃,12 h循環(huán)光照,按需攝入水食,避免外界刺激。過氧化氫酶(CAT)、丙二醇(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司;單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、炎性細(xì)胞因子間黏附分子(ICAM)-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購自上海篤瑪生物技術(shù)有限公司;5-羥色胺(HT)ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技公司;基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)ELISA試劑盒購自江蘇艾博因生物科技有限公司。

1.2建模分組 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、小劑量組、高劑量組,每組各10只,正常組不給予任何處理,模型組、小劑量組、高劑量組采用線栓法制備腦缺血模型。將大鼠稱重后,按照0.1 ml/10 g腹腔注射4%水合氯醛麻醉,仰臥位固定大鼠,75%酒精常規(guī)消毒頸部,于頸部正中做1 cm左右切口,切開右頸部皮膚,分離,于根部結(jié)扎頸外動(dòng)脈,從右頸動(dòng)脈分叉下方3.5 mm左右處做一“V”形口,插入3 cm尼龍線,當(dāng)阻力出現(xiàn)時(shí)停止插入,此時(shí)尼龍線進(jìn)入頸動(dòng)脈約18 mm,待缺血90 min后緩慢抽出線栓,固定尼龍線并縫合皮膚,將大鼠放置于保溫棉墊上待其蘇醒后單籠飼養(yǎng)。采用Longa評分法〔8〕進(jìn)行神經(jīng)功能評分,1～4分大鼠視為缺血性腦卒中建模成功。

1.3干預(yù) 大鼠均建模成功,于建模成功后立即給予干預(yù),參考人與動(dòng)物體表面積等效劑量比值,計(jì)算大鼠給藥劑量,以1/2等效劑量為小劑量,2倍為高劑量。小劑量組腹部注射15 μg/kg SA,高劑量組腹部注射30 μg/kg SA,正常組、模型組注射等劑量0.9%生理鹽水,均連續(xù)給藥7 d。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 藥物干預(yù)7 d 后10%水合氯醛腹腔注射麻醉,心臟取血,離心處理5 min(轉(zhuǎn)速：3 000 r/min,離心半徑：12 cm),分離血漿,-20 ℃保存待檢。取血完成后,斷頭法處死大鼠,取出完整大腦,無菌分離腦組織,剪取部分腦組織制備勻漿液,將海馬組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定,24 h后脫水處理,石蠟包埋,切成4 μm切片,依次經(jīng)二甲苯、梯度酒精水化后,蘇木素浸染5 min,鹽酸乙醇分色,自來水沖洗,1%伊紅染色2～3 min,脫水、透明、封片,光鏡進(jìn)行觀察。

1.5神經(jīng)損傷評分、腦梗死體積 神經(jīng)損傷：于藥物干預(yù)后、取血前采用盲法記錄大鼠神經(jīng)功能損傷評分,參照Longa的五級4分法標(biāo)準(zhǔn),0分：無任何神經(jīng)功能損傷癥狀;1分：無法完全伸展對側(cè)前爪,存在輕微神經(jīng)功能損傷;2分：行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈,中度神經(jīng)功能損傷;3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒,重度神經(jīng)功能損傷;4分：無法自行行走或昏迷。梗死體積：利用氯化三基四氮唑(TTC)染色測定腦梗死體積,Longa評分后每組隨機(jī)抽取3只大鼠斷頭處死,取出腦組織,切除嗅球、小腦、低位腦干作2 mm層厚冠狀切片,將腦片置于5 ml含有2% TTC溶液中,37 ℃恒溫、避光孵育30 min。TTC染色后,正常腦組織呈紅色,梗死腦組織呈白色。應(yīng)用圖像分析軟件處理統(tǒng)計(jì),計(jì)算每張腦片梗死面積。梗死體積(%)=(腦片梗死面積×厚度2 mm)/總體積×100%。

1.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 CAT采用鉬酸銨微板法檢測,MDA采用血清膽汁酸測定(TBA)法檢測,SOD采用比色法檢測,嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行試驗(yàn),依次加入試劑盒中提供的試劑進(jìn)行反應(yīng),并檢測與說明相對應(yīng)的吸光度值。

1.7雙抗體夾心法檢測MCP-1、ICAM-1、5-HT、MMPs水平 檢測時(shí)酶標(biāo)板分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,每孔內(nèi)均加入50 μl稀釋液,空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔內(nèi)分別加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣片各 50 μl,輕晃均勻,酶標(biāo)板覆膜,室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后棄孔內(nèi)液體,甩干,采用洗滌液反復(fù)清洗反應(yīng)板。每孔內(nèi)加入MCP-1、ICAM-1、5-HT、MMP-9檢測液100 μl,重新覆膜,室溫孵育1 h,棄孔內(nèi)液體,甩干、洗滌反應(yīng)板,每孔內(nèi)加入100 μl底物溶液,室溫避光顯色30 min,加入50 μl終止液,輕彈酶標(biāo)板終止反應(yīng)。參照試劑盒說明書和儀器操作進(jìn)行。

1.8Western印跡檢測各組CD147蛋白表達(dá) 取出大鼠待測腦組織按1∶5加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗(CD147抗體,1∶1 000),過夜孵育。加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,1∶2 000),常溫孵育2 h,顯影、定影、沖洗、晾干,掃描膠片,采用ImageJ軟件分析CD147表達(dá),以β-actin為內(nèi)參,目標(biāo)蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)、獨(dú)立t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織病理 如圖1所示,正常組腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列緊密;模型組、小劑量組可見不同程度的神經(jīng)細(xì)胞水腫、壞死、間質(zhì)充血、神經(jīng)細(xì)胞周、樹突減少等腦缺血病理改變,可見大量炎性細(xì)胞浸潤情況;高劑量組存在輕微神經(jīng)細(xì)胞水腫、壞死等腦缺血病理變化。

圖1 各組腦組織病理(HE染色,×400)

2.2各組神經(jīng)功能損傷、腦梗死體積評估 如表1所示,相比模型組,小、高劑量組Longa評分、腦梗死體積較低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組Longa評分、腦梗死體積較低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組神經(jīng)功能損傷、腦梗死體積、腦組織氧化應(yīng)激水平比較

2.3各組腦組織氧化應(yīng)激水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、小劑量組、高劑量組CAT、SOD水平降低,MDA水平升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比模型組,小、高劑量組CAT、SOD水平較高,MDA水平較低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組CAT、SOD水平較高,MDA水平較低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組腦組織相關(guān)因子含量比較 如表2所示,與正常組相比,模型組、小劑量組、高劑量組MCP-1、ICAM-1含量升高,5-HT含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比模型組,小、高劑量組MCP-1、ICAM-1含量較低,5-HT含量較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組MCP-1、ICAM-1含量較低,5-HT含量較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組腦組織相關(guān)因子含量及CD147表達(dá)、血漿MMPs水平比較

2.5各組腦組織CD147表達(dá)、血漿MMPs水平比較 如表2、圖2所示,與正常組相比,模型組、小劑量組、高劑量組CD147、MMPs表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比模型組,小、高劑量組CD147、MMPs表達(dá)水平較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組CD147、MMPs表達(dá)水平較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組腦組織CD147蛋白表達(dá)

3 討 論

研究表明,腦缺血損傷是一個(gè)多因素、多細(xì)胞介導(dǎo)的復(fù)雜病理過程。當(dāng)腦缺血損傷發(fā)生時(shí),炎性因子釋放入血導(dǎo)致白細(xì)胞聚集在血管及腦組織內(nèi),激活免疫炎癥反應(yīng)參與腦組織保護(hù)過程〔9,10〕。本研究提示,SA對腦缺血腦卒中導(dǎo)致的腦損傷具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。SA作為植物提取有效物,是迄今唯一天然、非肽類特異性的κ阿片受體激動(dòng)劑〔11〕。既往研究表明,SA能夠有效擴(kuò)張腦血管,保留腦缺血損傷后腦血管的自動(dòng)調(diào)節(jié)能力〔12〕。相關(guān)研究表明,SA具有作用迅速而短暫、可控性強(qiáng),易穿透血腦屏障,安全性高等優(yōu)勢,在臨床治療中具有較好的應(yīng)用前景〔13〕。本研究結(jié)果證實(shí),SA可減輕腦缺血損傷造成的腦組織病理結(jié)構(gòu)改變,對腦缺血損傷產(chǎn)生良好的神經(jīng)保護(hù)作用。形成此結(jié)果的原因可能與SA可通過血腦屏障改善腦代謝,避免腦組織發(fā)生缺血損傷作用相關(guān)。

本研究指出,SA可提高腦缺血腦卒中大鼠CAT、SOD活性,減輕自由基損傷,改善微循環(huán)狀態(tài),保護(hù)損傷腦組織。研究證實(shí),氧化應(yīng)激作為缺血性腦卒中的主要病理機(jī)制。正常狀況下,CAT、SOD等多種抗氧化酶廣泛分布于體內(nèi),可有效清除體內(nèi)自由基代謝產(chǎn)物〔14,15〕。當(dāng)機(jī)體受到缺血缺氧等有害刺激后,腦組織產(chǎn)生大量自由基,并通過多途徑產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)加重腦損傷〔16〕。本研究結(jié)果提示,氧化應(yīng)激反應(yīng)參與腦缺血腦卒中的發(fā)生、發(fā)展SA的抗氧化應(yīng)激作用顯著。而炎癥反應(yīng)作為腦損傷的重要致病機(jī)制,在腦缺血腦卒中發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色〔17〕。研究表明,MCP-1在正常腦組織中表達(dá)極低,當(dāng)缺血、缺氧、損傷發(fā)生時(shí),腦內(nèi)多種細(xì)胞表達(dá),在引發(fā)炎性反應(yīng)的同時(shí)提高單核細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)及炎癥細(xì)胞因子生產(chǎn)。ICAM-1作為細(xì)胞間黏附分子,在腦缺血后腦損傷病理、生理過程中扮演重要角色〔18,19〕。而5-HT作為重要神經(jīng)遞質(zhì)因子,正常情況下通過調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)神經(jīng)纖維參與系列生理活動(dòng),并發(fā)揮重要作用〔20〕。相關(guān)研究指出,當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生時(shí),受神經(jīng)損傷影響,5-HT含量貯存及攝取功能明顯降低,從而影響神經(jīng)功能〔21〕。本研究結(jié)果表明,SA可有效抑制炎性細(xì)胞生成,減輕腦組織炎癥感應(yīng),提高腦組織中5-HT含量,發(fā)揮保護(hù)缺血腦組織作用。

本研究指出,SA對腦缺血腦卒中大鼠產(chǎn)生的良好神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制CD147-MMPs通路激活相關(guān)。CD147作為跨膜蛋白是MMPs上游誘導(dǎo)分子,可上調(diào)MMPs表達(dá)〔22〕。相關(guān)研究表明,CD147在缺血大鼠模型中呈增加趨勢,相應(yīng)的MMPs水平增高。同時(shí)CD147作為MMPs上游靶在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有參與〔23〕。既往研究表明,MMPs在腦缺血損傷發(fā)生時(shí)含量顯著增加。MMP-9作為MMPs主要因子,可介導(dǎo)晚期血腦屏障的不可逆損傷〔24〕。本研究結(jié)果提示,SA對腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制抑制CD147-MMPs通路激活相關(guān)。

綜上,SA減少神經(jīng)功能損傷評分,縮小梗死體積,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng),增加腦組織中5-HT含量,有助于腦組織神經(jīng)再生,發(fā)揮良好的神經(jīng)保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制CD147-MMPs通路激活相關(guān)。證實(shí)SA具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用,為神經(jīng)保護(hù)劑研究提供一定參考依據(jù)。